JoVE Logo

Entrar

É necessária uma assinatura da JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou comece sua avaliação gratuita.

Neste Artigo

  • Resumo
  • Resumo
  • Introdução
  • Protocolo
  • Resultados
  • Discussão
  • Divulgações
  • Agradecimentos
  • Materiais
  • Referências
  • Reimpressões e Permissões

Resumo

A lesão renal aguda (LRA) é uma complicação grave em pacientes críticos e está relacionada a um aumento da mortalidade. Aqui, apresentamos um modelo in vivo confiável e reprodutível para mimetizar LRA em condições inflamatórias que podem contribuir para a compreensão da patogênese da LRA séptica.

Resumo

A LRA em pacientes sépticos está associada ao aumento da mortalidade e desfecho desfavorável, apesar dos grandes esforços para refinar a compreensão de sua fisiopatologia. Aqui, é apresentado um modelo in vivo que combina um foco séptico padronizado para induzir LRA e uma configuração de terapia intensiva (UTI) para fornecer um monitoramento hemodinâmico avançado e terapia comparável na sepse humana. A sepse é induzida por peritonite padronizada do stent ascendente do cólon (sCASP). A LRA é investigada funcionalmente pela medição de amostras de sangue e urina, bem como histologicamente pela avaliação de escores histopatológicos. Além disso, a monitorização hemodinâmica avançada e a possibilidade de amostragem repetitiva de gasometria permitem uma análise diferenciada da gravidade da sepse induzida.

O método sCASP é um método padronizado, confiável e reprodutível para induzir LRA séptica. A configuração de terapia intensiva, o monitoramento hemodinâmico e de troca gasosa contínuo, a baixa taxa de mortalidade, bem como a oportunidade de análises detalhadas da função renal e comprometimentos são vantagens dessa configuração. Portanto, o método descrito pode servir como um novo padrão para investigações experimentais de LRA séptica.

Introdução

A sepse ainda continua sendo a principal causa de morte em unidades de terapia intensiva (UTI) não cardíacas, com taxas de mortalidade de ≈ 30 a 50%1,2,3. Uma característica marcante da sepse grave e do choque séptico é a lesão renal aguda que causa um aumento adicional da taxa de mortalidade quando associada a disfunção de órgãos distantes, como insuficiência cardíaca e respiratória 4,5,6. A incidência geral de LRA em pacientes de UTI varia de 20 a 50%7. Apesar do papel fundamental da LRA em relação ao desfecho e mortalidade na sepse, o mecanismo patológico subjacente ainda é pouco compreendido.

No geral, existem os 3 componentes principais: inflamação, lesão tóxica e alterações hemodinâmicas que contribuem para o desenvolvimento da LRA7. As alterações hemodinâmicas englobam redução do fluxo sanguíneo renal (RBF) e isquemia renal global ou regional. Aqui, deve-se considerar que a sepse também pode causar comprometimento da microcirculação renal devido à hipotensão sistêmica e/ou ruptura da barreira endotelial8. Portanto, o estudo da LRA séptica deve sempre incluir a monitorização hemodinâmica. Estudos in vivo recentes sobre LRA usaram principalmente modelos animais, como lesão renal de isquemia-reperfusão ou nefrectomia bilateral. Esses estudos geralmente mostraram falta de monitorização hemodinâmica e cuidados intensivos.

A investigação de potenciais novos mecanismos patológicos e terapias da LRA séptica requer um modelo in vivo com um foco séptico definido, uma configuração de terapia intensiva, um resultado previsível e uma lesão de órgão 9,10,11,12. Aqui, descrevemos um modelo inovador de roedor para LRA séptica que atende aos requisitos mencionados anteriormente. A LRA séptica é induzida por peritonite padronizada do stent ascendente do cólon (sCASP). O modelo sCASP utilizado causa sepse abdominal por vazamento fecal intestinal, levando à invasão bacteriana e falência de múltiplos órgãos13. Foi demonstrado que as alterações fisiopatológicas após a CASP são semelhantes às da sepse humana e, portanto, a CASP representa um modelo clinicamente relevante na pesquisa da sepse11,14.

