Плагин Micro-Manager с открытым исходным кодом для визуализации флуоресцентных диполей в режиме реального времени

Мы разработали плагин Micro-Manager с открытым исходным кодом, который позволяет наблюдать флуоресцентные диполи в режиме реального времени на микроскопе со структурированным освещением. Плагин поддерживает наблюдение как 2D, так и 3D ориентации диполя.

Флуоресцентная поляризационная микроскопия (ФПМ) позволяет получить изображение положения и дипольной ориентации флуорофоров. Несмотря на достижения флуоресцентной поляризационной микроскопии со сверхвысоким разрешением, их зависимость от пострегистрации затрудняет наблюдение в реальном времени. Микроскопия с поляризованным структурированным освещением (pSIM) обеспечивает визуализацию флуоресцентных диполей со сверхвысоким разрешением и высокой скоростью визуализации и хорошо подходит для применения с живыми клетками. Мы разработали реализацию с открытым исходным кодом для реконструкции поляризационных изображений в реальном времени и отображения флуоресцентных диполей. Кроме того, мы расширили метод для достижения 3D-картографирования ориентации (3DOM), расширив его полезность для сложных биологических исследований. Кроме того, мы представили подробное введение в расширение существующего SIM-микроскопа для поляризационной визуализации и предоставили подробное руководство по настройке Micro-Manager 2.0 для управления микроскопом, позволяющего просматривать поляризационную визуализацию в режиме реального времени. Кроме того, мы предоставили код MATLAB для полной реконструкции, охватывающий как pSIM, так и 3DOM. Это всеобъемлющее руководство призвано помочь новичкам быстро освоить и легко приступить к работе.

Флуоресцентная поляризационная микроскопия (ФПМ) стала мощным методом одновременной визуализации положения и дипольной ориентации флуорофоров, предлагая глубокое понимание биологической^{визуализации.} Облегчая наблюдение за ориентацией биомолекул, FPM раскрывает сложное расположение макромолекул, таких как актин ^3,4,5, микротрубочки⁵, септин⁶, филамент^{ДНК 7-9}, комплекс ядерных пор¹⁰ и мембранные белки¹¹. Его высокоскоростные, неинвазивные и совместимые с живыми клетками возможности позволяют отслеживать динамику вращения молекул с высоким временным разрешением^11,12. При интеграции с биосиловыми зондами, FPM не только отображает величины сил с субклеточным разрешением, но и измеряет направления сил, тем самым улучшая наше понимание биомеханических процессов, выявляя направление сил¹³.

В последние десятилетия флуоресцентная поляризационная микроскопия со сверхвысоким разрешением претерпела стремительную эволюцию. Заметным достижением в этой области является одномолекулярная ориентационная микроскопия, также называемая SMOLM, которая может локализовать как положение, так и ориентацию флуорофоров, тем самым обеспечивая многомерную локализацию. Измерение поляризации в SMOLM может быть выполнено с использованием модуляции поляризационного возбуждения⁷, многоканального поляризационного детектирования³ или спроектированной функции поляризационного чувствительного рассеяния точки (PSF)¹⁴. Несмотря на то, что SMOLM достигает пространственного разрешения порядка десятков нанометров и измеряет поляризацию отдельных молекул, он страдает от длительного времени визуализации. Это связано с повторяющимися циклами мигания и локализации флуорофора, что создает проблему для визуализации со скоростью видео и приложений с живыми клетками.

В отличие от этого, поляризованная микроскопия структурированного освещения (pSIM) обеспечивает пространственное разрешение примерно до 100 нм в сочетании с получением поляризационной информации с помощью того же набора данных SIM. Примечательно, что pSIM может достигать скорости визуализации со скоростью видео и хорошо совместим с визуализацией живых клеток, без строгих требований к флуоресцентным молекулам. Недавно с помощью pSIM была успешно выявлена структура актинового кольца в мембраноассоциированном периодическом скелете (МПС)⁵ и получено картирование биологических сил со сверхвысоким разрешением13.

Тем не менее, pSIM требует реконструкции изображения после захвата, что препятствует визуализации результатов поляризации в режиме реального времени. Эта задержка препятствует непосредственному наблюдению за биологическими явлениями, не позволяя исследователям быстро фиксировать интересующие биологические явления и вносить корректировки в образцы и условия визуализации в режиме реального времени. Чтобы обойти это ограничение, мы разработали реализацию с открытым исходным кодом, которая облегчает получение изображений, реконструкцию и отображение результатов поляризации в режиме реального времени на основе платформы ImageJ и Micro-Manager (https://github.com/KarlZhanghao/live-pol-imaging).

