Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

قمنا بتطوير مكون إضافي مفتوح المصدر Micro-Manager ، والذي يتيح المراقبة الحية لثنائيات الأقطاب الفلورية على مجهر إضاءة منظم. يدعم المكون الإضافي مراقبة كل من الاتجاه ثنائي القطب ثنائي الأبعاد وثلاثي الأبعاد.

Abstract

يمكن للفحص المجهري للاستقطاب الفلوري (FPM) تصوير موضع الفلوروفورات واتجاهها ثنائي القطب. على الرغم من إنجازات الفحص المجهري للاستقطاب الفلوري فائق الدقة ، إلا أن اعتمادها على ما بعد الاستحواذ يعيق المراقبة في الوقت الفعلي. يوفر الفحص المجهري للإضاءة الهيكلية المستقطبة (pSIM) تصويرا فائق الدقة لثنائيات الأقطاب الفلورية بسرعة تصوير عالية وهو مناسب تماما لتطبيقات الخلايا الحية. قمنا بتطوير تطبيق مفتوح المصدر لإعادة بناء صور الاستقطاب في الوقت الفعلي وعرض ثنائيات الأقطاب الفلورية. بالإضافة إلى ذلك ، قمنا بتوسيع الطريقة لتحقيق رسم خرائط الاتجاه ثلاثي الأبعاد (3DOM) ، مما أدى إلى توسيع فائدته للدراسات البيولوجية المعقدة. علاوة على ذلك ، قدمنا مقدمة شاملة لتوسيع مجهر SIM الحالي على التصوير الاستقطاب وقدمنا دليل تكوين مفصل ل Micro-Manager 2.0 للتحكم في المجهر ، مما يتيح معاينة التصوير المستقطب في الوقت الفعلي. بالإضافة إلى ذلك ، قدمنا رمز MATLAB لإعادة البناء الكامل بما في ذلك كل من pSIM و 3DOM. يهدف هذا الدليل الشامل إلى مساعدة المبتدئين في إتقان العمليات بسرعة والبدء فيها بسهولة.

Introduction

ظهر الفحص المجهري للاستقطاب الفلوري (FPM) كتقنية قوية للتصوير في وقت واحد لكل من موضع الفلوروفورات واتجاهها ثنائي القطب ، مما يوفر رؤى عميقة في التصوير البيولوجي1،2. من خلال تسهيل مراقبة اتجاه اتجاهات الجزيئات الحيوية ، يكشف FPM النقاب عن الترتيب المعقد للجزيئات الكبيرة مثل الأكتين3،4،5 ، والأنابيب الدقيقة5 ، والسبتين6 ، وخيوط الحمض النووي 7-9 ، ومركب المسام النووية10 ، وبروتينات الغشاء11. تسمح قدراتها عالية السرعة وغير الغازية والمتوافقة مع الخلايا الحية بتتبع ديناميكيات الدوران الجزيئي بدقة زمنية عالية11،12. عند دمجها مع مجسات القوة الحيوية ، لا يقوم FPM بتعيين أحجام القوة بدقة تحت الخلوية فحسب ، بل يقيس أيضا اتجاهات القوة ، وبالتالي يعزز فهمنا للعمليات الميكانيكية الحيوية من خلال الكشف عن اتجاه القوى13.

في العقود الماضية ، خضع الفحص المجهري للاستقطاب الفلوري فائق الدقة لتطور سريع. من التطورات الملحوظة في هذا المجال الفحص المجهري لتوطين اتجاه الجزيء الواحد ، والذي يطلق عليه أيضا SMOLM ، والذي يمكنه توطين موضع واتجاه الفلوروفورات ، وبالتالي تمكين التوطين متعدد الأبعاد. يمكن إجراء قياس الاستقطاب في SMOLM باستخدام تعديل إثارة الاستقطاب7 ، أو الكشف المستقطب متعدد القنوات3 ، أو وظيفة انتشار النقطة الحساسة للاستقطاب (PSF) 14. على الرغم من أن SMOLM تحقق دقة مكانية في حدود عشرات النانومترات وقياس استقطاب الجزيئات المفردة ، إلا أنها تعاني من وقت تصوير طويل. ويرجع ذلك إلى الدورات المتكررة لومض الفلوروفور وتوطينه ، مما يشكل تحديا للتصوير بمعدل الفيديو وتطبيقات الخلايا الحية.