Além disso, uma configuração de terapia intensiva (UTI) que compreende um monitoramento hemodinâmico avançado e terapia de UTI é estabelecida no protocolo experimental. A configuração da UTI permite ressuscitação fluídica, aplicação de analgesia por via intravenosa e análise repetitiva de gases sanguíneos. A função renal é avaliada pela medição de valores padrão, como creatinina, e pela depuração do ácido aminohipúrico (PAH) e da inulina. Informações adicionais são fornecidas por escores patohistológicos de tecidos e órgãos colhidos no final do experimento. O modelo sCASP para induzir LRA séptica já foi avaliado e revelou novos insights na patologia renal15. A aplicação adicional deste protocolo apresentado abaixo pode ajudar a refinar a compreensão da LRA séptica.

Protocolo

Todos os procedimentos em animais foram aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais de Laboratório do Distrito de Unterfranken, Alemanha, e realizados de acordo com a Declaração de Helsinque.

1. Preparo cirúrgico e instalação de monitorização invasiva e medicação contínua

  1. Anestesiar ratos Sprague-Dawley usando isoflurano administrado por vaporizador de precisão em uma concentração e vazão aprovadas pelo órgão de supervisão de pesquisa animal da instituição local e/ou equipe veterinária. Confirme a profundidade adequada da anestesia observando a frequência respiratória, que se torna mais lenta e profunda, e verifique a falta de resposta após o beliscão da cauda/dedo do pé. Raspe a garganta e o estômago com uma navalha.
    Nota: A redução maciça da frequência respiratória pode ser um indicador de uma overdose de anestesia e levar a bradipneia, hipotensão e, finalmente, morte.
  2. Coloque o rato em decúbito dorsal em uma almofada de aquecimento. Aplique pomada veterinária nos olhos para evitar que os olhos sequem. Manter a profundidade anestésica adequada usando concentração e vazão de isoflurano com base no monitoramento intraoperatório de ratos e/ou recomendações do órgão de supervisão de pesquisa animal e/ou equipe veterinária da instituição local. Coloque o rato em decúbito dorsal em uma almofada de aquecimento automatizada.
    Nota: A hipotermia e a lesão térmica influenciam os parâmetros macro e micro-hemodinâmicos e devem ser evitadas para obter um resultado confiável. Recomenda-se o uso de uma almofada de aquecimento com mecanismo de controle que é ligado ao rato por meio de uma sonda retal flexível para manter a temperatura corporal na faixa fisiológica.
  3. Após a desinfecção do pescoço e da garganta com a solução desinfetante apropriada, incisar a pele da garganta medial com um bisturi e fazer uma incisão de cerca de 2 cm. Vire o rato e faça uma incisão de cerca de 1 cm com tesoura cirúrgica no pescoço cerca de 1 cm distal do occipital.
  4. Coloque o rato de volta em decúbito dorsal. Disseque suavemente a veia jugular direita e a artéria carótida esquerda com a tesoura e os cotonetes. Disseque os vasos das estruturas vizinhas. Evite muito arrasto e prepare-se ainda mais com movimentos cuidadosos de espalhamento.
    Nota: Mantenha os vasos sempre úmidos pela aplicação de solução salina estéril pré-aquecida.
  5. Disseque suavemente e com movimentos de propagação subcutânea dos vasos até o pescoço para obter uma conexão entre as duas incisões. Insira grampos em cada túnel formado.
  6. Lave o giro e os cateteres, provenientes do dispositivo giratório com NaCl 0,9%. Insira os cateteres em uma mola de aço inoxidável.
    Nota: Os cateteres devem ser lavados com cloreto de sódio antes de serem inseridos, pois a aplicação mínima de ar pode levar à morte súbita devido à embolia gasosa.
  7. Vire o rato e prenda os cateteres usando as pinças inseridas. Deslize os cateteres do pescoço para a garganta. Fixe a mola com uma corda de botão de plástico cerca de 1 cm distal do occipital com 6 suturas singulares (por exemplo, 4/0) no pescoço.
  8. Coloque o rato novamente em decúbito dorsal. Coloque fios de algodão de cerca de 4 cm distais e proximais a cada recipiente preparado. Corte a artéria proximal com um microclipe, geralmente usado para clipagem de aneurismas subaracnoides. Como alternativa, deixe o clipe e interrompa o fluxo sanguíneo arterial apertando um dos fios.
  9. Incisar a artéria com uma microtesoura cirúrgica, manter a incisão aberta com um gancho em uma mão e inserir o cateter arterial no vaso usando uma pinça com a outra mão. Abra o clipe ou o fio puxado, empurre o cateter cerca de 1 cm para a frente no vaso em direção ao coração e fixe-o com nós cirúrgicos usando os fios de algodão colocados.
  10. Repita o passo 1.8 na veia jugular e deixe o clipe, pois a veia não é tão sólida quanto a artéria.
  11. Depois de fixar os dois cateteres em linha reta nos vasos, feche a ferida na garganta com suturas.

