Peritonite stentata standardizzata Colon Ascendens nei ratti: un modello animale semplice e fattibile per indurre danno renale acuto settico

Il danno renale acuto (AKI) è una grave complicanza nei pazienti critici ed è correlato a un aumento della mortalità. Qui, presentiamo un modello in vivo affidabile e riproducibile per imitare l'AKI in condizioni infiammatorie che potrebbe contribuire alla comprensione della patogenesi dell'AKI settico.

L'AKI nei pazienti settici è associata a un aumento della mortalità e a scarsi risultati, nonostante i grandi sforzi per affinare la comprensione della sua fisiopatologia. Qui viene presentato un modello in vivo che combina un focus settico standardizzato per indurre l'AKI e una configurazione di terapia intensiva (ICU) per fornire un monitoraggio emodinamico avanzato e una terapia paragonabile alla sepsi umana. La sepsi è indotta dalla peritonite standardizzata dello stent del colon ascendens (sCASP). L'AKI viene studiata funzionalmente mediante la misurazione di campioni di sangue e urina, nonché istologicamente mediante la valutazione dei punteggi istopatologici. Inoltre, l'avanzato monitoraggio emodinamico e la possibilità di prelievi ripetuti di emogas consentono un'analisi differenziata della gravità della sepsi indotta.

Il metodo sCASP è un metodo standardizzato, affidabile e riproducibile per indurre l'AKI settica. La configurazione di terapia intensiva, il monitoraggio continuo dell'emodinamica e degli scambi gassosi, il basso tasso di mortalità e la possibilità di analisi dettagliate della funzione renale e delle menomazioni sono vantaggi di questa configurazione. Pertanto, il metodo descritto può fungere da nuovo standard per le indagini sperimentali sull'AKI settico.

La sepsi rimane ancora la principale causa di morte nelle unità di terapia intensiva (ICU) non cardiache con tassi di mortalità ≈ 30 - 50%^1,2,3. Un segno distintivo della sepsi grave e dello shock settico è il danno renale acuto che provoca un ulteriore aumento del tasso di mortalità quando è associato a disfunzioni d'organo a distanza come insufficienza cardiaca e respiratoria ^4,5,6. L'incidenza complessiva di AKI nei pazienti in terapia intensiva varia dal 20 al 50%⁷. Nonostante il ruolo fondamentale dell'AKI per quanto riguarda l'esito e la mortalità nella sepsi, il meccanismo patologico sottostante è ancora poco compreso.

Nel complesso ci sono i 3 componenti principali: infiammazione, danno tossico e cambiamenti emodinamici che contribuiscono allo sviluppo dell'AKI⁷. I cambiamenti emodinamici comprendono la riduzione del flusso sanguigno renale (RBF) e l'ischemia renale globale o regionale. In questo caso, va considerato che la sepsi può anche causare una compromissione del microcircolo renale a causa di ipotensione sistemica e/o rottura della barriera endoteliale⁸. Pertanto, lo studio dell'AKI settico dovrebbe sempre includere il monitoraggio emodinamico. Recenti studi in vivo sull'AKI hanno utilizzato principalmente modelli animali come il danno da ischemia-riperfusione renale o la nefrectomia bilaterale. Questi studi di solito hanno mostrato una mancanza di monitoraggio emodinamico e di terapia intensiva.

Lo studio di potenziali nuovi meccanismi patologici e terapie dell'AKI settico richiede un modello in vivo con un focus settico definito, una configurazione di terapia intensiva, un esito prevedibile e un danno d'organo 9,10,11,12. Qui, descriviamo un modello innovativo di roditore per AKI settico che soddisfa i requisiti menzionati in precedenza. L'AKI settica è indotta dalla peritonite standardizzata dello stent del colon ascendente (sCASP). Il modello sCASP utilizzato provoca una sepsi addominale a causa di una perdita fecale intestinale che porta all'invasione batterica e all'insufficienza multiorgano¹³. È stato dimostrato che i cambiamenti fisiopatologici dopo CASP sono simili a quelli della sepsi umana e quindi CASP rappresenta un modello clinicamente rilevante nella ricerca sulla sepsi^11,14.

Inoltre, nel protocollo sperimentale è stabilita una configurazione di terapia intensiva (ICU) che comprende un monitoraggio emodinamico avanzato e una terapia ICU. La configurazione dell'unità di terapia intensiva consente la rianimazione con fluidi, l'applicazione di analgesia per via endovenosa e l'analisi ripetitiva dei gas nel sangue. La funzione renale viene valutata misurando valori standard come la creatinina e la clearance dell'inulina e dell'acido p-amminoippurico (PAH). Ulteriori informazioni vengono fornite dai punteggi patoistologici dei tessuti e degli organi prelevati alla fine dell'esperimento. Il modello sCASP per indurre l'AKI settica è già stato valutato e ha rivelato nuove intuizioni nella patologia renale¹⁵. Un'ulteriore applicazione di questo protocollo presentato di seguito potrebbe aiutare a perfezionare la comprensione dell'AKI settica.

