Стандартизированный стент-перитонит толстой кишки у крыс - простая, но осуществимая животная модель для индуцирования септического острого повреждения почек

Острое повреждение почек (ОПП) является тяжелым осложнением у пациентов в критическом состоянии и связано с повышенной смертностью. В данной работе мы представляем надежную и воспроизводимую in vivo модель для имитации ОПП в воспалительных условиях, которая может способствовать пониманию патогенеза септического ОПП.

ОПП у пациентов с сепсисом связано с повышенной смертностью и плохим исходом, несмотря на значительные усилия по уточнению понимания его патофизиологии. Здесь представлена модель in vivo , которая сочетает в себе стандартизированный септический очаг для индукции ОПП и установку интенсивной терапии (ОИТ) для обеспечения расширенного гемодинамического мониторинга и терапии, сравнимой с сепсисом человека. Сепсис вызывается стандартизированным стент-перитонитом восходящей толстой кишки (sCASP). ОПП исследуется функционально путем измерения образцов крови и мочи, а также гистологически путем оценки гистопатологических показателей. Кроме того, усовершенствованный гемодинамический мониторинг и возможность повторного отбора проб газов крови позволяют проводить дифференцированный анализ тяжести индуцированного сепсиса.

Метод sCASP является стандартизированным, надежным и воспроизводимым методом индуцирования септического ОПП. Преимуществами этой установки являются интенсивная терапия, непрерывный мониторинг гемодинамики и газообмена, низкий уровень смертности, а также возможность детального анализа функции почек и нарушений. Таким образом, описанный метод может служить новым стандартом для экспериментальных исследований септического ОПП.

Сепсис по-прежнему остается основной причиной смерти в отделениях интенсивной терапии (ОИТ), не относящихся к кардиологии, со смертностью ≈ 30 - 50%^1,2,3. Отличительной чертой тяжелого сепсиса и септического шока является острое повреждение почек, которое вызывает дальнейшее увеличение смертности, когда оно связано с дисфункцией отдаленных органов, такой как сердечная и дыхательная недостаточность ^4,5,6. Общая частота ОПП у пациентов ОРИТ варьирует от 20 до 50%⁷. Несмотря на ключевую роль ОПП в отношении исхода и смертности при сепсисе, лежащий в его основе патомеханизм до сих пор плохо изучен.

В целом, существует 3 основных компонента: воспаление, токсическое повреждение и гемодинамические изменения, которые^{способствуют развитию} ОПП. Гемодинамические изменения включают снижение почечного кровотока (RBF) и глобальную или регионарную ишемию почек. При этом следует учитывать, что сепсис также может вызывать нарушение почечной микроциркуляции из-за системной гипотензии и/или нарушения эндотелиального барьера⁸. Поэтому исследование септического ОПП всегда должно включать в себя мониторинг гемодинамики. В недавних исследованиях in vivo об ОПП использовались в основном животные модели, такие как ишемия-реперфузионное повреждение почек или двусторонняя нефрэктомия. Эти исследования обычно показывали отсутствие гемодинамического мониторинга и интенсивной терапии.

Исследование потенциальных новых патомеханизмов и методов лечения септического ОПП требует модели in vivo с определенным септическим очагом, организацией интенсивной терапии, предсказуемым исходом и повреждением органов 9,10,11,12. Здесь мы опишем инновационную модель грызуна для септического ОПП, которая соответствует требованиям, упомянутым ранее. Септическое ОПП индуцируется стандартизированным стент-перитонитом восходящей толстой кишки (sCASP). Используемая модель sCASP вызывает абдоминальный сепсис за счет утечки кала из кишечника, что приводит к бактериальной инвазии и полиорганной недостаточности13. Было показано, что патофизиологические изменения после CASP аналогичны таковым при сепсисе человека, и, таким образом, CASP представляет собой клинически значимую модель в исследованиях сепсиса^11,14.