2. Procedimento sCASP

  1. Mantenha o rato em decúbito dorsal, raspe o abdômen e desinfete a região abdominal com as soluções de desinfecção apropriadas.
    Nota: Utilize sempre a técnica asséptica.
  2. Realizar uma incisão abdominal na linha média da pele de cerca de 2 cm de comprimento com tesoura cirúrgica e depois novamente ao longo da linha alba para abrir a caverna peritoneal.
  3. Identifique o pólo cecal e puxe o ceco suavemente usando cotonetes.
  4. Perfure o cólon ascendente cerca de 2 cm distal da válvula ileocecal com uma sutura (6/0) [sutura 1] no lado antimesentérico e fixe-o com dois nós cirúrgicos. Evite lesões de quaisquer vasos do cólon.
  5. Corte a extremidade distal - cerca de 1,5 cm - de um cateter de sucção de 10 FR. Corte este pedaço do cateter com a tesoura para formar uma aba retangular com um comprimento de cerca de 0,5 cm. Prepare o retalho com uma sutura (6/0) [sutura 2] no meio do retalho.
  6. Colocar o retalho sobre uma agulha 14G e puncionar o cólon ascendente com a agulha onde foi fixada a sutura15.
  7. Insira o tubo de plástico preparado no cólon sobre a agulha. Remova simultaneamente a agulha com cuidado. Posicione o tubo de forma que o retalho fique fora do cólon e o resto do tubo dentro do cólon.
    1. Após o posicionamento exato do tubo plástico, fixe o retalho com a sutura 2 já existente, costurando a parede do cólon e os nós cirúrgicos. Evite novamente qualquer lesão dos vasos do cólon. Coloque as extremidades livres da sutura 1 ao redor do resto do tubo de plástico que sai do cólon e faça 2 nós cirúrgicos.
  8. Ordenhe as fezes do ceco em direção ao stent colônico usando cotonetes até que as fezes apareçam na saída do stent.
  9. Coloque o intestino delgado e o cólon de volta na caverna abdominal. Assim, o tubo de plástico com as fezes deve estar em contato com o peritônio. Lave o stent com 2 mL de NaCl a 0,9% para distribuir as fezes na caverna peritoneal.
  10. Feche a caverna abdominal com uma sutura contínua (4/0) do peritônio e depois com uma sutura contínua (4/0) da pele.

3. Procedimento pós-operatório

  1. Pare a inalação de isoflurano e coloque o rato de volta em sua gaiola.
  2. Inicie a analgesia intravenosa através da linha venosa usando fentanil (2,0 μg / 100 g de peso corporal / h).