Tutte le procedure sugli animali sono state approvate dal Comitato per la cura e l'uso degli animali da laboratorio del distretto di Unterfranken, in Germania, ed eseguite secondo la Dichiarazione di Helsinki.

1. Preparazione chirurgica e installazione del monitoraggio invasivo e della medicazione continua

1. Anestetizzare i ratti Sprague-Dawley utilizzando l'isoflurano somministrato da un vaporizzatore di precisione a una concentrazione e una velocità di flusso approvate dall'ente di supervisione della ricerca animale dell'istituzione locale e/o dal team veterinario. Confermare un'adeguata profondità dell'anestesia osservando la frequenza respiratoria, che diventa più lenta e profonda, e verificare la mancata risposta dopo il pizzicamento della coda/punta. Radersi la gola e lo stomaco con un rasoio.
   Nota: Una massiccia riduzione della frequenza respiratoria può essere un indicatore di un sovradosaggio di anestesia e portare a bradipnea, ipotensione e infine alla morte.
2. Posiziona il ratto in posizione supina su un termoforo. Applicare un unguento veterinario sugli occhi per evitare che gli occhi si secchino. Mantenere un'adeguata profondità di anestesia utilizzando la concentrazione e la velocità di flusso dell'isoflurano in base al monitoraggio intraoperatorio del ratto e/o alle raccomandazioni dell'organo di supervisione della ricerca animale dell'istituzione locale e/o del team veterinario. Posiziona il ratto in posizione supina su un termoforo automatizzato.
   Nota: l'ipotermia e la lesione termica influenzano i parametri macro e microemodinamici e dovrebbero essere evitate per ottenere un risultato affidabile. Si consiglia di utilizzare un termoforo con meccanismo di controllo collegato al ratto tramite una sonda rettale flessibile per mantenere la temperatura corporea nell'intervallo fisiologico.
3. Dopo la disinfezione del collo e della gola con l'apposita soluzione disinfettante, incidere la pelle sulla gola medialmente con un bisturi e praticare un'incisione di circa 2 cm. Girate il ratto ed eseguite un'incisione di circa 1 cm con le forbici chirurgiche sul collo a circa 1 cm distale dell'occipite.
4. Rimetti il topo in posizione supina. Sezionare delicatamente la vena giugulare destra e l'arteria carotide sinistra con le forbici e i cotton fioc. Seziona i vasi dalle strutture vicine. Evitare un'eccessiva resistenza e prepararsi ulteriormente con movimenti di diffusione attenti.
   Nota: Mantenere i recipienti sempre umidi applicando soluzione fisiologica sterile preriscaldata.
5. Sezionare delicatamente e con movimenti di diffusione sottocutanea dai vasi al collo per ottenere una connessione tra le due incisioni. Inserire i morsetti in ogni tunnel formato.
6. Sciacquare la girella e i cateteri, provenienti dal dispositivo girevole con NaCl allo 0,9%. Inserire i cateteri in una molla in acciaio inossidabile.
   Nota: I cateteri devono essere lavati con cloruro di sodio prima di essere inseriti, poiché un'applicazione minima di aria può portare a morte improvvisa a causa di embolia gassosa.
7. Girare il ratto e bloccare i cateteri utilizzando i morsetti inseriti. Far scorrere i cateteri dal collo alla gola. Fissare la molla con un laccio a bottone di plastica a circa 1 cm distale dell'occipite con 6 suture singolari (es. 4/0) sul collo.
8. Metti di nuovo il ratto in posizione supina. Stendere fili di cotone di circa 4 cm distalmente e prossimalmente a ciascun recipiente preparato. Tagliare l'arteria prossimale con una micro-clip, solitamente utilizzata per il taglio di aneurismi subaracnoideai. In alternativa, lasciare la clip e fermare il flusso sanguigno arterioso stringendo uno dei fili.
9. Incidere l'arteria con una micro forbice chirurgica, tenere aperta l'incisione con un gancio in una mano e inserire il catetere arterioso nel vaso utilizzando una pinza con l'altra mano. Aprire la clip o il filo tirato, spingere il catetere di circa 1 cm in avanti nel vaso verso il cuore e fissarlo con nodi chirurgici utilizzando i fili di cotone posati.
10. Ripetere il passaggio 1.8 sulla vena giugulare e lasciare la clip, poiché la vena non è solida come l'arteria.
11. Dopo aver fissato entrambi i cateteri in linea retta nei vasi, chiudere la ferita sulla gola con punti di sutura.