في المقابل ، يوفر الفحص المجهري للإضاءة الهيكلية المستقطبة (pSIM) دقة مكانية تصل إلى حوالي 100 نانومتر ، إلى جانب الحصول على معلومات الاستقطاب بنفس مجموعة بيانات SIM. والجدير بالذكر أن pSIM يمكنه تحقيق سرعات تصوير بمعدل الفيديو وهو متوافق للغاية مع تصوير الخلايا الحية ، دون متطلبات صارمة على جزيئات الفلورسنت. في الآونة الأخيرة ، كشفت pSIM بنجاح عن بنية حلقة الأكتين في الهيكل العظمي الدوري المرتبط بالغشاء (MPS) 5 ومكنت من رسم خرائط فائقة الدقة للقوىالبيولوجية 13.

ومع ذلك ، تتطلب pSIM إعادة بناء الصورة بعد الاستحواذ ، مما يمنع التصور في الوقت الفعلي لنتائج الاستقطاب. يعيق هذا التأخير الملاحظة الفورية للظاهرة البيولوجية ، مما يمنع الباحثين من التقاط الظواهر البيولوجية ذات الأهمية بسرعة وإجراء تعديلات في الوقت الفعلي على العينات وظروف التصوير. لمعالجة هذا القيد ، قمنا بتطوير تطبيق مفتوح المصدر يسهل الحصول على الصور وإعادة البناء في الوقت الفعلي وعرض نتائج الاستقطاب ، بناء على منصة ImageJ و Micro-Manager (https://github.com/KarlZhanghao/live-pol-imaging).

علاوة على ذلك ، في حين أن pSIM اقتصرت على توفير معلومات الاستقطاب في المستوى ثنائي الأبعاد ، فقد قمنا مؤخرا بتوسيع قدراتها لتحقيق رسم خرائط الاتجاه ثلاثي الأبعاد باستخدام نفس المعدات15 تقريبا ، والتي تسمى رسم خرائط الاتجاه ثلاثي الأبعاد (3DOM). يوفر هذا البرنامج مفتوح المصدر أيضا التحكم في 3DOM وإعادة بنائها وتصورها. تتوافق وحدات إعادة البناء والتصور أيضا مع تطبيق تتبع اتجاه الجزيء الفردي. كل هذه الوظائف تعزز فائدة التصوير الاستقطاب في الدراسات البيولوجية المعقدة.

Protocol

1. توسيع مجهر الإضاءة الهيكلي الحالي لتصوير الاستقطاب

  1. قم بإعداد مجهر SIM.
    ملاحظة: نفترض أن القراء لديهم أساس معين في إعداد المجهر ويمتلكون بالفعل مجهر ضوئي منظم. إذا كنت تفتقر إلى الخبرة ذات الصلة ، فراجع هذه الورقة ، التي توفر وصفا تفصيليا لكيفية بناء مجهر SIM16. يمكن استبدال وحدة التحكم في الاستقطاب ل "HWP + WQP + LCVR" بلوحة موجة دوامة بيتزافي pSIM 5 أو لوحة نصف موجة بيتزا17.
  2. قم بقياس نسب انقراض الاستقطاب لثلاثة اتجاهات شريطية عن طريق تحميل أنماط مختلفة على معدل الضوء المكاني (SLM). ضع المستقطب وقم بتدويره مباشرة بعد الهدف واستخدم مقياس الطاقة لقياس قوة الليزر. بالنسبة إلى pSIM ، قم بتدوير لوحة الموجة للحفاظ على استقطاب s لثلاثة اتجاهات مع نسبة انقراض > 10.
  3. بالنسبة إلى 3DOM ، قم بتدوير HWP2 للحفاظ على استقطاب p لستة اتجاهات. استبدل القناع المكاني لبطاقة SIM بالقناع المكاني 3DOM للسماح بمرور حزم من رتبة واحدة من ستة اتجاهات (انظر الشكل 1 ب).
    ملاحظة: الاستقطاب s مطلوب في pSIM بينما الاستقطاب p مطلوب في 3DOM. يتم تضمين الإعداد التفصيلي في مكان آخر ل pSIM5 و 3DOM15.