4. Preparando as medições no segundo dia

  1. 24 h após o procedimento sCASP, aplicar 0,5-1,0 mg de midazolam por via intravenosa. Manter a profundidade anestésica adequada usando concentração e vazão de isoflurano com base no monitoramento intraoperatório de ratos e/ou recomendações do órgão de supervisão de pesquisa animal e/ou equipe veterinária da instituição local.
  2. Depois de desinfetar novamente com álcool e solução, realizar uma traqueostomia com o tubo de plástico de uma cânula venosa de 14 G para fornecer oxigenação e ventilação suficientes.
    1. Portanto, abra a sutura na garganta com uma tesoura cirúrgica e abra suavemente da linha média até a traqueia. Incise a traqueia verticalmente entre duas cartilagens de cerca de 2 mm de comprimento com uma tesoura cirúrgica - apenas o suficiente para inserir uma tesoura cirúrgica. Alargue a incisão sem rodeios até cerca de metade do diâmetro da traqueia com a tesoura. Insira 1 cm de um tubo de plástico de 14 G e fixe-o com 2 suturas. 16
      Nota: Se a incisão da traqueia for maior que a metade da circunferência, os vasos que acompanham a traqueia podem ser prejudicados, resultando em hemorragia grave, aspiração de sangue ou bradicardia letal.
    2. Iniciar ventilação mecânica com ventilador de roedores com FiO2 de 0,28 e 0,7 Vol. % isoflurano e iniciar anestesia venosa com midazolam (0,7 mg/100 g PV/h) e fentanil (7 μg/100 g PV/h). Realize análises de gases sanguíneos para garantir ventilação e oxigenação suficientes. Portanto, retire cerca de 0,7 mL de sangue através do cateter arterial e meça-o com um analisador de gases sanguíneos.
      Nota: A anestesia intravenosa deve ser iniciada apenas se a ventilação controlada mecanicamente for estabelecida.
  3. Depois de ter sido barbeado e desinfetado de maneira semelhante à do item 2.1, fazer uma incisão longitudinal de 1 cm na pele da perna direita, 0,5 cm proximal do joelho. Disseque a artéria das estruturas vizinhas usando tesouras cirúrgicas e cotonetes sem rodeios.
    Nota: Se a artéria femoral for rompida, ainda é possível a inserção do cateter em posição proximal. Assim, recomenda-se iniciar o implante o mais distal possível.
  4. Insira um cateter de termodiluição na artéria femoral abrindo a artéria com um gancho e inserindo o cateter com uma pinça.
  5. Comece a medir o débito cardíaco pelo método de termodiluição. Portanto, infundir 1 mL de NaCl resfriado rapidamente manualmente através do cateter venoso após ter iniciado a medição de um software de medição do índice cardíaco. Efetue esta medição duas vezes.

5. Avaliação da função renal

  1. Realize uma laparotomia abrindo as suturas da pele e do peritônio com uma tesoura. Incise a bexiga urinária com uma tesoura cirúrgica apenas o suficiente para cateterizá-la com um pequeno cateter de plástico. Depois de colocar um fio de algodão de cerca de 7 cm ao redor da bexiga, prenda o fio, fixe o cateter com nós e, finalmente, colete o máximo de urina possível através do cateter.
  2. Dissolva a fluoresceína-isotiocianato-inulina (FITC-inulina) em NaCl a 0,9% e o sal de sódio (PAH) do ácido p-aminohipúrico em NaCl a 0,9% para obter concentrações de 2 mg/mL de inulina, 5 mg/mL de PAH.
  3. Aplicar um bolus de uma mistura de ambas as substâncias de 75 μL i.v., seguido de infusão intravenosa constante de ambas as substâncias com uma taxa de 3,7 μL / h / 300 g BW.
  4. Depois de ter atingido um estado estacionário17 com a infusão de FITC-Inulina e PAH coletar a urina por 20 min. Colher amostras de sangue através do cateter arterial, conforme descrito no ponto 4.2.1, para a realização de uma gasometria.
  5. Determinar as concentrações de inulina na urina e no plasma por espectrometria de fluorescência e medir o PAH por fotoespectrometria utilizando o método da antrona17.

6. Fim das experiências

  1. Eutanásia do animal de acordo com os regulamentos legais locais.
  2. Retire o máximo de sangue possível através do cateter arterial usando seringas.
  3. Colha o intestino delgado e grosso cortando a fixação peritoneal do duodeno e do cólon, retire algumas partes deles usando uma tesoura cirúrgica. Prepare e colha os rins preparando retroperitoneal e libere-os de sua cápsula gordurosa e corte o ureter e os vasos anexos. Faça uma toracotomia e corte os pulmões e o coração. Fixe todos os órgãos em formaldeído e faça colorações histológicas conforme publicado anteriormente. 15,18

Resultados

Conforme publicado anteriormente por Schick et al.8, demonstramos os seguintes resultados.