2. Procedura sCASP

1. Mantieni il ratto in posizione supina, rade l'addome e disinfetta la regione addominale con le soluzioni disinfettanti appropriate.
   Nota: Utilizzare sempre la tecnica asettica.
2. Eseguire un'incisione della linea mediana addominale della pelle di circa 2 cm di lunghezza con forbici chirurgiche e successivamente di nuovo lungo la linea alba per aprire la caverna peritoneale.
3. Identificare il polo cecale ed estrarre delicatamente il cieco utilizzando dei cotton fioc.
4. Forare il colon ascendente a circa 2 cm distalmente dalla valvola ileocecale con una sutura (6/0) [sutura 1] sul lato anti-mesenterico e fissarlo con due nodi chirurgici. Evitare lesioni di eventuali vasi del colon.
5. Tagliare l'estremità distale - circa 1,5 cm - di un catetere di aspirazione da 10 FR. Tagliare questo pezzo di catetere con le forbici per formare un lembo rettangolare con una lunghezza di circa 0,5 cm. Preparare il lembo con una sutura (6/0) [sutura 2] al centro del lembo.
6. Metti il lembo sopra un ago da 14G e perfora il colon ascendente con l'ago dove è stata fissata la sutura¹⁵.
7. Inserire il tubo di plastica preparato nel colon sopra l'ago. Contemporaneamente rimuovere delicatamente l'ago. Posizionare il tubo in modo che il lembo si trovi all'esterno del colon e il resto del tubo all'interno del colon.
   1. Dopo l'esatto posizionamento del tubo di plastica, fissare il lembo con la sutura già esistente 2 cucendo la parete del colon e i nodi chirurgici. Evitare nuovamente qualsiasi lesione dei vasi del colon. Metti le estremità libere della sutura 1 attorno al resto del tubo di plastica che porta all'esterno del colon ed esegui 2 nodi chirurgici.
8. Latte le feci dal cieco verso lo stent del colon utilizzando cotton fioc fino a quando le feci non compaiono all'uscita dello stent.
9. Rimetti l'intestino tenue e il colon nella caverna addominale. In questo modo il tubo di plastica con le feci deve essere a contatto con il peritoneo. Lavare lo stent con 2 mL di NaCl allo 0,9% per distribuire le feci nella caverna peritoneale.
10. Chiudere la caverna addominale con una sutura continua (4/0) del peritoneo e successivamente con una sutura continua (4/0) della pelle.

3. Procedura postoperatoria

1. Ferma l'inalazione di isoflurano e rimetti il ratto nella sua gabbia.
2. Iniziare l'analgesia endovenosa attraverso la linea venosa utilizzando Fentanyl (2,0 μg/100 g di peso corporeo/ora).

4. Preparazione delle misurazioni il secondo giorno

1. 24 ore dopo la procedura sCASP, applicare 0,5-1,0 mg di midazolam per via endovenosa. Mantenere un'adeguata profondità di anestesia utilizzando la concentrazione e la velocità di flusso dell'isoflurano in base al monitoraggio intraoperatorio del ratto e/o alle raccomandazioni dell'organo di supervisione della ricerca animale dell'istituzione locale e/o del team veterinario.
2. Dopo aver disinfettato nuovamente con alcool e soluzione, eseguire una tracheotomia con il tubo di plastica di una cannula venosa da 14 G per fornire sufficiente ossigenazione e ventilazione.
   1. Pertanto, aprire la sutura sulla gola con le forbici chirurgiche e aprirla delicatamente dalla linea mediana alla trachea. Incidere la trachea verticalmente tra due cartilagini di una lunghezza di circa 2 mm con le forbici chirurgiche, quanto basta per inserire le forbici chirurgiche. Allargare l'incisione senza mezzi termini a circa la metà del diametro della trachea con le forbici. Inserire 1 cm di un tubo di plastica da 14 G e fissarlo con 2 punti di sutura. ¹⁶
      Nota: Se l'incisione della trachea è più grande della metà della circonferenza, i vasi che costeggiano la trachea possono essere danneggiati con conseguente grave emorragia, aspirazione di sangue o bradicardia letale.
   2. Iniziare la ventilazione meccanica con un ventilatore per roditori con un F_iO₂ di 0,28 e 0,7 Vol. % di isoflurano e iniziare l'anestesia endovenosa con midazolam (0,7 mg/100 g p.c./h) e fentanil (7 μg/100 g p.c./h). Eseguire le analisi dei gas ematici per garantire una ventilazione e un'ossigenazione sufficienti. Pertanto, prelevare circa 0,7 ml di sangue attraverso il catetere arterioso e misurarlo con un analizzatore di gas nel sangue.
      Nota: L'anestesia endovenosa deve iniziare solo se è stabilita la ventilazione controllata meccanicamente.
3. Dopo aver rasato e disinfettato in modo simile a 2.1, eseguire un'incisione longitudinale di 1 cm della pelle della gamba destra, 0,5 cm prossimale del ginocchio. Sezionare l'arteria dalle strutture vicine usando forbici chirurgiche e cotton fioc senza mezzi termini.
   Nota: Se l'arteria femorale è lacerata, è ancora possibile l'inserimento di un catetere in posizione prossimale. Pertanto, si consiglia di iniziare l'impianto il più distalmente possibile.
4. Inserire un catetere di termodiluizione nell'arteria femorale aprendo l'arteria con un gancio e inserendo il catetere con una pinza.
5. Iniziare a misurare la gittata cardiaca con il metodo della termodiluizione. Pertanto, infondere rapidamente e manualmente 1 mL di NaCl raffreddato tramite il catetere venoso dopo aver avviato la misurazione di un software di misurazione dell'indice cardiaco. Eseguire questa misurazione due volte.