2. إعداد Micro-Manager

  1. قم بتنزيل إصدار Micro-Manager 2.0 من الموقع الرسمي ، وقم بتثبيت البرنامج باتباع التعليمات.
  2. قم بإعداد برامج تشغيل الأجهزة والبرامج المقابلة للاتصال بنظام Micro-Manager بنجاح. في نظام المجهر هذا ، استخدم Micro-Manager للتحكم في الكاميرا والمرحلة الانتقالية والليزر ولوحة DAQ والمجهر.
    ملاحظة: الأدوات المدعومة مدرجة في https://micro-manager.org/Device_Support. راجع جدول المواد للحصول على تفاصيل حول الأدوات المراد توصيلها. قم بتثبيت برامج التشغيل أو البرامج الرسمية / الدعم وقم بتوصيل الجهاز بالكمبيوتر باستخدام كابل USB.
  3. أضف الأدوات إلى Micro-Manager باستخدام معالج تكوين الأجهزة.
    1. افتح البرنامج وحدد لا شيء من القائمة المنسدلة الأولية.
    2. حدد الأجهزة | معالج تكوين الأجهزة... | أنشئ تكوينا جديدا وانقر فوق التالي للدخول إلى صفحة التكوين.
    3. حدد موقع المكون الإضافي للكاميرا / الليزر / المسرح / DAQ / المجهر في قائمة الأجهزة المنسدلة وانقر فوق إضافة | حسنا | التالي.
    4. انتقل إلى تحديد الأجهزة الافتراضية واختر إعداد الغالق التلقائي. قم بتعيين الكاميرا الافتراضية والغالق الافتراضي ومرحلة التركيز البؤري الافتراضي. انقر فوق التالي حتى يتم الوصول إلى حفظ التكوين والخروج ، واحفظ اسم ملف التكوين. انقر فوق إنهاء.
  4. إعدادات القالب الشائعة
    1. احفظ نموذجا للوضع المباشر ووضع محاذاة بطاقة SIM.
    2. اضبط وقت التعرض ووضع التشغيل على النحو التالي: اختر المجموعة "+" في إعدادات التكوين ، وقم بتسمية اسم المجموعة باسم "الوضع" ، وحدد وضع التعرض والتشغيل ، وانقر فوق موافق.
    3. اختر الإعداد المسبق '+' لإضافة إعدادات مسبقة مختلفة لمجموعة "الوضع". قم بتسمية إعداد مسبق واحد "مباشر" لإعدادات التعرض للوضع المباشر ، و "SIM" آخر لوضع SIM. على سبيل المثال ، في الوضع "المباشر" ، اضبط وقت التعريض الضوئي على 15 مللي ثانية ، بينما بالنسبة لوضع محاذاة بطاقة SIM ، اضبط 10 مللي ثانية لوقت التعرض ووضع التشغيل قياسي (تداخل).
      ملاحظة: يتم تضمين ملف التكوين (MMConfig_psim_demo.cfg) في مستودع التعليمات البرمجية الخاص بنا، والذي يمكن تحميله مباشرة بواسطة Micro-Manager 2.0.