Indução de sepse sem mortalidade
No modelo CASP, a sepse é induzida por um vazamento contínuo de bactérias localizadas intraluminais do cólon ascendendo para a cavidade abdominal, resultando em peritonite fecal e bacteremia. Assim, o tamanho do cateter impl...

Discussão

A fisiopatologia da LRA séptica ainda permanece desconhecida em sua complexidade. Pesquisas clínicas e ensaios clínicos em pacientes não permitirão obter novos insights com relação a alterações histopatológicas, distúrbios da microcirculação ou interações medicamentosas em níveis celulares15. Foi postulado anteriormente que há necessidade de modelos animais novos e aprimorados para investigar a lesão renal aguda associada à sepse

Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

M.A. Schick e N. Schlegel receberam financiamento da Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) SCHL 1962/2-1 e SCHL 1962/4-1.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
Sprague-Dawley ratsJanvier Labs, France
 Isoflurane CPcp-pharma, Burgdorf, Germany
polyethylen catheter PE 10; 30mA. Hartenstein, Wuerzburg, Germany0.58x0.96 mm
Swivel (375/D/20)Instech, Plymouth Meeting, PA, USA(375/D/20)
plastic button tethersInstech, Plymouth Meeting, PA, USALW105S
PerfusorB. Braun; Melsungen, GermanyPerfusor fm
suction catheter ch. 10B.Braun Melsungen AG, Germanysuction catheter typy „Ideal“; ch. 10
sutureSyneture; USASurgipro; Monofilament Polypropylen 4-0
sutureEthicon; ScotlandProlene; Polypropylen 5-0
14G-i.v. catheterBD Insynte; BD Vialon; Madrid; Spain14GA i.v. catheter
cotton budsNOBA Verbandmittel Danz GmbH u Co KG; Wetter; Germany
rodent respiratorHugo Sachs Elektronik KG, Germanyrodent respirator, Type:7025
MidazolamRatiopharm, GermanyMidazolam
ThermodilutioncatheterADInstruments, Spechbach, Germany
p-Aminohippuric acidSigma-Aldrich; St. Louis; USAp-Aminohippuric acid sodium salt; A3759-25G
InulinSigma-Aldrich; St. Louis; USAInulin-FITC; F3272-1G
FormaldehydeOtto Fischar GmbH & CoKG; Saarbrücken, GermanyFormaldehyde 3.5%
CyclopentanMerck; Darmstadt; GermanyUvasol: 2-Methylbutan
alcohol based scrubSchülke & Mayr GmbH, Norderstedt; Germanykodan Tinktur forte; 45g 2-Propanol, 10g 1-Propanol per 100g
povidone iodine solutionB.Braun Melsungen AG, GermanyBraunol, 7.5g Povidone Iodine per 100g

Referências

  1. Angus, D. C., et al. Epidemiology of severe sepsis in the United States: analysis of incidence, outcome, and associated costs of care. Crit Care Med. 29, 1303-1310 (2001).
  2. Dellinger, R. P., et al. Surviving sepsis campaign: international guidelines for management of severe sepsis and septic shock: 2012. Crit Care Med. 41, 580-637 (2013).
  3. Moerer, O., Quintel, M. [Sepsis in adult patients - definitions, epidemiology and economic aspects]. Internist (Berl). 50, 788-796 (2009).
  4. Belayev, L. Y., Palevsky, P. M. The link between acute kidney injury and chronic kidney disease. Curr Opin Nephrol Hypertens. 23, 149-154 (2014).
  5. Chao, C. T., et al. The impact of dialysis-requiring acute kidney injury on long-term prognosis of patients requiring prolonged mechanical ventilation: nationwide population-based study. PLoS One. 7, e50675 (2012).
  6. Chertow, G. M., Christiansen, C. L., Cleary, P. D., Munro, C., Lazarus, J. M. Prognostic stratification in critically ill patients with acute renal failure requiring dialysis. Arch Intern Med. 155, 1505-1511 (1995).
  7. Doi, K. Role of kidney injury in sepsis. J Intensive Care. 4, 17 (2016).
  8. Gomez, H., et al. A unified theory of sepsis-induced acute kidney injury: inflammation, microcirculatory dysfunction, bioenergetics, and the tubular cell adaptation to injury. Shock. 41, 3-11 (2014).
  9. Deitch, E. A. Animal models of sepsis and shock: a review and lessons learned. Shock. 9, 1-11 (1998).
  10. Esmon, C. T. Why do animal models (sometimes) fail to mimic human sepsis?. Crit Care Med. 32, S219-S222 (2004).
  11. Rittirsch, D., Hoesel, L. M., Ward, P. A. The disconnect between animal models of sepsis and human sepsis. J Leukoc Biol. 81, 137-143 (2007).
  12. Doi, K., Leelahavanichkul, A., Yuen, P. S., Star, R. A. Animal models of sepsis and sepsis-induced kidney injury. J Clin Invest. 119, 2868-2878 (2009).
  13. Zantl, N., et al. Essential role of gamma interferon in survival of colon ascendens stent peritonitis, a novel murine model of abdominal sepsis. Infect Immun. 66, 2300-2309 (1998).
  14. Maier, S., et al. Cecal ligation and puncture versus colon ascendens stent peritonitis: two distinct animal models for polymicrobial sepsis. Shock. 21, 505-511 (2004).
  15. Schick, M. A., et al. Sepsis-induced acute kidney injury by standardized colon ascendens stent peritonitis in rats - a simple, reproducible animal model. Intensive Care Med Exp. 2, (2014).
  16. Schick, M. A., et al. Effects of crystalloids and colloids on liver and intestine microcirculation and function in cecal ligation and puncture induced septic rodents. BMC Gastroenterol. 12, 179 (2012).
  17. Schneider, R., et al. Downregulation of organic anion transporters OAT1 and OAT3 correlates with impaired secretion of para-aminohippurate after ischemic acute renal failure in rats. Am J Physiol Renal Physiol. 292, F1599-F1605 (2007).
  18. Schick, M. A., et al. The impact of crystalloid and colloid infusion on the kidney in rodent sepsis. Intensive Care Med. 36, 541-548 (2010).
  19. Bellomo, R., Ronco, C., Kellum, J. A., Mehta, R. L., Palevsky, P. Acute renal failure - definition, outcome measures, animal models, fluid therapy and information technology needs the Second International Consensus Conference of the Acute Dialysis Quality Initiative (ADQI) Group. Crit Care. 8, R204-R212 (2004).
  20. Lustig, M. K., et al. Colon ascendens stent peritonitis--a model of sepsis adopted to the rat: physiological, microcirculatory and laboratory changes. Shock. 28, 59-64 (2007).
  21. Traeger, T., et al. Colon ascendens stent peritonitis (CASP)--a standardized model for polymicrobial abdominal sepsis. J Vis Exp : JoVE. , (2010).
  22. Dyson, A., Rudiger, A., Singer, M. Temporal changes in tissue cardiorespiratory function during faecal peritonitis. Intensive Care Med. 37, 1192-1200 (2011).
  23. Arakelyan, K., et al. Early effects of an x-ray contrast medium on renal T(2) */T(2) MRI as compared to short-term hyperoxia, hypoxia and aortic occlusion in rats. Acta physiol. 208 (2), 202-213 (2013).
  24. Schick, M. A., et al. Balanced hydroxyethylstarch (HES 130/0.4) impairs kidney function in-vivo without Inflammation. PLoS One. 10 (9), e0137247 (2015).
  25. Flemming, S., et al. Phosphodiesterase 4 inhibition dose dependently stabilizes microvascular barrier functions and microcirculation in a rodent model of polymicrobial sepsis. Shock. 41, 537-545 (2014).
  26. Flemming, S., et al. Sphingosine-1-phosphate receptor-1 agonist sew2871 causes severe cardiac side effects and does not improve microvascular barrier breakdown in sepsis. Shock. 49 (1), 71-81 (2018).

Reimpressões e Permissões

Solicitar permissão para reutilizar o texto ou figuras deste artigo JoVE

Solicitar Permissão

Explore Mais Artigos

Palavras chave Les o Renal Aguda S pticaPeritonite do Stent Ascendente do C lonModelo AnimalMonitoriza o Hemodin micaTerapia IntensivaFun o Renal

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacidade

Termos de uso

Políticas

Pesquisa

Educação

SOBRE A JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Todos os direitos reservados