5. Valutazione della funzionalità renale

1. Eseguire una laparotomia aprendo le suture della pelle e il peritoneo con le forbici. Incidere la vescica urinaria con le forbici chirurgiche quanto basta per cateterizzarla con un piccolo catetere di plastica. Dopo aver steso un filo di cotone di circa 7 cm intorno alla vescica, fissare il filo, fissare il catetere con dei nodi e infine raccogliere quanta più urina possibile attraverso il catetere.
2. Sciogliere la fluoresceina-isotiocianato-inulina (FITC-inulina) in NaCl allo 0,9% e il sale sodico (IPA) dell'acido p-amminoippurico in NaCl allo 0,9% per ottenere concentrazioni di 2 mg/mL di inulina, 5 mg/mL di IPA.
3. Applicare un bolo di una miscela di entrambe le sostanze di 75 μl e.v., seguito da un'infusione endovenosa costante di entrambe le sostanze con una velocità di 3,7 μl/h/300 g di peso corporeo.
4. Dopo aver raggiunto uno stato stazionario¹⁷ con l'infusione di FITC-Inulina e PAH raccogliere l'urina per 20 min. Prelevare campioni di sangue attraverso il catetere arterioso come descritto al punto 4.2.1 per quanto riguarda l'esecuzione di un'emogasanalisi.
5. Determinare le concentrazioni di inulina nelle urine e nel plasma mediante spettrometria a fluorescenza e misurare gli IPA mediante fotospettrometria utilizzando il metodo anthrone¹⁷.

6. Fine degli esperimenti

1. Sopprimere l'animale in base alle normative legali locali.
2. Prelevare quanto più sangue possibile attraverso il catetere arterioso utilizzando siringhe.
3. Prelevare l'intestino tenue e crasso tagliando la fissazione peritoneale del duodeno e del colon, estrarre alcune parti di questi utilizzando le forbici chirurgiche. Preparare e raccogliere i reni preparandoli retroperitoneali e rilasciarli della loro capsula grassa e tagliare l'uretere e i vasi attaccati. Eseguire una toracotomia e tagliare i polmoni e il cuore. Fissare tutti gli organi in formaldeide ed eseguire le colorazioni istologiche come precedentemente pubblicato. ^15,18

Come precedentemente pubblicato da Schick et ^al.8, dimostriamo i seguenti risultati.

Induzione della sepsi senza mortalità
Nel modello CASP, la sepsi è indotta da una continua fuoriuscita di batteri localizzati intraluminali del colon che risalgono nella cavità addominale con conseguente peritonite fecale e batteriemia. In questo modo, la dimensione...

La fisiopatologia dell'AKI settica rimane ancora sconosciuta nella sua complessità. La ricerca clinica e gli studi sui pazienti non consentiranno di acquisire nuove conoscenze rispetto ai cambiamenti istopatologici, ai disturbi del microcircolo o alle interazioni farmacologiche a livello cellulare¹⁵. In precedenza è stato ipotizzato che vi sia la necessità di nuovi modelli animali migliorati per studiare il danno renale acuto associato alla sepsi

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

M.A. Schick e N. Schlegel ricevettero finanziamenti dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) SCHL 1962/2-1 e SCHL 1962/4-1.