דלקת הצפק הסטנדרטית של מעי הגס בחולדות - מודל פשוט ואפשרי לגרימת פגיעה כלייתית חריפה ספטית

פגיעה כלייתית חריפה (AKI) היא סיבוך חמור בחולים במצב קריטי וקשורה לתמותה מוגברת. כאן, אנו מציגים מודל אמין וניתן לשחזור in vivo כדי לחקות AKI בתנאים דלקתיים שעשויים לתרום להבנת הפתוגנזה של AKI ספיגה.

AKI בחולי ספטי קשור לתמותה מוגברת ולתוצאות גרועות למרות מאמצים גדולים לחדד את ההבנה של הפתופיזיולוגיה שלו. כאן, מוצג מודל in vivo המשלב מיקוד ספטי סטנדרטי לגרימת AKI ומערך טיפול נמרץ (ICU) כדי לספק ניטור המודינמי מתקדם וטיפול הדומה באלח דם אנושי. אלח דם נגרמת על ידי דלקת סטנט סטנט (sCASP) סטנדרטית של המעי הגס. AKI נחקר מבחינה תפקודית על ידי מדידת דגימות דם ושתן וכן היסטולוגית על ידי הערכת ציונים היסטופתולוגיים. יתר על כן, הניטור ההמודינמי המתקדם והאפשרות לדגימה חוזרת של גזי דם מאפשרים ניתוח מובחן של חומרת אלח דם מושרה.

שיטת sCASP היא שיטה סטנדרטית, אמינה וניתנת לשחזור לגרימת AKI ספיגה. מערך הטיפול הנמרץ, ניטור המודינמי רציף וחילופי גזים, שיעור תמותה נמוך כמו גם ההזדמנות לניתוחים מפורטים של תפקוד הכליות והליקויים הם היתרונות של מערך זה. לכן, השיטה המתוארת עשויה לשמש כסטנדרט חדש לחקירות ניסיוניות של AKI ספיגה.

אלח דם עדיין נותר גורם המוות המוביל ביחידות טיפול נמרץ שאינן לב (ICU) עם שיעורי תמותה של ≈ 30 - 50%^1,2,3. סימן היכר של אלח דם חמור והלם ספטי הוא הפגיעה בכליות החריפה הגורמת לעלייה נוספת בשיעור התמותה כאשר היא קשורה לתפקוד לקוי של איברים מרוחקים כגון אי ספיקת לב ונשימה ^4,5,6. השכיחות הכוללת של AKI בחולי טיפול נמרץ נעה בין 20 ל-50%⁷. למרות התפקיד המרכזי של AKI לגבי התוצאה והתמותה באלח דם, הפתו-מנגנון הבסיסי עדיין אינו מובן היטב.

בסך הכל ישנם 3 המרכיבים העיקריים: דלקת, פגיעה רעילה ושינויים המודינמיים התורמים להתפתחות AKI⁷. שינויים המודינמיים כוללים זרימת דם כלייתית מופחתת (RBF) ואיסכמיה כלייתית גלובלית או אזורית. כאן, יש לקחת בחשבון כי אלח דם יכול גם לגרום לפגיעה במיקרו-סירקולציה הכלייתית עקב תת לחץ דם מערכתי ו/או הפרעה במחסום האנדותל⁸. לכן, חקר AKI ספיגה צריך לכלול תמיד ניטור המודינמי. מחקרים אחרונים על AKI השתמשו בעיקר במודלים של בעלי חיים כגון פגיעה באיסכמיה כלייתית או כריתת כליה דו-צדדית. מחקרים אלה הראו בדרך כלל היעדר ניטור המודינמי וטיפול נמרץ.