3. معايرة النظام مع حبات الفلورسنت

  1. اغمر الغطاء في 75٪ من الإيثانول ، واشطف الأغطية 3 مرات بالماء منزوع الأيونات (ddH2O) ، وجففها.
  2. دوامة حبات الفلورسنت 100 نانومتر (مخففة إلى 1: 1,000 بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات [PBS]) والماصة المعلقة مباشرة على الغطاء. احتضن لمدة 5-10 دقائق في بيئة مظلمة ، ثم اغسلها برفق باستخدام PBS.
  3. أضف 20 ميكرولتر من وسط التركيب على شريحة المجهر ، وضع الغطاء فوقه ، مع التأكد من تجنب أي فقاعات. حافظ على درجة الحرارة عند 4 درجات مئوية وحافظ على الشريحة في الظلام ، بحيث يتم إعداد الشريحة ذات الخرز الفلوري 100 نانومتر لمعايرة النظام.
  4. بالنسبة إلى pSIM ، احصل على ثلاث صور للمراحل الثلاث المختلفة لخرز الفلورسنت. يأخذ رمز MATLAB المخصص (Bead_calib.m) الصور كمدخلات ويخرج صورتي معايرة (calib1.tif ، calib2.tif) لمزيد من التحليل.
    ملاحظة: كما هو موضح سابقا5 ، يمكن إجراء تجربة pSIM على معظم الأنظمة التجارية. في مجاهر SIM المصنوعة منزليا أو التجارية ، يلزم معايرة النظام للتخلص من خطأ القياس لثنائيات الأقطاب الفلورية ، الناتجة عن الإضاءة غير المنتظمة خلال ثلاثة اتجاهات نمط. تفترض تجربة المعايرة الاستقطاب التماثلي للحبات الفلورية ولا تتطلب سوى الصور الأولية أثناء الحصول على بطاقة SIM. يتم تضمين إجراء المعايرة التفصيلية في عملنا الأصلي5. مطلوب إخراج صورتي معايرة calib1.tif و calib2.tif لإعادة بناء pSIM ، مما يشير إلى طاقة الإضاءة بالبكسل لاتجاه النمط 2 ؛ يشير 3 إلى اتجاه النمط 1.

4. تحضير العينة: الأكتين في الخلايا الثابتة

  1. اغمر الغطاء في 75٪ من الإيثانول ، واشطف الغطاء 3x باستخدام ddH2O. ضع الغطاء في لوحة زراعة الخلايا المكونة من ستة آبار.
  2. زراعة خلايا U2OS (خط خلايا ATCC HTB-96) في وسط النسر المعدل (DMEM) من Dulbecco مكمل بمصل الأبقار الجنيني بنسبة 10٪ (v / v) عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 على الغلافة حتى تصل إلى حوالي 75٪ من التقاء.
  3. اغسل الخلايا برفق 3x باستخدام PBS. لتثبيت الخلايا ، ضع 4٪ بارافورمالدهيد لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد التثبيت ، اغسل الخلايا 3x مرة أخرى باستخدام PBS.
  4. لتعزيز نفاذية الغشاء ، عالج الخلايا بنسبة 0.1٪ Triton X-100 في PBS لمدة 5 دقائق ، ثم اغسل الخلايا 3x باستخدام PBS.
  5. قم بإذابة الفالودين الفلوري مع 150 ميكرولتر من DMSO لمحلول المخزون (66 ميكرومتر). قم بإعداد محلول عمل صبغة الفالودين عن طريق تخفيف 5 ميكرولتر من محلول المخزون في 995 ميكرولتر من PBS. احتضان الخلايا في الظلام باستخدام محلول عمل صبغة الفالودين في درجة حرارة الغرفة لمدة ~ 1 ساعة. اغسل الخلايا لمدة 3 × 3 دقائق باستخدام PBS.
  6. أضف 20 ميكرولتر من وسط التركيب على شريحة المجهر. ضع الغطاء بحذر على الشريحة دون أي فقاعات. قم بتخزين الشريحة على حرارة 4 درجات مئوية واحتفظ بها في مكان مظلم.

5. تحضير العينة: في المختبر λ-DNA

  1. قم بإذابة 0.5 جم من بولي ميثيل ميثاكريلات في 10 مل من المواد الأساسية لأطقم الأسنان. بعد الذوبان الشامل ، ضع المحلول بالتساوي على سطح الشريحة ، ثم انتظر حتى يتبخر لتشكيل فيلم.
  2. خفف 0.3 ميكرولتر من λ-DNA و 32 ميكرولتر من صبغة الحمض النووي البرتقالي 1,000x SYTOX في 968 ميكرولتر من PBS. أضف 1 ميكرولتر من المحلول المحضر إلى الشريحة واتركه حتى يجف.
  3. أغلق الغطاء على الشريحة باستخدام الحامل لحماية العينة والحفاظ عليها. قم بتخزين الشريحة عند 4 درجات مئوية في بيئة مظلمة.