Кроме того, в то время как pSIM была ограничена предоставлением двухмерной поляризационной информации в плоскости, мы недавно расширили ее возможности для достижения 3D-отображения ориентации с использованием почти того же^{оборудования15}, что называется 3D-отображением ориентации (3DOM). Это программное обеспечение с открытым исходным кодом также обеспечивает управление, реконструкцию и визуализацию 3DOM. Модули реконструкции и визуализации также совместимы с приложением для отслеживания ориентации одной молекулы. Все эти функциональные возможности повышают полезность поляризационной визуализации в сложных биологических исследованиях.

1. Расширение существующего микроскопа со структурированным освещением для поляризационной визуализации

1. Подготовьте SIM-микроскоп.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Мы предполагаем, что читатели имеют определенные знания в настройке микроскопа и уже владеют структурированным световым микроскопом. Если у вас нет соответствующего опыта, обратитесь к этой статье, в которой представлено подробное описание того, как построить микроскоп SIM¹⁶. Блок управления поляризацией "HWP+WQP+LCVR" может быть заменен на вихревую волновую пластину для пиццы в нашем pSIM work⁵ или полуволновую пластину для пиццы¹⁷.
2. Измерение коэффициентов затухания поляризации трех направлений полос путем загрузки различных шаблонов на пространственный модулятор света (SLM). Поместите и поверните поляризатор сразу после объектива и используйте измеритель мощности для измерения мощности лазера. Для pSIM вращайте волновую пластину, чтобы поддерживать s-поляризацию в трех направлениях с коэффициентом затухания > 10.
3. Для 3DOM поверните HWP2, чтобы сохранить p-поляризацию в шести направлениях. Замените пространственную маску SIM на пространственную маску 3DOM, чтобы пропускать лучи 1-го порядка шести направлений (см. рис. 1B).
   ПРИМЕЧАНИЕ: s-поляризация требуется в pSIM, в то время как p-поляризация требуется в 3DOM. Подробная настройка включена в другие статьи для pSIM⁵ и 3DOM¹⁵.

2. Настройка Micro-Manager

1. Скачайте версию Micro-Manager 2.0 с официального сайта, установите программное обеспечение, следуя инструкции.
2. Подготовьте соответствующие драйверы устройств и программное обеспечение для успешного подключения к системе Micro-Manager. В этой системе микроскопа используйте Micro-Manager для управления камерой, трансляционным столиком, лазером, платой сбора данных и микроскопом.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Поддерживаемые инструменты перечислены в https://micro-manager.org/Device_Support. Подробную информацию о подключаемых инструментах см. в Таблице материалов . Установите драйверы или официальное/вспомогательное программное обеспечение и подключите прибор к компьютеру с помощью USB-кабеля.
3. Добавьте инструменты в Micro-Manager с помощью мастера настройки оборудования.
   1. Откройте программу и выберите «Нет» в первоначальном раскрывающемся списке.
   2. Выбор устройств | Мастер настройки оборудования... | Создайте новую конфигурацию и нажмите кнопку Далее, чтобы перейти на страницу конфигурации.
   3. Найдите плагин Camera / Laser / Stage / DAQ/ microscope в выпадающем списке оборудования и нажмите Add | ОК | Далее.
   4. Перейдите в раздел Выбор устройств по умолчанию и выберите настройку автоматического спуска затвора. Установите параметры Камера по умолчанию, Затвор по умолчанию и Область фокусировки по умолчанию. Нажимайте кнопку Далее , пока не будет достигнута опция Сохранить конфигурацию и выход , и сохраните имя файла конфигурации. Нажмите кнопку Готово.
4. Общие настройки шаблона
   1. Сохраните шаблон для режима реального времени и режима привязки SIM-карты.
   2. Установите время экспозиции и режим срабатывания следующим образом: выберите Группу «+» в настройках конфигурации, назовите название группы «Режим», выберите Режим экспозиции и триггера, нажмите OK.
   3. Выберите пресет «+», чтобы добавить разные пресеты для группы «Режим». Назовите одну предустановку «live» для настроек экспозиции в режиме реального времени, а другую «SIM» для режима SIM. Например, в режиме «live» установите время экспозиции 15 мс, а в режиме привязки к SIM-карте установите время экспозиции 10 мс, а режим запуска — Standard (Overlap).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Файл конфигурации (MMConfig_psim_demo.cfg) включен в наш репозиторий кода, который может быть загружен непосредственно из Micro-Manager 2.0.

3. Калибровка системы с помощью флуоресцентных шариков

1. Погрузите покровные стекла в 75% этанол, промойте их 3 раза деионизированной водой (ddH₂O) и высушите.
2. Нанесите вихревой слой флуоресцентных шариков с длиной волны 100 нм (разбавленных до 1:1000 фосфатно-солевым буфером [PBS]) и нанесите суспензию пипеткой непосредственно на покровные стекла. Выдерживать 5-10 минут в темноте, затем аккуратно промыть PBS.
3. Добавьте 20 μL монтажного материала на предметное стекло микроскопа и расположите покровное стекло над ним, следя за тем, чтобы на нем не было пузырей. Поддерживайте температуру на уровне 4 °C и держите предметное стекло в темноте, чтобы предметное стекло с флуоресцентными шариками 100 нм было подготовлено к калибровке системы.
4. Для pSIM получите три изображения трех различных фаз флуоресцентных шариков. Пользовательский код MATLAB (Bead_calib.m) принимает изображения в качестве входных данных и выводит два калибровочных изображения (calib1.tif, calib2.tif) для дальнейшего анализа.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Как было показано ранее⁵, эксперимент с pSIM может быть выполнен на большинстве коммерческих систем. Как на домашних, так и на коммерческих SIM-микроскопах требуется калибровка системы, чтобы устранить погрешность измерения флуоресцентных диполей, вызванную неравномерным освещением в трех направлениях диаграммы направленности. Эксперимент по калибровке предполагает изотропную поляризацию флуоресцентных шариков и требует только необработанных изображений во время получения SIM-карты. Подробная процедура калибровки включена в нашу оригинальную работу⁵. Для реконструкции pSIM требуется вывод двух калибровочных изображений calib1.tif и calib2.tif, которые указывают на пиксельную энергию освещения направления паттерна 2; 3 относится к направлению паттерна 1.

4. Пробоподготовка: актин в неподвижных клетках

1. Погрузите покровные стекла в 75% этанол, промойте их 3 раза с ddH₂O. Поместите покровные стекла в шестилуночный планшет для культивирования клеток.
2. Культивируйте клетки U2OS (клеточная линия ATCC HTB-96) в модифицированной среде Dulbecco Eagle's Medium (DMEM) с добавлением 10% (v/v) фетальной сыворотки крупного рогатого скота (FBS) при 37 °C и 5%_CO2 на покровных листах до тех пор, пока они не достигнут примерно 75% конфлюенции.
3. Аккуратно промойте ячейки 3 раза с PBS. Для фиксации клеток нанесите 4% параформальдегид на 15 минут при комнатной температуре. После фиксации снова промойте клетки 3 раза PBS.
4. Для повышения проницаемости мембраны обработайте клетки 0,1% Triton X-100 в PBS в течение 5 минут, затем промойте клетки PBS 3 раза.
5. Флуоресцентный фаллоидин растворить в 150 мкл ДМСО для получения стокового раствора (66 мкМ). Приготовьте рабочий раствор красителя фаллоидина, разбавив 5 мкл стокового раствора в 995 мкл PBS. Инкубируйте клетки в темноте с рабочим раствором красителя фаллоидина при комнатной температуре в течение ~1 ч. Промойте клетки в течение 3 х 3 минут с помощью PBS.
6. Добавьте 20 μл монтажной среды на предметное стекло микроскопа. Аккуратно поместите покровное стекло на предметное стекло без образования пузырей. Храните предметное стекло при температуре 4 °C и храните его в темном месте.

5. Подготовка образца: λ-ДНК in vitro

1. Растворите 0,5 г полиметилметакрилата в 10 мл материала основы зубных протезов. После тщательного растворения равномерно нанесите раствор на поверхность предметного стекла, а затем дождитесь, пока он испарится для образования пленки.
2. Разведите 0,3 мкл λ-ДНК и 32 мкл 1000-кратного окрашивания оранжевых нуклеиновых кислот SYTOX в 968 мкл PBS. Добавьте в предметное стекло 1 мкл приготовленного раствора и дайте ему высохнуть.
3. Запечатайте покровное стекло на предметном стекле с помощью крепежа для защиты и сохранности образца. Храните предметное стекло при температуре 4 °C в темноте.

6. Визуализация

1. Поместите покровное стекло на держатель образца и отрегулируйте его по фокальной плоскости в режиме реального времени. Выберите ROI 512 x 512 пикселей и отрегулируйте время экспозиции и интенсивность лазера.
2. Откройте независимое управляющее программное обеспечение пространственного модулятора света и выберите подходящий путь последовательности светового шаблона для pSIM/3DOM или живого режима.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для pSIM диаграмма направленности включает в себя три различных угла поляризации и три разные фазы. Для 3DOM диаграмма направленности включает в себя шесть различных поляризационных углов.
3. Выберите режим съемки SIM-карты , выберите Multi-D Acq., выберите временные точки и установите количество (9 или 6 изображений для pSIM или 3DOM) и интервал (0 мс) в открытом окне. Нажмите «Приобрести»!
4. Нажмите на TriggerSLM.bsh (файл конфигурации включен в наш репозиторий кода), карта сбора данных MyDaq активирует пространственный модулятор света для съемки.

7. Live-view плагин для pSIM и 3DOM

1. Настройте FakeCamera и путь доступа к изображению: загрузите скрипт (MMConfig_FakeCam_demo.cfg), нажав на Устройства | Загрузить конфигурацию оборудования.... Настройка локального каталога образов в разделе Устройства | Браузер свойств устройств... | Маска Camera-Path (рис. 2A-C).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Часть скрипта, связанная с получением, зависит от настройки оборудования, поэтому мы предоставили версию (MMConfig_FakeCam_demo.cfg) с использованием устройства FakeCamera для чтения локальных изображений на жестком диске для демонстрации. Пользователи могут вносить изменения в нашей версии. Не забудьте изменить путь чтения изображения (маска Camera-Path).
2. Установите панель быстрого доступа, нажав на Инструменты | Панель быстрого доступа | Создайте новую панель. Нажмите на значок настроек в левом нижнем углу, переместите «Запустить скрипт» в верхнюю часть, которая может загрузить «psim.bsh» и «3DOM.bsh» (Рисунок 2D).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Система Панели Быстрого Доступа позволяет пользователям создавать настраиваемые окна и легко получать доступ к элементам управления в Micro-Manager, который требуется чаще всего. Также можно добавить 'Live', 'Snap' или другие каналы, как показано на рисунке 2D.
3. Взяв в качестве примера pSIM, выполните реконструкцию поляризационного изображения в реальном времени, нажав на 'psim.bsh'; наблюдать за изображениями, восстановленными в реальном времени, с результатами поляризации (рис. 2E). Не забудьте изменить путь к калибровочным изображениям в файле 'psim.bsh' (calibPath = "путь к файлу калибровочных изображений").
   ПРИМЕЧАНИЕ: Плагин live-view представляет собой скрипт beanshell (psim.bsh и 3DOM.bsh), который может быть запущен в панели скриптов. Плагин получает девять изображений для pSIM или шесть изображений для 3DOM и рассчитывает результаты отображения ориентации на основе изображений с широким полем. Изображения с картографированием ориентации отображаются для получения информации о поляризации в режиме реального времени, что облегчает немедленный контроль, несмотря на низкое разрешение.

8. Анализ данных с реконструкцией сверхвысокого разрешения

1. Установите MATLAB R2019b с сайта (см. Таблицу материалов).
2. Откройте программу; Для реконструкции pSIM получите девять изображений, состоящих из трех различных фаз для каждого из трех углов ориентации. Убедитесь, что имена девяти изображений находятся в диапазоне от '1.tif' до '9.tif', поместите их в файл с именем 'Input' и запустите программу с именем 'PSIM.m'. Наблюдайте за восстановленным широкопольным изображением, изображением SIM и изображением pSIM с помощью цветового круга.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для реконструкции pSIM необходимо выполнить два этапа: этап SIM и этап PM. Данные анализируются специально написанной программой MATLAB для упрощения отладки. Получите код восстановления из папки 'reconsr' в GitHub.
3. Для 3DOM захватите шесть различных значений направления поляризации. Объедините шесть изображений вместе, назовите полученный файл 'Raw_data.tif' и запустите программу с именем 'Recon_3DOM.m'. Наблюдайте за восстановленным широкопольным изображением и изображением 3DOM с азимутальными результатами и результатами полярного угла.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В процессе реконструкции может возникнуть ошибка --'функция или переменная 'bfopen' не распознана'. 'bfopen' — это функция в библиотеке био-форматов, которая обычно используется для открытия и чтения файлов изображений. Введите addpath ('path_to_bioformats_toolbox') в командном окне MATLAB. Замените «path_to_bioformats_toolbox» фактическим путем к папке библиотеки. Мы также добавили зависимость Bio-Formats в репозиторий GitHub.

Метод pSIM может быть выполнен на SIM-микроскопах на основе интерференции с использованием s-поляризованных лазерных лучей. S-поляризационная интерференция является наиболее широко используемым типом SIM и генерирует высококонтрастные световые полосы. ...

В нашем исследовании мы разработали плагин, который позволяет в режиме реального времени просматривать два метода поляризационной визуализации: pSIM и 3DOM. Обе технологии могут быть реализованы в существующей SIM-системе с небольшой модификацией. Мы подробно рассказали ...

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Эта работа была поддержана Национальной программой ключевых исследований и разработок Китая (2022YFC3401100).