חקירת פתומנגנונים וטיפולים פוטנציאליים חדשים של AKI ספטי דורשת מודל in vivo עם מיקוד ספטי מוגדר, מערך טיפול נמרץ, תוצאה צפויה ופגיעה באיברים 9,10,11,12. כאן, אנו מתארים מודל מכרסמים חדשני עבור AKI ספיגה העונה על הדרישות שהוזכרו קודם לכן. AKI ספטי מושרה על ידי דלקת צפק סטנט (sCASP) מתוקננת של המעי הגס. מודל ה- sCASP המשומש גורם לאלח דם בבטן על ידי דליפת צואה במעי המובילה לפלישת חיידקים ואי ספיקת איברים^{מרובים 13}. הוכח כי שינויים פתופיזיולוגיים לאחר CASP דומים לאלו באלח דם אנושי ולכן CASP מייצג מודל רלוונטי מבחינה קלינית במחקר אלח דם^11,14.

יתר על כן, מערך טיפול נמרץ (ICU) הכולל ניטור המודינמי מתקדם וטיפול נמרץ הוקם בפרוטוקול הניסוי. מערך הטיפול הנמרץ מאפשר החייאת נוזלים, מריחת משככי כאבים תוך ורידית וניתוח גזי דם חוזרים. תפקוד הכליות מוערך על ידי מדידת ערכים סטנדרטיים כגון קריאטינין ועל ידי פינוי אינולין וחומצה p-אמינוהיפורית (PAH). מידע נוסף מועבר על ידי עשרות פתוהיסטולוגיות של רקמות ואיברים שנקטפו בסוף הניסוי. מודל sCASP להשראת AKI ספטי כבר מוערך וחשף תובנות חדשות בפתולוגיה של הכליות¹⁵. יישום נוסף של פרוטוקול זה המוצג להלן עשוי לעזור לחדד את ההבנה של AKI ספיגה.

כל ההליכים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה לטיפול ושימוש בחיות מעבדה של מחוז אונטרפרנקן, גרמניה ובוצעו על פי הצהרת הלסינקי.