6. التصوير

  1. ضع الغطاء على حامل العينة واضبطه على المستوى البؤري في الوضع المباشر. حدد عائد استثمار 512 × 512 بكسل واضبط وقت التعرض وشدة الليزر.
  2. افتح برنامج التحكم المستقل لمغير الضوء المكاني ، واختر مسار تسلسل نمط الإضاءة المناسب ل pSIM / 3DOM أو الوضع المباشر.
    ملاحظة: بالنسبة إلى pSIM ، يشتمل نمط الإضاءة على ثلاث زوايا استقطاب مختلفة وثلاث مراحل مختلفة. بالنسبة إلى 3DOM ، يشتمل نمط الإضاءة على ست زوايا استقطاب مختلفة.
  3. حدد وضع التقاط بطاقة SIM ، وحدد Multi-D Acq. ، واختر النقاط الزمنية وقم بتعيين Count (9 أو 6 صور ل pSIM أو 3DOM) والفاصل الزمني (0 مللي ثانية) في النافذة المفتوحة. انقر فوق اكتساب!
  4. انقر فوق TriggerSLM.bsh (يتم تضمين ملف تكوين في مستودع التعليمات البرمجية الخاص بنا) ، تقوم بطاقة الحصول على MyDaq بتنشيط معدل الضوء المكاني لالتقاط الصور.

7. البرنامج المساعد للعرض المباشر ل pSIM و 3DOM

  1. قم بتكوين مسار FakeCamera والوصول إلى الصورة: قم بتحميل Scrip (MMConfig_FakeCam_demo.cfg) بالنقر فوق الأجهزة | تحميل تكوين الأجهزة.... تكوين الدليل المحلي للصور في الأجهزة | متصفح خصائص الأجهزة... | قناع مسار الكاميرا (الشكل 2A-C).
    ملاحظة: يعتمد جزء الاستحواذ من البرنامج النصي على إعداد الجهاز ، لذلك قدمنا إصدارا (MMConfig_FakeCam_demo.cfg) باستخدام جهاز FakeCamera لقراءة الصور المحلية على القرص الصلب للتوضيح. يمكن للمستخدمين إجراء تغييرات في نسختنا. تذكر تغيير مسار قراءة الصورة (قناع مسار الكاميرا).
  2. قم بتعيين لوحة الوصول السريع بالنقر فوق أدوات | بانيل الوصول السريع | إنشاء لوحة جديدة. انقر فوق رمز الإعدادات في الزاوية اليسرى السفلية ، وقم بإخراج "Run Script" في الجزء العلوي ، والذي يمكنه تحميل "psim.bsh" و "3DOM.bsh" (الشكل 2D).
    ملاحظة: يتيح نظام Quick Access Panel للمستخدمين إنشاء نوافذ مخصصة والوصول بسهولة إلى عناصر التحكم في Micro-Manager ، وهو أمر مطلوب في أغلب الأحيان. يمكن أيضا إضافة "Live" أو "Snap" أو قنوات أخرى ، كما هو موضح في الشكل 2D.
  3. بأخذ pSIM كمثال ، قم بإجراء إعادة بناء صورة الاستقطاب في الوقت الفعلي بالنقر فوق "psim.bsh" ؛ راقب الصور المعاد بناؤها في الوقت الفعلي مع نتائج الاستقطاب (الشكل 2E). تذكر تغيير مسار صور المعايرة في ملف 'psim.bsh' (calibPath = "مسار لمعايرة ملف الصور").
    ملاحظة: المكون الإضافي للعرض المباشر هو برنامج نصي beanshell (psim.bsh و 3DOM.bsh) ، والذي يمكن تشغيله في لوحة البرنامج النصي. يحصل المكون الإضافي على تسع صور ل pSIM أو ست صور ل 3DOM ويحسب نتائج تعيين الاتجاه بناء على صور المجال الواسع. يتم عرض صور رسم خرائط الاتجاه لتوفير معلومات الاستقطاب في الوقت الفعلي ، مما يسهل الفحص الفوري ، على الرغم من دقته المنخفضة.