Кроме того, в экспериментальном протоколе предусмотрена система интенсивной терапии (ОИТ), которая включает в себя расширенный гемодинамический мониторинг и терапию ОИТ. Система интенсивной терапии позволяет проводить реанимацию жидкости, внутривенное введение анальгезии и повторный анализ газов крови. Функция почек оценивается путем измерения стандартных значений, таких как креатинин, и клиренса инулина и-аминогиппуриновой кислоты (ПАУ). Дополнительная информация предоставляется патогистологическими показателями собранных тканей и органов в конце эксперимента. Модель sCASP для индуцирования септического ОПП уже оценена и позволила получить новые сведения о почечной патологии¹⁵. Дальнейшее применение данного протокола, представленного ниже, может помочь уточнить понимание септического ОПП.

Все процедуры на животных были одобрены Комитетом по уходу за лабораторными животными и их использованию округа Унтерфранкен, Германия, и проводились в соответствии с Хельсинкской декларацией.

1. Хирургическая подготовка и установка инвазивного мониторинга и непрерывного приема лекарств

1. Обезболите крыс Спрэг-Доули с помощью изофлурана, доставляемого прецизионным испарителем в концентрации и скорости потока, утвержденных органом по надзору за исследованиями на животных и/или ветеринарной командой местного учреждения. Подтвердите достаточную глубину анестезии, наблюдая за частотой дыхания, которая становится медленнее и глубже, и убедитесь в отсутствии реакции после защемления хвоста/пальца ноги. Побрейте горло и живот бритвой.
   Заметка: Массивное снижение частоты дыхания может быть индикатором передозировки анестезии и привести к брадипно, гипотензии и в конечном итоге к смерти.
2. Положите крысу в лежачем положении на грелку. Наносите ветеринарную мазь на глаза, чтобы избежать пересыхания глаз. Поддерживайте надлежащую глубину анестезии с использованием концентрации изофлурана и скорости потока на основе интраоперационного мониторинга крыс и/или рекомендаций органа по надзору за исследованиями на животных и/или ветеринарной бригады местного учреждения. Поместите крысу в лежачем положении на автоматизированную грелку.
   Примечание: Гипотермия и термическая травма влияют на макро- и микрогемодинамические показатели, и их следует избегать для получения надежного результата. Рекомендуется использовать грелку с механизмом управления, которая связана с крысой через гибкий ректальный зонд для поддержания температуры тела в физиологическом диапазоне.
3. После дезинфекции шеи и горла соответствующим дезинфицирующим раствором надрезайте скальпелем кожу на горле медиально и сделайте надрез около 2 см. Переверните крысу и выполните разрез около 1 см хирургическими ножницами на шее примерно в 1 см дистальнее затылка.
4. Верните крысу обратно в лежачее положение. Аккуратно рассеките правую яремную вену и левую сонную артерию ножницами и ватными палочками. Отделите сосуды от соседних конструкций. Избегайте слишком большого сопротивления и готовьтесь дальше, осторожно распределяя движения.
   Заметка: Поддерживайте сосуды всегда влажными с помощью предварительно подогретого стерильного физиологического раствора.
5. Аккуратно и раскидистыми движениями подкожно рассекайте от сосудов к шее, чтобы получить соединение между двумя разрезами. Вставьте хомуты в каждый сформированный тоннель.
6. Промойте вертлюг и катетеры, поступающие из вертлюжного устройства, 0,9% NaCl. Вставьте катетеры в пружину из нержавеющей стали.
   Заметка: Перед введением катетеры должны быть промыты хлоридом натрия, так как минимальное применение воздуха может привести к внезапной смерти из-за воздушной эмболии.
7. Переверните крысу и зажмите катетеры с помощью вставленных зажимов. Сдвиньте катетеры с горловины на горло. Зафиксируйте пружину пластиковым кнопочным ремнем примерно на 1 см дистальнее затылка 6 одиночными швами (например, 4/0) на шее.
8. Снова поставьте крысу в положение лежа на спине. Проложите хлопчатобумажные нити примерно на 4 см дистальнее и проксимальнее каждого подготовленного сосуда. Клипируйте артерию проксимальнее с помощью микроклипса, обычно используемого для клипирования субарахноидальных аневризм. В качестве альтернативы можно оставить зажим и остановить артериальный кровоток, затянув одну из нитей.
9. Надрежьте артерию хирургическими микроножницами, держите разрез открытым с помощью крючка в одной руке и введите артериальный катетер в сосуд с помощью щипцов другой рукой. Откройте зажим или натянутую нить, протолкните катетер примерно на 1 см вперед в сосуд по направлению к сердцу и зафиксируйте его хирургическими узлами с помощью проложенных хлопчатобумажных нитей.
10. Повторите шаг 1.8 на яремной вене и оставьте зажим, так как вена не такая твердая, как артерия.
11. Зафиксировав оба катетера по прямой линии в сосудах, закройте рану на горле швами.