1. הכנה כירורגית והתקנה של ניטור פולשני ותרופות רציפות

1. להרדים חולדות Sprague-Dawley באמצעות איזופלורן המועבר על ידי וופורייזר מדויק בריכוז וקצב זרימה שאושרו על ידי גוף הפיקוח על מחקר בבעלי חיים של המוסד המקומי ו/או הצוות הווטרינרי. ודא עומק הרדמה הולם על ידי התבוננות בקצב הנשימה, שהופך איטי ועמוק יותר, וודא חוסר תגובה לאחר צביטה בזנב/בוהן. לגלח את הגרון והבטן בעזרת סכין גילוח.
   הערה: הפחתה מסיבית של קצב הנשימה יכולה להיות אינדיקטור למנת יתר של הרדמה ולהוביל לברדיפנו, תת לחץ דם ומוות לבסוף.
2. הניחו את החולדה במצב שכיבה על כרית חימום. מרחו משחה וטרינרית על העיניים כדי למנוע התייבשות בעיניים. שמור על עומק הרדמה מתאים באמצעות ריכוז איזופלורן וקצב זרימה בהתבסס על ניטור תוך ניתוחי של חולדות ו/או המלצות של גוף הפיקוח על מחקר בבעלי חיים של המוסד המקומי ו/או הצוות הווטרינרי. הניחו את החולדה במצב שכיבה על כרית חימום אוטומטית.
   הערה: היפותרמיה ופגיעה תרמית משפיעות על פרמטרים מאקרו ומיקרו-המודינמיים ויש להימנע מהן כדי להשיג תוצאה אמינה. מומלץ להשתמש בכרית חימום עם מנגנון בקרה המקושר לחולדה באמצעות בדיקה רקטלית גמישה לשמירה על טמפרטורת הגוף בטווח הפיזיולוגי.
3. לאחר חיטוי הצוואר והגרון בתמיסת החיטוי המתאימה, חתכו את העור בגרון המדיאלי בעזרת אזמל ובצעו חתך של כ -2 ס"מ. סובב את החולדה ובצע חתך של כ -1 ס"מ עם מספריים כירורגיים על הצוואר במרחק של כ -1 ס"מ מהעורף.
4. החזר את החולדה למצב שכיבה. נתח בעדינות את וריד הצוואר הימני ואת עורק הצוואר השמאלי בעזרת המספריים וניצני הצמר גפן. נתח את הכלים מהמבנים הסמוכים. הימנע מגרירה רבה מדי והתכוננו עוד יותר בתנועות פיזור זהירות.
   הערה: שמור על הכלים לחים תמיד על ידי מריחת מי מלח סטריליים מחוממים מראש.
5. מנתחים בעדינות ובתנועות פיזור תת עוריות מהכלים לצוואר כדי לקבל חיבור בין שני החתכים. הכנס מהדקים לכל מנהרה שנוצרה.
6. שטוף את המסתובב והצנתרים, המגיעים מהמכשיר המסתובב עם 0.9% NaCl. הכנס את הצנתרים לקפיץ נירוסטה.
   הערה: יש לשטוף את הצנתרים בנתרן כלורי לפני הכנסתם, מכיוון שהפעלת אוויר מינימלית עלולה להוביל למוות פתאומי עקב תסחיף אוויר.
7. סובב את החולדה והדק את הצנתרים באמצעות ה-clamps שהוכנסו. החלק את הצנתרים מהצוואר לגרון. תקן את הקפיץ עם קשירת כפתור מפלסטיק במרחק של כ-1 ס"מ מהעורף עם 6 תפרים בודדים (למשל 4/0) על הצוואר.
8. הניחו את החולדה שוב במצב שכיבה. הניחו חוטי כותנה של כ -4 ס"מ דיסטליים ופרוקסימליים לכל כלי מוכן. מהדקים את העורק הפרוקסימלי בעזרת מיקרו-קליפ, המשמש בדרך כלל לחיתוך מפרצות תת-עכבישיות. לחלופין, עזוב את הקליפ ועצור את זרימת הדם העורקי על ידי הידוק אחד החוטים.
9. חתכו את העורק בעזרת מספריים מיקרו כירורגיים, השאירו את החתך פתוח עם וו ביד אחת והכניסו את הצנתר העורקי לכלי באמצעות מלקחיים ביד השנייה. פתח את הקליפ או את החוט הנמשך, דחף את הקטטר כ-1 ס"מ קדימה לתוך הכלי לכיוון הלב וקבע אותו בקשרים כירורגיים באמצעות חוטי הכותנה המונחים.
10. חזור על שלב 1.8 על וריד הצוואר והשאיר את הקליפ, מכיוון שהווריד אינו מוצק כמו העורק.
11. לאחר קיבוע שני הצנתרים בקו ישר בכלי הדם, סגור את הפצע בגרון בעזרת תפרים.

2. נוהל sCASP

1. שמור את החולדה במצב שכיבה, גלח את הבטן וחטא את אזור הבטן בתמיסות חיטוי מתאימות.
   הערה: השתמש תמיד בטכניקה אספטית.
2. בצע חתך בקו האמצע של העור בבטן באורך של כ-2 ס"מ עם מספריים כירורגיים ולאחר מכן שוב לאורך הלינאה אלבה כדי לפתוח את המערה הצפקית.
3. זהה את מוט הקיקום ומשוך החוצה את הקיקום בעדינות באמצעות צמר גפן.
4. לנקב את המעי הגס העולה במרחק של כ-2 ס"מ מהמסתם האילאוקאי עם תפר (6/0) [תפר 1] בצד האנטי-מזנטרי ולתקן אותו בשני קשרים כירורגיים. יש להימנע מנגעים בכלי המעי הגס.
5. חתכו את הקצה הדיסטלי - כ -1.5 ס"מ - של קטטר יניקה 10 FR. חותכים את חתיכת הקטטר הזו עם המספריים ליצירת דש מלבני באורך של כ- 0.5 ס"מ. הכן את הדש עם תפר (6/0) [תפר 2] באמצע הדש.
6. הנח את הדש מעל מחט 14G ונקב את המעי הגס העולה עם המחט במקום שבו תפר 1 תוקן¹⁵.
7. הכנס את צינור הפלסטיק המוכן למעי הגס מעל המחט. הסר את המחט במקביל בעדינות. מקם את הצינור כך שהדש מונח מחוץ למעי הגס ושאר הצינור בתוך המעי הגס.
   1. לאחר מיקום מדויק של צינור הפלסטיק תקן את הדש עם התפר הקיים כבר 2 על ידי תפירת דופן המעי הגס וקשרים כירורגיים. הימנע שוב מכל נגע בכלי המעי הגס. שים את הקצוות החופשיים של תפר 1 סביב שאר צינור הפלסטיק המוביל מחוץ למעי הגס ובצע 2 קשרים כירורגיים.
8. צואת חלב מהקקום לכיוון הסטנט של המעי הגס באמצעות צמר גפן עד להופעת צואה ביציאת הסטנט.
9. החזירו את המעי הדק והמעי הגס למערת הבטן. בזאת צינור הפלסטיק עם הצואה צריך להיות במגע עם הצפק. שטפו את הסטנט עם 2 מ"ל 0.9% NaCl כדי להפיץ את הצואה למערת הצפק.
10. סגור את מערת הבטן עם תפר רציף (4/0) של הצפק ולאחר מכן עם תפר רציף (4/0) של העור.