8. تحليل البيانات مع إعادة بناء فائقة الدقة

  1. قم بتثبيت MATLAB R2019b من موقع الويب (انظر جدول المواد).
  2. افتح البرنامج؛ لإعادة بناء pSIM ، احصل على تسع صور ، تتكون من ثلاث مراحل مختلفة لكل زوايا من زوايا الاتجاه الثلاث. تأكد من أن أسماء الصور التسع من "1.tif" إلى "9.tif" ، وضعها في الملف المسمى "Input" ، وقم بتشغيل البرنامج المسمى "PSIM.m". راقب صورة المجال العريض المعاد بناؤها وصورة بطاقة SIM وصورة pSIM باستخدام عجلة الألوان.
    ملاحظة: تحتاج إعادة بناء pSIM إلى خطوتين: خطوة SIM وخطوة PM. يتم تحليل البيانات بواسطة برنامج MATLAB مكتوب خصيصا لتسهيل تصحيح الأخطاء. احصل على كود إعادة البناء من مجلد "reconsr" في GitHub.
  3. بالنسبة إلى 3DOM ، التقط ستة أشكال مختلفة لاتجاهات الاستقطاب. ادمج الصور الست معا ، وقم بتسمية الملف الناتج "Raw_data.tif" ، وقم بتشغيل البرنامج المسمى "Recon_3DOM.m". راقب صورة المجال الواسع المعاد بناؤها وصورة 3DOM مع نتائج السمت ونتائج الزاوية القطبية.
    ملاحظة: أثناء عملية إعادة الإعمار ، قد يحدث خطأ "- لا يتم التعرف على الوظيفة أو المتغير "bfopen". "bfopen" هي وظيفة في مكتبة التنسيقات الحيوية وتستخدم بشكل شائع لفتح ملفات الصور وقراءتها. أدخل addpath ('path_to_bioformats_toolbox') في نافذة أوامر MATLAB. استبدل "path_to_bioformats_toolbox" بمسار مجلد المكتبة الفعلي. أضفنا أيضا تبعية التنسيقات الحيوية إلى مستودع GitHub.

النتائج

يمكن تنفيذ طريقة pSIM على مجاهر SIM بناء على التداخل باستخدام أشعة الليزر المستقطبة s. تداخل الاستقطاب s هو النوع الأكثر استخداما من بطاقة SIM ويولد خطوط إضاءة عالية التباين. يتم تضمين النموذج الأولي الأكاديمي لإعداد المجهر في العمل الأصلي ل pSIM5....

Discussion

في دراستنا ، قمنا بتطوير مكون إضافي يسمح بالمعاينة في الوقت الفعلي لتقنيتين لتصوير الاستقطاب ، pSIM و 3DOM. يمكن تنفيذ كلتا التقنيتين في نظام SIM موجود مع تعديل طفيف. لقد قدمنا الخطوات التفصيلية لتثبيت مجهر pSIM و 3DOM وإعداد Micro-Manager للتحكم في المجهر وتوضيح كيفية الحصول على نتائج ?...

Disclosures

يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل من قبل البرنامج الوطني للبحث والتطوير الرئيسي في الصين (2022YFC3401100).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
100 nm Fluorescent beadsInvitrogenF8801
4% Formaldehyde solutionInvitrogenR37814
CameraTucsenDhyana 400BSI V3https://www.tucsen.com/download-software/
Denture base materials (Type I Thermally setting type, liquid)New Century DentalN/A
Dulbecco’s Modified Eagle’s MediumGibcoC11995500BT
Eclipse TE2000 Inverted MicroscopeNikonTE2000 E
Fetal Bovine SerumGibco10099141C
MATLAB R2019bMathWorksVersion R2019bhttps://ww2.mathworks.cn/downloads/
MetroCon V4.0KopinVersion 4.0Software of Spatial light modulator
Micro-Manager 2.0μΜanagerVersion 2.0Download Micro-Manager Latest Release
MS-2000 XYZ Automated StageApplied Scientific InstrumentationMIM3https://www.asiimaging.com/support/downloads/usb-support-on-ms-2000-wk-controllers/
myDAQNational Instruments781325-01Software and Driver Downloads - NI
OBIS 561 nm LS 20 mW LaserCoherent1325777
Phalloidin-AF568InvitrogenA12380
Phosphate buffered salineCorning21-040-CV
Poly Methyl MethacrylateSolarbioM9810
ProLong DiamondInvitrogenP36980
Spatial light modulatorKopinSXGA-12
SYTOX orange nucleic acid stainInvitrogenS11368
Triton X-100InvitrogenHFH10
TrypsinGibco25200056
λ-DNAInvitrogenS11368

