Standardisierte Colon ascendens Stent-Peritonitis bei Ratten - ein einfaches, praktikables Tiermodell zur Induktion einer septischen akuten Nierenschädigung

Das akute Nierenversagen (AKI) ist eine schwere Komplikation bei kritisch kranken Patienten und geht mit einer erhöhten Mortalität einher. In dieser Arbeit präsentieren wir ein zuverlässiges und reproduzierbares in vivo Modell zur Nachahmung von AKI unter entzündlichen Bedingungen, das zum Verständnis der Pathogenese der septischen AKI beitragen könnte.

AKI bei septischen Patienten ist mit einer erhöhten Mortalität und einem schlechten Outcome verbunden, trotz großer Anstrengungen, das Verständnis seiner Pathophysiologie zu verfeinern. Hier wird ein in vivo Modell vorgestellt, das einen standardisierten septischen Fokus zur Induktion von AKI und eine Intensivstation (ICU) kombiniert, um ein fortschrittliches hämodynamisches Monitoring und eine Therapie zu ermöglichen, die bei humaner Sepsis vergleichbar ist. Die Sepsis wird durch die standardisierte Colon ascendens Stent-Peritonitis (sCASP) induziert. Die AKI wird sowohl funktionell durch Messung von Blut- und Urinproben als auch histologisch durch Auswertung histopathologischer Scores untersucht. Darüber hinaus ermöglichen das fortschrittliche hämodynamische Monitoring und die Möglichkeit der wiederholten Blutgasentnahme eine differenzierte Analyse des Schweregrads der induzierten Sepsis.

Die sCASP-Methode ist eine standardisierte, zuverlässige und reproduzierbare Methode zur Induktion von septischer AKI. Das intensivmedizinische Setup, die kontinuierliche hämodynamische Überwachung und das Gasaustausch-Monitoring, die niedrige Mortalitätsrate sowie die Möglichkeit detaillierter Analysen der Nierenfunktion und -beeinträchtigungen sind Vorteile dieses Setups. Daher kann das beschriebene Verfahren als neuer Standard für experimentelle Untersuchungen der septischen AKI dienen.

Sepsis ist mit Sterblichkeitsraten von ≈ 30 bis 50 % nach wie vor die häufigste Todesursache auf nicht-kardiologischen Intensivstationen (ICU)^1,2,3. Ein Kennzeichen einer schweren Sepsis und eines septischen Schocks ist die akute Nierenschädigung, die zu einem weiteren Anstieg der Sterblichkeitsrate führt, wenn sie mit einer Fernorgandysfunktion wie Herz- und Atemversagen einhergeht ^4,5,6. Die Gesamtinzidenz von AKI bei Patienten auf der Intensivstation schwankt zwischen 20 und 50 %⁷. Trotz der zentralen Rolle der AKI für das Outcome und die Mortalität bei Sepsis ist der zugrundeliegende Pathomechanismus noch wenig verstanden.

Insgesamt gibt es die 3 Hauptkomponenten: Entzündung, toxische Schädigung und hämodynamische Veränderungen, die zur AKI-Entwicklung beitragen⁷. Zu den hämodynamischen Veränderungen gehören eine verminderte renale Durchblutung (RBF) und eine globale oder regionale renale Ischämie. Hierbei ist zu berücksichtigen, dass eine Sepsis auch zu einer Beeinträchtigung der renalen Mikrozirkulation aufgrund einer systemischen Hypotonie und/oder einer Störung der Endothelbarriere führen kann⁸. Daher sollte die Untersuchung der septischen AKI immer ein hämodynamisches Monitoring beinhalten. Neuere in vivo-Studien über AKI verwendeten hauptsächlich Tiermodelle, wie z. B. Nierenischämie-Reperfusionsschäden oder bilaterale Nephrektomie. Diese Studien zeigten in der Regel einen Mangel an hämodynamischer Überwachung und Intensivpflege.

Die Untersuchung potenzieller neuer Pathomechanismen und Therapien der septischen AKI erfordert ein in vivo Modell mit einem definierten septischen Schwerpunkt, einem intensivmedizinischen Aufbau, einem vorhersagbaren Outcome und einer Organverletzung 9,10,11,12. Hier beschreiben wir ein innovatives Nagetiermodell für septische AKI, das die zuvor genannten Anforderungen erfüllt. Die septische AKI wird durch eine standardisierte Colon ascendens Stent-Peritonitis (sCASP) induziert. Das verwendete sCASP-Modell verursacht eine abdominale Sepsis durch einen intestinalen Stuhlverlust, der zu einer bakteriellen Invasion und einem Multiorganversagen führt¹³. Es konnte gezeigt werden, dass pathophysiologische Veränderungen nach CASP denen bei humaner Sepsis ähneln und CASP somit ein klinisch relevantes Modell in der Sepsisforschung darstellt^11,14.

Darüber hinaus ist im experimentellen Protokoll ein intensivmedizinischer Aufbau etabliert, der ein erweitertes hämodynamisches Monitoring und eine Intensivtherapie umfasst. Die Einrichtung der Intensivstation ermöglicht die Wiederbelebung von Flüssigkeiten, die intravenöse Anwendung von Analgesie und die wiederholte Blutgasanalyse. Die Nierenfunktion wird durch Messung von Standardwerten wie Kreatinin und durch Inulin- und p-Aminohippuric-Säure-(PAH)-Clearance bewertet. Zusätzliche Informationen liefern pathohistologische Scores von entnommenem Gewebe und Organen am Ende des Experiments. Das sCASP-Modell zur Induktion septischer AKI ist bereits evaluiert und hat neue Erkenntnisse in der Nierenpathologie gewonnen¹⁵. Eine weitere Anwendung dieses Protokolls, das im Folgenden vorgestellt wird, könnte dazu beitragen, das Verständnis der septischen AKI zu verfeinern.

Alle tierexperimentellen Verfahren wurden vom Ausschuss für die Pflege und Verwendung von Versuchstieren des Landkreises Unterfranken, Deutschland, genehmigt und gemäß der Deklaration von Helsinki durchgeführt.

1. Chirurgische Vorbereitung und Installation von invasivem Monitoring und kontinuierlicher Medikation

1. Betäuben Sie Sprague-Dawley-Ratten mit Isofluran, das von einem Präzisionsverdampfer in einer Konzentration und Durchflussrate verabreicht wird, die von der örtlichen Institution für Tierversuche und/oder dem Veterinärteam genehmigt wurde. Bestätigen Sie eine ausreichende Anästhesietiefe, indem Sie die Atemfrequenz beobachten, die langsamer und tiefer wird, und stellen Sie sicher, dass Sie nach dem Einklemmen des Schwanzes/der Zehen nicht reagieren. Rasieren Sie Hals und Bauch mit einem Rasierer.
   Anmerkung: Eine massive Verringerung der Atemfrequenz kann ein Indikator für eine Überdosierung der Narkose sein und schließlich zu Bradypnoe, Hypotonie und schließlich zum Tod führen.
2. Lege die Ratte in Rückenlage auf ein Heizkissen. Tragen Sie Tierarztsalbe auf die Augen auf, um ein Austrocknen der Augen zu vermeiden. Aufrechterhaltung einer angemessenen Anästhesietiefe unter Verwendung der Isoflurankonzentration und der Flussrate auf der Grundlage der intraoperativen Überwachung von Ratten und/oder der Empfehlungen der Tierforschungsaufsichtsbehörde und/oder des Veterinärteams der örtlichen Institution. Legen Sie die Ratte in Rückenlage auf ein automatisches Heizkissen.
   Hinweis: Hypothermie und thermische Schädigung beeinflussen die makro- und mikrohämodynamischen Parameter und sollten vermieden werden, um ein zuverlässiges Ergebnis zu erzielen. Es wird empfohlen, ein Heizkissen mit Kontrollmechanismus zu verwenden, das über eine flexible rektale Sonde mit der Ratte verbunden ist, um die Körpertemperatur im physiologischen Bereich zu halten.
3. Nach der Desinfektion von Hals und Rachen mit der entsprechenden Desinfektionslösung schneiden Sie mit einem Skalpell die Haut am Hals medial ein und machen einen Schnitt von ca. 2 cm. Drehen Sie die Ratte und führen Sie einen Schnitt von ca. 1 cm mit einer chirurgischen Schere am Hals ca. 1 cm distal des Hinterhauptbeins durch.
4. Bringen Sie die Ratte wieder in Rückenlage. Präparieren Sie vorsichtig die rechte Halsvene und die linke Halsschlagader mit der Schere und Wattestäbchen. Zerlegen Sie die Gefäße von den benachbarten Strukturen. Vermeiden Sie zu viel Widerstand und bereiten Sie mit vorsichtigen Spreizbewegungen weiter vor.
   Anmerkung: Halten Sie die Gefäße immer feucht, indem Sie vorgewärmte sterile Kochsalzlösung auftragen.
5. Präparieren Sie vorsichtig und mit spreizenden Bewegungen subkutan von den Gefäßen zum Hals, um eine Verbindung zwischen den beiden Schnitten herzustellen. Setzen Sie Klemmen in jeden geformten Tunnel ein.
6. Spülen Sie den Wirbel und die Katheter, die von der Schwenkvorrichtung kommen, mit 0,9 % NaCl. Führen Sie die Katheter in eine Edelstahlfeder ein.
   Anmerkung: Die Katheter müssen vor dem Einführen mit Natriumchlorid gespült werden, da eine minimale Luftzufuhr zum plötzlichen Tod durch Luftembolie führen kann.
7. Drehen Sie die Ratte und klemmen Sie die Katheter mit den eingesetzten Klemmen ein. Schieben Sie die Katheter vom Hals in den Rachen. Fixieren Sie die Feder mit einem Kunststoff-Knopfband ca. 1 cm distal des Hinterhauptbehauptens mit 6 einzelnen Nähten (z.B. 4/0) am Hals.
8. Setze die Ratte wieder in Rückenlage. Legen Sie Baumwollfäden von ca. 4 cm distal und proximal zu jedem vorbereiteten Gefäß. Schneiden Sie die Arterie proximal mit einem Mikroclip ab, der normalerweise zum Clippen von Subarachnoidalaneurysmen verwendet wird. Alternativ können Sie den Clip belassen und den arteriellen Blutfluss stoppen, indem Sie einen der Fäden festziehen.
9. Mit einer chirurgischen Mikroschere die Arterie einschneiden, den Schnitt mit einem Haken in der einen Hand offen halten und mit der anderen Hand den arteriellen Katheter mit einer Pinzette in das Gefäß einführen. Öffnen Sie den Clip oder den gezogenen Faden, schieben Sie den Katheter ca. 1 cm nach vorne in das Gefäß in Richtung Herz und fixieren Sie ihn mit chirurgischen Knoten mit den verlegten Baumwollfäden.
10. Wiederholen Sie Schritt 1.8 an der Halsvene und lassen Sie den Clip, da die Vene nicht so fest ist wie die Arterie.
11. Nachdem Sie beide Katheter geradlinig in den Gefäßen fixiert haben, verschließen Sie die Wunde am Hals mit Nähten.

2. sCASP-Verfahren

1. Halten Sie die Ratte in Rückenlage, rasieren Sie den Bauch und desinfizieren Sie die Bauchregion mit den entsprechenden Desinfektionslösungen.
   Anmerkung: Verwenden Sie immer eine aseptische Technik.
2. Führen Sie mit einer chirurgischen Schere einen ca. 2 cm langen Bauchmittellinienschnitt der Haut durch und anschließend erneut entlang der Linea alba, um die Bauchhöhle zu öffnen.
3. Identifiziere den Blinddarmpol und ziehe den Blinddarm vorsichtig mit Wattestäbchen heraus.
4. Den Colon ascendens ca. 2 cm distal von der ileocaecalen Klappe mit einer Naht (6/0) [Naht 1] an der antimesenterialen Seite durchstechen und mit zwei chirurgischen Knoten fixieren. Vermeiden Sie Läsionen von Dickdarmgefäßen.
5. Schneiden Sie das distale Ende - ca. 1,5 cm - eines 10 FR Absaugkatheters ab. Schneiden Sie dieses Stück des Katheters mit der Schere zu einem rechteckigen Lappen mit einer Länge von ca. 0,5 cm ab. Bereiten Sie den Lappen mit einer Naht (6/0) [Naht 2] in der Mitte des Lappens vor.
6. Legen Sie den Lappen über eine 14G-Nadel und punktieren Sie den aufsteigenden Dickdarm mit der Nadel, an der Naht 15 fixiert war¹⁵.
7. Führen Sie den vorbereiteten Kunststoffschlauch über der Nadel in den Dickdarm ein. Entfernen Sie gleichzeitig vorsichtig die Nadel. Positionieren Sie den Schlauch so, dass der Lappen außerhalb des Dickdarms und der Rest des Schlauchs innerhalb des Dickdarms liegt.
   1. Nach exakter Positionierung des Kunststoffschlauchs fixieren Sie den Lappen mit der bereits vorhandenen Naht 2, indem Sie die Dickdarmwand und die chirurgischen Knoten vernähen. Vermeiden Sie erneut jede Läsion der Dickdarmgefäße. Legen Sie die freien Enden von Naht 1 um den Rest des Plastikschlauchs, der außerhalb des Dickdarms führt, und führen Sie 2 chirurgische Knoten durch.
8. Milchstuhl aus dem Blinddarm in Richtung Dickdarmstent mit Wattestäbchen, bis am Ausgang des Stents Stuhl erscheint.
9. Setzen Sie den Dünndarm und den Dickdarm wieder in die Bauchhöhle ein. Dabei sollte das Kunststoffrohr mit dem Stuhl in Kontakt mit dem Bauchfell kommen. Spülen Sie den Stent mit 2 mL 0,9 % NaCl, um den Kot in der Bauchhöhle zu verteilen.
10. Verschließen Sie die Bauchhöhle mit einer durchgehenden Naht (4/0) des Bauchfells und anschließend mit einer durchgehenden Naht (4/0) der Haut.

3. Postoperativer Eingriff

1. Stoppen Sie die Inhalation von Isofluran und setzen Sie die Ratte wieder in ihren Käfig.
2. Starten Sie die intravenöse Analgesie über den Venenzugang mit Fentanyl (2,0 μg/100 g Körpergewicht/h).

4. Vorbereitung der Messungen am zweiten Tag

1. 24 Stunden nach dem sCASP-Verfahren 0,5-1,0 mg Midazolam intravenös auftragen. Aufrechterhaltung einer angemessenen Anästhesietiefe unter Verwendung der Isoflurankonzentration und der Flussrate auf der Grundlage der intraoperativen Überwachung von Ratten und/oder der Empfehlungen der Tierforschungsaufsichtsbehörde und/oder des Veterinärteams der örtlichen Institution.
2. Nach erneuter Desinfektion mit Alkohol und Lösung führen Sie eine Tracheotomie mit dem Kunststoffschlauch einer 14-G-Venenkanüle durch, um eine ausreichende Sauerstoffversorgung und Beatmung zu gewährleisten.
   1. Öffnen Sie daher die Naht am Hals mit einer chirurgischen Schere und öffnen Sie sanft von der Mittellinie bis zur Luftröhre. Schneiden Sie die Luftröhre senkrecht zwischen zwei Knorpeln von einer Länge von ca. 2 mm mit einer chirurgischen Schere ein - gerade genug, um eine chirurgische Schere einzuführen. Weiten Sie den Schnitt mit der Schere stumpf auf etwa die Hälfte des Durchmessers der Luftröhre aus. Führen Sie 1 cm eines 14 G Kunststoffschlauchs ein und fixieren Sie ihn mit 2 Nähten. ¹⁶
      Anmerkung: Wenn der Schnitt der Luftröhre größer als die Hälfte des Umfangs ist, können die Gefäße, die entlang der Luftröhre verlaufen, geschädigt werden, was zu schweren Blutungen, Blutaspirationen oder tödlicher Bradykardie führt.
   2. Beginnen Sie die maschinelle Beatmung mit einem Nagetierbeatmungsgerät mit einem F_iO₂ von 0,28 und 0,7 Vol.-% Isofluran und beginnen Sie die intravenöse Anästhesie mit Midazolam (0,7 mg/100 g KG/h) und Fentanyl (7 μg/100 g KG/h). Führen Sie Blutgasanalysen durch, um eine ausreichende Belüftung und Sauerstoffversorgung zu gewährleisten. Entnehmen Sie daher ca. 0,7 mL Blut über den arteriellen Katheter und messen Sie diese mit einem Blutgasanalysator.
      Anmerkung: Die intravenöse Anästhesie sollte nur beginnen, wenn die mechanisch gesteuerte Beatmung etabliert ist.
3. Nachdem Sie sich auf ähnliche Weise wie in 2.1 rasiert und desinfiziert haben, führen Sie einen 1 cm langen Längsschnitt der Haut des rechten Beins 0,5 cm proximal des Knies durch. Präparieren Sie die Arterie mit einer chirurgischen Schere und Wattestäbchen stumpf von den benachbarten Strukturen.
   Anmerkung: Bei einem Riss der Oberschenkelarterie ist ein Anlegen des Katheters in proximaler Lage weiterhin möglich. Es wird daher empfohlen, die Implantation so weit wie möglich distal zu beginnen.
4. Führen Sie einen Thermodilutionskatheter in die Oberschenkelarterie ein, indem Sie die Arterie mit einem Haken öffnen und den Katheter mit einer Pinzette einführen.
5. Beginnen Sie mit der Messung des Herzzeitvolumens durch die Thermodilutionsmethode. Infusion von 1 mL gekühltem NaCl schnell manuell über den Venenkatheter, nachdem Sie die Messung einer Herzindex-Messsoftware gestartet haben. Führen Sie diese Messung zweimal durch.

5. Beurteilung der Nierenfunktion

1. Führen Sie eine Laparotomie durch, indem Sie die Nähte der Haut und des Bauchfells mit einer Schere öffnen. Schneiden Sie die Harnblase mit einer chirurgischen Schere gerade so weit, dass Sie sie mit einem kleinen Plastikkatheter katheterisieren können. Nachdem Sie einen Baumwollfaden von ca. 7 cm um die Blase gelegt haben, befestigen Sie den Faden, befestigen Sie den Katheter mit Knoten und sammeln Sie schließlich so viel Urin wie möglich über den Katheter.
2. Lösen Sie Fluorescein-Isothiocyanat-Inulin (FITC-Inulin) in 0,9 % NaCl und p-Aminohippursäure-Natriumsalz (PAK) in 0,9 % NaCl, um Konzentrationen von 2 mg/ml Inulin und 5 mg/ml PAK zu erhalten.
3. Wenden Sie einen Bolus aus einer Mischung beider Substanzen von 75 μl i.v. an, gefolgt von einer konstanten intravenösen Infusion beider Substanzen mit einer Rate von 3,7 μL/h/300 g KG.
4. Nachdem Sie mit der Infusion von FITC-Inulin und PAH einen Steady State¹⁷ erreicht haben, sammeln Sie den Urin für 20 min. Entnahme von Blutproben über den arteriellen Katheter wie unter 4.2.1 zur Durchführung einer Blutgasanalyse beschrieben.
5. Bestimmung der Inulinkonzentrationen des Urins und des Plasmas mittels Fluoreszenzspektrometrie und Messung der PAK durch Photospektrometrie unter Verwendung der Anthrone-Methode¹⁷.

6. Beendigung der Versuche

1. Euthanasieren Sie das Tier gemäß den örtlichen gesetzlichen Vorschriften.
2. Entnehmen Sie so viel Blut wie möglich über den arteriellen Katheter mit Spritzen.
3. Entnehmen Sie den Dünn- und Dickdarm, indem Sie die Peritonealfixation des Zwölffingerdarms und des Dickdarms durchtrennen, und entfernen Sie einige Teile davon mit einer chirurgischen Schere. Bereiten Sie die Nieren vor und ernten Sie sie, indem Sie retroperitoneale Nieren vorbereiten und sie von ihrer Fettkapsel befreien und den Harnleiter und die daran befestigten Gefäße durchschneiden. Führen Sie eine Thorakotomie durch und schneiden Sie die Lunge und das Herz heraus. Fixieren Sie alle Organe in Formaldehyd und führen Sie histologische Färbungen durch, wie zuvor veröffentlicht. ^15,18 kg

Wie bereits von Schick et ^al.8 veröffentlicht, zeigen wir die folgenden Ergebnisse.

Induktion einer Sepsis ohne Mortalität
Im CASP-Modell wird die Sepsis durch einen kontinuierlichen Austritt von intraluminal lokalisierten Bakterien des Dickdarms in die Bauchhöhle induziert, was zu einer fäkalen Peritonitis und Bakteriämie führt. Dabei reguliert ...

Die Pathophysiologie der septischen AKI ist in ihrer Komplexität noch unbekannt. Klinische Forschung und Studien an Patienten werden keine neuen Erkenntnisse in Bezug auf histopathologische Veränderungen, Mikrozirkulationsstörungen oder Arzneimittelwechselwirkungen auf zellulärer Ebene ermöglichen¹⁵. Es wurde bereits postuliert, dass es einen Bedarf an verbesserten und neuen Tiermodellen gibt, um akute Nierenschäden im Zusammenhang mit Sepsis

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

M.A. Schick und N. Schlegel wurden von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) SCHL 1962/2-1 und SCHL 1962/4-1 gefördert.