3. הליך לאחר הניתוח

1. הפסיקו את שאיפת האיזופלורן והחזירו את החולדה לכלוב שלה.
2. התחל את שיכוך הכאבים התוך ורידי דרך הקו הוורידי באמצעות פנטניל (2.0 מיקרוגרם/100 גרם משקל גוף לשעה).

4. הכנת המדידות ביום השני

1. 24 שעות לאחר הליך sCASP, יש למרוח 0.5-1.0 מ"ג מידזולם תוך ורידי. שמור על עומק הרדמה מתאים באמצעות ריכוז איזופלורן וקצב זרימה בהתבסס על ניטור תוך ניתוחי של חולדות ו/או המלצות של גוף הפיקוח על מחקר בבעלי חיים של המוסד המקומי ו/או הצוות הווטרינרי.
2. לאחר חיטוי באלכוהול ותמיסה שוב, בצע טרכאוטומיה עם צינור הפלסטיק של צינורית ורידית 14 גרם כדי לספק חמצון ואוורור מספקים.
   1. לכן, פתחו את התפר בגרון בעזרת מספריים כירורגיים ופתחו בעדינות מקו האמצע לקנה הנשימה. חתכו את קנה הנשימה אנכית בין שני סחוסים באורך של כ -2 מ"מ בעזרת מספריים כירורגיים - מספיק כדי להכניס מספריים כירורגיים. הרחב את החתך בצורה בוטה לכמחצית מקוטר קנה הנשימה בעזרת המספריים. הכנס 1 ס"מ של צינור פלסטיק 14 גרם ותקן אותו עם 2 תפרים. ¹⁶
      הערה: אם החתך של קנה הנשימה גדול ממחצית ההיקף, כלי דם העוברים לצד קנה הנשימה עלולים להיפגע וכתוצאה מכך דימום חמור, שאיבת דם או ברדיקרדיה קטלנית.
   2. התחל הנשמה מכנית עם מכונת הנשמה למכרסמים עם F_iO₂ של 0.28 ו-0.7 Vol. % isoflurane והתחל בהרדמה תוך ורידית עם מידזולם (0.7 מ"ג/100 גרם BW/h) ופנטניל (7 מיקרוגרם/100 גרם BW/h). בצע ניתוחי גזי דם כדי להבטיח אוורור וחמצון מספקים. לכן, משכו כ-0.7 מ"ל דם דרך הצנתר העורקי ומדדו אותו עם מנתח גזי דם.
      הערה: הרדמה תוך ורידית צריכה להתחיל רק אם נוצר אוורור מבוקר מכנית.
3. לאחר גילוח וחיטוי באופן דומה ל- 2.1 בצע חתך אורכי של 1 ס"מ בעור רגל ימין 0.5 ס"מ פרוקסימלי של הברך. נתח את העורק מהמבנים הסמוכים בעזרת מספריים כירורגיים וניצני כותנה בצורה בוטה.
   הערה: אם עורק הירך נקרע, עדיין אפשרית החדרת קטטר במצב פרוקסימלי. לפיכך, מומלץ להתחיל את ההשתלה רחוק ככל האפשר.
4. הכנס קטטר דילול תרמי לעורק הירך על ידי פתיחת העורק עם וו והחדרת הקטטר בעזרת מלקחיים.
5. התחל למדוד את תפוקת הלב בשיטת דילול תרמי. לכן, יש להחדיר 1 מ"ל של NaCl מקורר במהירות באופן ידני דרך הצנתר הוורידי לאחר שהתחלת המדידה של תוכנת מדידת אינדקס לב. בצע מדידה זו פעמיים.

5. הערכת תפקודי כליות

1. בצע לפרוטומיה על ידי פתיחת תפרי העור והצפק במספריים. חתכו את שלפוחית השתן במספריים כירורגיים בדיוק מספיק כדי לצנתר אותה עם קטטר פלסטיק קטן. לאחר הנחת חוט כותנה של כ -7 ס"מ סביב שלפוחית השתן, מהדקים את החוט, מקבעים את הקטטר בקשרים ולבסוף אוספים כמה שיותר שתן דרך הקטטר.
2. ממיסים פלואורסצאין-איזותיוציאנט-אינולין (FITC-Inulin) ב-0.9% NaCl וחומצה p-אמינוהיפורית מלח נתרן (PAH) ב-0.9% NaCl כדי לקבל ריכוזים של 2 מ"ג/מ"ל אינולין, 5 מ"ג/מ"ל PAH.
3. יש למרוח בולוס של תערובת של שני החומרים של 75 מיקרוליטר i.v., ואחריו עירוי תוך ורידי קבוע של שני החומרים בקצב של 3.7 μL/h/300 g BW.
4. לאחר שהגענו למצב יציב¹⁷ עם עירוי של FITC-אינולין ו-PAH אספו את השתן למשך 20 דקות. לקיחת דגימות דם דרך הצנתר העורקי כמתואר בסעיף 4.2.1 לביצוע בדיקת גזי דם.
5. קבע את ריכוזי האינולין של השתן והפלזמה על ידי ספקטרומטריית פלואורסצנטיות ומדוד PAH על ידי פוטוספקטרומטריה בשיטת anthrone¹⁷.

6. סיום הניסויים

1. המתת חסד של בעל החיים בהתאם לתקנות החוקיות המקומיות.
2. משוך כמה שיותר דם דרך הצנתר העורקי באמצעות מזרקים.
3. קצרו את המעי הדק והגס על ידי חיתוך קיבוע הצפק של התריסריון והמעי הגס, הוציאו חלקים מאלה באמצעות מספריים כירורגיים. הכינו וקצרו את הכליות על ידי הכנת רטרופריטונאלי ושחררו אותן מהקפסולה השומנית שלהן וחתכו את השופכן ואת הכלים המחוברים. בצע כריתת בית חזה וחתוך את הריאות והלב. תקן את כל האיברים בפורמלדהיד ובצע צביעות היסטולוגיות כפי שפורסם בעבר. ^15,18

כפי שפורסם בעבר על ידי Schick et ^al.8, אנו מדגימים את התוצאות הבאות.

אינדוקציה של אלח דם ללא תמותה
במודל CASP, אלח דם נגרם על ידי דליפה מתמשכת של חיידקים הממוקמים תוך לומינליים של המעי הגס עולים לחלל הבטן ו...

הפתופיזיולוגיה של AKI ספיגה עדיין לא ידועה במורכבותה. מחקר קליני וניסויים בחולים לא יאפשרו השגת תובנות חדשות ביחס לשינויים בהיסטופתולוגיה, הפרעות במיקרו-סירקולציה או אינטראקציות תרופתיות ברמות התאים¹⁵. בעבר הועלתה ההנחה כי יש צורך במודלים משופרים וחדשים של ...

למחברים אין מה לחשוף.

M.A. Schick ו-N. Schlegel קיבלו מימון מ-Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) SCHL 1962/2-1 ו-SCHL 1962/4-1.