2. Процедура sCASP

1. Держите крысу в лежачем положении, побрейте живот и продезинфицируйте брюшную область соответствующими дезинфицирующими растворами.
   Заметка: Всегда используйте асептическую технику.
2. Хирургическими ножницами выполните разрез кожи по средней линии живота длиной около 2 см, а затем снова по белой линии, чтобы открыть брюшинную каверну.
3. Определите полюс слепой кишки и аккуратно вытяните слепую кишку с помощью ватных палочек.
4. Проколите восходящую ободочную кишку примерно на 2 см дистальнее илеоцекального клапана швом (6/0) [шов 1] на противобрыжеечной стороне и зафиксируйте его двумя хирургическими узлами. Избегайте поражения любых сосудов толстой кишки.
5. Отрежьте дистальный конец - около 1,5 см - отсасывающего катетера 10 FR. Отрежьте этот кусочек катетера ножницами так, чтобы получился прямоугольный лоскут длиной около 0,5 см. Подготовьте лоскут с помощью шва (6/0) [шов 2] в середине лоскута.
6. Наденьте лоскут на иглу 14G и проколите восходящую ободочную кишку иглой, где был зафиксирован шов¹⁵.
7. Вставьте подготовленную пластиковую трубку в толстую кишку над иглой. Одновременно аккуратно извлеките иглу. Расположите трубку таким образом, чтобы лоскут находился снаружи толстой кишки, а остальная часть трубки — внутри толстой кишки.
   1. После точного позиционирования пластиковой трубки зафиксируйте лоскут уже имеющимся швом 2 путем сшивания стенки толстой кишки и хирургических узлов. Избегайте повторного поражения сосудов толстой кишки. Наложите свободные концы шовной нити 1 вокруг остальной части пластиковой трубки, которая выходит из толстой кишки, и выполните 2 хирургических узла.
8. Молочный стул из слепой кишки по направлению к стенту толстой кишки с помощью ватных палочек до тех пор, пока стул не появится на выходе из стента.
9. Поместите тонкую кишку и толстую кишку обратно в брюшную каверну. При этом пластиковая трубка со стулом должна соприкасаться с брюшиной. Промойте стент 2 мл 0,9% NaCl, чтобы распределить кал в брюшинной каверне.
10. Закройте брюшную каверну непрерывным швом (4/0) брюшины, а затем непрерывным швом (4/0) кожи.

3. Послеоперационная процедура

1. Прекратите вдыхание изофлурана и посадите крысу обратно в клетку.
2. Начните внутривенное обезболивание через венозную капельницу с использованием фентанила (2,0 мкг/100 г массы тела/час).

4. Подготовка мерок на второй день

1. Через 24 ч после процедуры sCASP введите 0,5-1,0 мг мидазолама внутривенно. Поддерживайте надлежащую глубину анестезии с использованием концентрации изофлурана и скорости потока на основе интраоперационного мониторинга крыс и/или рекомендаций органа по надзору за исследованиями на животных и/или ветеринарной бригады местного учреждения.
2. Снова продезинфицировав спиртом и раствором, выполните трахеотомию пластиковой трубкой венозной канюли 14 G для обеспечения достаточного насыщения кислородом и вентиляции.
   1. Поэтому раскройте шов на горле хирургическими ножницами и аккуратно раскройте от средней линии к трахее. Надрежьте трахею вертикально между двумя хрящами длиной около 2 мм хирургическими ножницами – как раз достаточно ввести хирургические ножницы. Ширьте разрез тупо примерно до половины диаметра трахеи с помощью ножниц. Вставьте 1 см пластиковой трубки 14 г и зафиксируйте ее 2 швами. ¹⁶
      Заметка: Если разрез трахеи превышает половину окружности, сосуды, идущие вдоль трахеи, могут быть повреждены, что приведет к сильному кровотечению, аспирации крови или летальной брадикардии.
   2. Начать искусственную вентиляцию легких с помощью аппарата искусственной вентиляции легких для грызунов с F_iO₂ 0,28 и 0,7 об.% изофлурана и начать внутривенную анестезию мидазоламом (0,7 мг/100 г массы тела/ч) и фентанилом (7 мкг/100 г массы тела/ч). Проведите анализ газов крови, чтобы обеспечить достаточную вентиляцию и насыщение кислородом. Поэтому извлеките около 0,7 мл крови через артериальный катетер и измерьте его с помощью анализатора газов крови.
      Заметка: Внутривенная анестезия должна начинаться только в том случае, если установлена искусственно контролируемая вентиляция.
3. После бритья и дезинфекции таким же образом, как и при 2,1, выполняют продольный разрез кожи правой ноги на 1 см проксимальнее колена на 0,5 см. Рассеките артерию от соседних структур с помощью хирургических ножниц и ватных палочек тупым ходом.
   Заметка: Если бедренная артерия разорвана, введение катетера в проксимальном положении все еще возможно. Таким образом, рекомендуется начинать имплантацию как можно дальше дистальнее.
4. Введите катетер термодилюции в бедренную артерию, открыв артерию крючком и вставив катетер с помощью щипцов.
5. Начните измерять сердечный выброс методом термодилюции. Поэтому быстро введите 1 мл охлажденного NaCl вручную через венозный катетер после начала измерения с помощью программного обеспечения для измерения сердечного индекса. Выполните это измерение дважды.

5. Оценка функции почек

1. Выполните лапаротомию, открыв ножницами швы кожи и брюшины. Надрезать мочевой пузырь хирургическими ножницами достаточно ровно настолько, чтобы катетеризировать его с помощью небольшого пластикового катетера. Проложив вокруг мочевого пузыря хлопчатобумажную нить длиной около 7 см, закрепите нить, зафиксируйте катетер узлами, и в конце соберите через катетер как можно больше мочи.
2. Растворите флуоресцеин-изотиоцианат-инулин (FITC-инулин) в 0,9% NaCl и натриевую соль (ПАУ)-аминогиппуровой кислоты в 0,9% NaCl до получения концентраций 2 мг/мл инулина, 5 мг/мл ПАУ.
3. Применяют болюс смеси обоих веществ по 75 мкл внутривенно с последующей постоянной внутривенной инфузией обоих веществ со скоростью 3,7 мкл/ч/300 г массы тела.
4. После достижения устойчивого состояния¹⁷ с вливанием ФИТК-инулина и ПАУ собирают мочу в течение 20 мин. Возьмите образцы крови через артериальный катетер, как описано в пункте 4.2.1 в отношении проведения анализа газов крови.
5. Определить концентрацию инулина в моче и плазме с помощью флуоресцентной спектрометрии и измерить ПАУ с помощью фотоспектрометрии с использованием метода антрона¹⁷.

6. Окончание экспериментов

1. Усыпьте животное в соответствии с местными правовыми нормами.
2. Извлеките как можно больше крови через артериальный катетер с помощью шприцев.
3. Соберите тонкую и толстую кишку, разрезав перитонеальную фиксацию двенадцатиперстной кишки и толстой кишки, удалите некоторые их части с помощью хирургических ножниц. Подготовьте и соберите почки, подготовив забрюшинное пространство, освободите их от жировой капсулы и разрежьте мочеточник и прилегающие сосуды. Проведите торакотомию и вырежьте легкие и сердце. Зафиксировать все органы в формальдегиде и выполнить гистологические окрашивания, как было опубликовано ранее. ^15,18

Как ранее было опубликовано Schick et ^al.8, мы демонстрируем следующие результаты.

Индукция сепсиса без смертности
В модели CASP сепсис индуцируется непрерывной утечкой внутрипросветных бактерий тол...

Патофизиология септического ОПП до сих пор остается неизвестной по своей сложности. Клинические исследования и испытания на пациентах не позволят получить новое представление об изменениях гистопатологии, нарушениях микроциркуляции или лекарственных взаимодейст?...

Авторам нечего раскрывать.

М.А. Шик и Н. Шлегель получили финансирование от Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) SCHL 1962/2-1 и SCHL 1962/4-1.