References

  1. Zhanghao, K., Gao, J., Jin, D., Zhang, X., Xi, P. Super-resolution fluorescence polarization microscopy. J Innov Opt Health Sci. 11 (01), 1730002 (2018).
  2. Alonso, M. A., Brasselet, S. Polarization microscopy: from ensemble structural imaging to single-molecule 3D orientation and localization microscopy. Optica. 10 (11), 1486-1510 (2023).
  3. Valades Cruz, C. A., et al. Quantitative nanoscale imaging of orientational order in biological filaments by polarized superresolution microscopy. Pro Natl Acad Sci USA. 113 (7), E820-E828 (2016).
  4. Zhanghao, K., et al. Super-resolution dipole orientation mapping via polarization demodulation. Light Sci Appli. 5 (10), e16166 (2016).
  5. Zhanghao, K., et al. Super-resolution imaging of fluorescent dipoles via polarized structured illumination microscopy. Nat Commun. 10 (1), 4694 (2019).
  6. Vrabioiu, A. M., Mitchison, T. J. Structural insights into yeast septin organization from polarized fluorescence microscopy. Nature. 443 (7110), 466-469 (2006).
  7. Backer, A. S., Lee, M. Y., Moerner, W. E. Enhanced DNA imaging using super-resolution microscopy and simultaneous single-molecule orientation measurements. Optica. 3 (6), 659-666 (2016).
  8. Backer, A. S., et al. Single-molecule polarization microscopy of DNA intercalators sheds light on the structure of S-DNA. Sci Adv. 5 (3), eaav1083 (2019).
  9. Hulleman, C. N., et al. Simultaneous orientation and 3D localization microscopy with a Vortex point spread function. Nat Commun. 12 (1), 5934 (2021).
  10. Kampmann, M., Atkinson, C. E., Mattheyses, A. L., Simon, S. M. Mapping the orientation of nuclear pore proteins in living cells with polarized fluorescence microscopy. Nat Struct Mol Biol. 18 (6), 643-649 (2011).
  11. Lazar, J., Bondar, A., Timr, S., Firestein, S. J. Two-photon polarization microscopy reveals protein structure and function. Nat Methods. 8 (8), 684-690 (2011).
  12. Dong, B., et al. Parallel Three-Dimensional Tracking of Quantum Rods Using Polarization-Sensitive Spectroscopic Photon Localization Microscopy. ACS Photonics. 4 (7), 1747-1752 (2017).
  13. Blanchard, A., et al. Turn-key mapping of cell receptor force orientation and magnitude using a commercial structured illumination microscope. Nat Commun. 12 (1), 4693 (2021).
  14. Toprak, E., et al. Defocused orientation and position imaging (DOPI) of myosin V. Proc Natl Acad Sci USA. 103 (17), 6495-6499 (2006).
  15. Zhong, S., et al. Three-dimensional dipole orientation mapping with high temporal-spatial resolution using polarization modulation. PhotoniX. 5 (1), 12 (2024).
  16. Young, L. J., Ströhl, F., Kaminski, C. F. A Guide to Structured Illumination TIRF Microscopy at High Speed with Multiple Colors. J Vis Exp. (111), e53988 (2016).
  17. Huang, X., et al. long-term, super-resolution imaging with Hessian structured illumination microscopy. Nat Biotechnol. 36 (5), 451-459 (2018).
  18. Ando, R., et al. StayGold variants for molecular fusion and membrane-targeting applications. Nat Methods. 21 (4), 648-656 (2024).
  19. Hirano, M., et al. A highly photostable and bright green fluorescent protein. Nat Biotechnol. 40 (7), 1132-1142 (2022).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

FPM PSIM 3DOM SIM MATLAB

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved