형광 쌍극자의 실시간 이미징을 위한 오픈 소스 Micro-Manager 플러그인

우리는 구조화된 조명 현미경에서 형광 쌍극자를 실시간으로 관찰할 수 있는 오픈 소스 Micro-Manager 플러그인을 개발했습니다. 플러그인은 2D 및 3D 쌍극자 방향 관찰을 모두 지원합니다.

형광 편광 현미경(FPM)은 형광단의 위치와 쌍극자 방향을 이미지화할 수 있습니다. 초고해상도 형광 편광 현미경 검사법의 성과에도 불구하고 획득 후 분석에 대한 의존도는 실시간 관찰을 방해합니다. 편광 구조 조명 현미경(pSIM)은 빠른 이미징 속도로 형광 쌍극자의 초고해상도 이미징을 제공하며 라이브 셀 응용 분야에 적합합니다. 우리는 편광 이미지의 실시간 재구성과 형광 쌍극자의 표시를 위한 오픈 소스 구현을 개발했습니다. 또한 3D 방향 매핑(3DOM)을 달성하기 위해 이 방법을 확장하여 복잡한 생물학 연구에 대한 유용성을 확대했습니다. 또한 편광 이미징에서 기존 SIM 현미경을 확장하는 방법에 대한 자세한 소개를 제시하고 현미경을 제어하기 위한 Micro-Manager 2.0의 자세한 구성 가이드를 제공하여 편광 이미징을 실시간으로 미리 볼 수 있도록 했습니다. 또한 pSIM과 3DOM을 모두 포함하는 전체 재구성을 위한 MATLAB 코드를 제공했습니다. 이 포괄적인 가이드는 초보자가 작업을 빠르게 마스터하고 쉽게 시작할 수 있도록 돕는 것을 목표로 합니다.

형광 편광 현미경(FPM)은 형광단의 위치와 쌍극자 방향을 동시에 이미징하는 강력한 기술로 부상하여 생물학적 이미징에 대한 심오한 통찰력을 제공합니다 ^1,2. FPM은 생체 분자의 방향 관찰을 용이하게 함으로써 액틴 ^3,4,5, 미세소관⁵, 셉틴⁶, DNA 필라멘트 ^7-9, 핵공 복합체¹⁰ 및 막 단백질¹¹과 같은 거대 분자의 복잡한 배열을 밝힙니다. 고속, 비침습적 및 라이브 셀 호환 기능을 통해 높은 시간 분해능^11,12로 분자 회전 역학을 추적할 수 있습니다. 바이오포스 프로브와 통합되면 FPM은 세포 내 해상도에서 힘의 크기를 매핑할 뿐만 아니라 힘의 방향을 측정하여 힘의 방향을 밝힘(¹³)에 대한 이해를 증진시킵니다.

지난 수십 년 동안 초고해상도 형광 편광 현미경은 급속한 발전을 거듭했습니다. 이 분야에서 주목할 만한 발전은 SMOLM이라고도 하는 단일 분자 배향 국소화 현미경 검사법으로, 형광단의 위치와 방향을 모두 국소화할 수 있어 다차원 국소화를 가능하게 합니다. SMOLM의 편광 측정은 편광 여기 변조(polarization excitation modulation)⁷, 다중 채널 편광 감지(multi-channel polarized detection^{) 3} 또는 엔지니어링 편광 민감 포인트 스프레드 함수(Engineered polarization-sensitive point spread function, PSF)¹⁴를 사용하여 수행할 수 있습니다. SMOLM은 수십 나노미터 정도의 공간 분해능을 달성하고 단일 분자의 편광을 측정했음에도 불구하고 이미징 시간이 길어지고 있습니다. 이는 형광단 점멸 및 국소화의 반복적인 주기 때문이며, 이는 비디오 속도 이미징 및 라이브 셀 응용 분야에 문제를 제기합니다.

대조적으로, 편광 구조 조명 현미경(pSIM)은 동일한 SIM 데이터 세트로 편광 정보를 획득하는 것과 함께 약 100nm의 공간 해상도를 제공합니다. 특히 pSIM은 비디오 속도의 이미징 속도를 달성할 수 있으며 형광 분자에 대한 엄격한 요구 사항 없이 라이브 셀 이미징과 높은 호환성을 제공합니다. 최근 pSIM은 막과 관련된 주기적 골격(MPS)⁵ 에서 액틴 고리 구조를 성공적으로 밝히고 생물학적 힘의 초해상도 매핑을 가능하게 했습니다¹³.

그러나 pSIM은 획득 후 이미지 재구성이 필요하므로 편광 결과의 실시간 시각화가 불가능합니다. 이러한 지연은 생물학적 현상을 즉각적으로 관찰하는 데 방해가 되며, 연구자들이 관심 있는 생물학적 현상을 신속하게 포착하고 샘플 및 이미징 조건을 실시간으로 조정하는 데 방해가 됩니다. 이러한 한계를 해결하기 위해 ImageJ 및 Micro-Manager 플랫폼(https://github.com/KarlZhanghao/live-pol-imaging)을 기반으로 이미지 획득과 편광 결과의 실시간 재구성 및 표시를 용이하게 하는 오픈 소스 구현을 개발했습니다.

더욱이, pSIM은 2D 면내 편광 정보를 제공하는 것으로 제한되어 왔지만, 최근에는 3D 배향 매핑(3DOM)이라고 하는 거의 동일한 장비⁽¹⁵)를 사용하여 3D 배향 매핑을 달성할 수 있도록 그 기능을 확장했습니다. 이 오픈 소스 소프트웨어는 또한 3DOM의 제어, 재구성 및 시각화를 제공합니다. 재구성 및 시각화 모듈은 단일 분자 배향 추적 애플리케이션과도 호환됩니다. 이러한 모든 기능은 복잡한 생물학 연구에서 편광 이미징의 유용성을 향상시킵니다.

1. 편광 이미징을 위한 기존 구조화 조명 현미경 확장

1. SIM 현미경을 준비합니다.
   참고: 우리는 독자가 현미경 설정에 대한 특정 기초를 가지고 있으며 이미 구조화 광학 현미경을 소유하고 있다고 가정합니다. 관련 경험이 부족한 경우 SIM 현미경¹⁶을 구축하는 방법에 대한 자세한 설명을 제공하는 이 문서를 참조하십시오. "HWP+WQP+LCVR"의 편광 제어 장치는 pSIM work⁵ 또는 pizza half wave plate¹⁷의 피자 와류 파동 플레이트로 교체할 수 있습니다.
2. SLM(spatial light modulator)에 서로 다른 패턴을 로드하여 세 스트라이프 방향의 편광 소광비를 측정합니다. 대물렌즈 바로 뒤에 편광판을 놓고 회전시키고 파워 미터를 사용하여 레이저 출력을 측정합니다. pSIM의 경우 파동판을 회전하여 소광비 10> 세 방향의 S-편광을 유지합니다.
3. 3DOM의 경우 HWP2를 회전하여 6개 방향의 p-편광을 유지합니다. SIM 공간 마스크를 3DOM 공간 마스크로 교체하여 6개 방향의 1차 빔이 통과할 수 있도록 합니다( 그림 1B 참조).
   참고: pSIM에서는 s-편광이 필요하고 3DOM에서는 p-편광이 필요합니다. pSIM⁵ 및 3DOM¹⁵에 대한 자세한 설정은 다른 곳에 포함되어 있습니다.

2. 마이크로 매니저 설정

1. 공식 웹 사이트에서 Micro-Manager 2.0 버전을 다운로드하고 지침에 따라 소프트웨어를 설치하십시오.
2. Micro-Manager 시스템에 성공적으로 연결할 수 있도록 해당 장치 드라이버 및 소프트웨어를 준비합니다. 이 현미경 시스템에서는 Micro-Manager를 사용하여 카메라, 병진 스테이지, 레이저, DAQ 보드 및 현미경을 제어할 수 있습니다.
   참고: 지원되는 기기는 https://micro-manager.org/Device_Support 에 나열되어 있습니다. 연결할 기기에 대한 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오. 드라이버 또는 공식/지원 소프트웨어를 설치하고 USB 케이블을 사용하여 기기를 컴퓨터에 연결합니다.
3. Hardware Configuration Wizard를 사용하여 Micro-Manager에 계측기를 추가합니다.
   1. 소프트웨어를 열고 초기 드롭다운 목록에서 없음을 선택합니다.
   2. 장치 선택 | 하드웨어 구성 마법사... | 새 구성을 생성하고 Next(다음)를 클릭하여 구성 페이지로 들어갑니다.
   3. 드롭다운 하드웨어 목록에서 Camera / Laser / Stage / DAQ/ microscope 플러그인을 찾아 Add | 확인 | 다음.
   4. 기본 장치 선택으로 이동하여 자동 셔터 설정을 선택합니다. 기본 카메라, 기본 셔터 및 기본 초점 스테이지를 설정합니다. Save configuration and exit(구성 저장 및 종료)에 도달할 때까지 Next(다음)를 클릭하고 구성 파일 이름을 저장합니다. 마침을 클릭합니다.
4. 일반 템플릿 설정
   1. 라이브 모드 및 SIM 스냅 모드용 템플릿을 저장합니다.
   2. 노출 시간과 트리거 모드를 다음과 같이 설정합니다: 구성 설정에서 그룹 ' +'를 선택하고, 그룹 이름을 '모드'로 지정하고, 노출 및 트리거 모드를 선택하고, 확인을 클릭합니다.
   3. 프리셋 '+'를 선택하여 '모드' 그룹에 다른 프리셋을 추가합니다. 라이브 모드 노출 설정에 대해 사전 설정 중 하나를 '라이브'로 지정하고 SIM 모드에 대해 다른 'SIM'으로 이름을 지정합니다. 예를 들어ample, '라이브' 모드에서는 노출 시간을 15ms로 설정하고, SIM 스냅 모드에서는 노출 시간을 10ms로 설정하면 트리거 모드가 표준(오버랩)이 됩니다.
      참고: 구성 파일(MMConfig_psim_demo.cfg)은 Micro-Manager 2.0에서 직접 로드할 수 있는 코드 저장소에 포함되어 있습니다.

3. 형광 비드를 사용한 시스템 교정

1. 커버슬립을 75% 에탄올에 담그고 커버슬립을 탈이온수(ddH₂O)로 3번 헹구고 건조시킵니다.
2. 100nm 형광 비드(인산염 완충 식염수[PBS]로 1:1,000으로 희석됨)를 볼텍스하고 현탁액을 커버슬립에 직접 피펫팅합니다. 어두운 환경에서 5-10분 동안 배양한 다음 PBS로 부드럽게 씻으십시오.
3. 현미경 슬라이드에 20μL의 장착 매체를 추가하고 그 위에 커버슬립을 배치하여 기포가 생기지 않도록 합니다. 온도를 4°C로 유지하고 슬라이드를 어두운 곳에 두어 100nm 형광 비드가 있는 슬라이드를 시스템 보정을 위해 준비합니다.
4. pSIM의 경우 형광 비드의 세 가지 다른 단계에 대한 세 가지 이미지를 획득합니다. 사용자 지정 MATLAB 코드(Bead_calib.m)는 이미지를 입력으로 받아 추가 분석을 위해 두 개의 보정 이미지(calib1.tif, calib2.tif)를 출력합니다.
   참고: 앞서⁵에서 설명한 것처럼 pSIM 실험은 대부분의 상용 시스템에서 수행할 수 있습니다. 가정용으로 제작한 현미경 또는 상업용 SIM 현미경에서는 세 가지 패턴 방향 동안 불균일한 조명으로 인해 발생하는 형광 쌍극자의 측정 오류를 제거하기 위해 시스템 보정이 필요합니다. 보정 실험은 형광 비드의 등방성 편광을 가정하며 SIM 수집 중에는 원시 이미지만 필요합니다. 자세한 보정 절차는 원래 작업⁵에 포함되어 있습니다. pSIM 재구성에는 calib1.tif 및 calib2.tif의 두 보정 이미지 출력이 필요하며, 이는 패턴 방향 2의 픽셀별 조명 에너지를 나타냅니다. 도 3은 패턴 방향 1을 나타낸다.

4. 시료 전처리: 고정된 세포에서 액틴

1. 커버슬립을 75% 에탄올에 담그고 커버슬립을 ddH₂O로 3번 헹굽니다. 커버슬립을 6웰 세포 배양 플레이트에 넣습니다.
2. Dulbecco의 Modified Eagle's Medium(DMEM)에서 U2OS 세포(ATCC HTB-96 세포주)를 배양하고 37°C에서 10%(v/v) 소 태아 혈청(FBS)을 보충하고 약 75% 포화도에 도달할 때까지 커버슬립에서 5% CO₂ 를 보충합니다.
3. PBS로 세포를 3번 부드럽게 씻습니다. 세포 고정을 위해 실온에서 15분 동안 4% 파라포름알데히드를 도포합니다. 고정 후 PBS로 세포를 3번 다시 세척합니다.
4. 멤브레인 투과성을 향상시키려면 PBS에 0.1% Triton X-100을 5분 동안 투여한 다음 PBS로 세포를 3배 세척합니다.
5. 형광 팔로이딘을 150μL의 DMSO로 용해시켜 원액(66μM)을 만듭니다. 5μL의 원액을 995μL의 PBS에 희석하여 Phalloidin 염료 작업 용액을 준비합니다. Phalloidin 염료 작업 용액으로 어둠 속에서 세포를 실온에서 ~ 1 시간 동안 배양합니다. PBS로 3 x 3분 동안 세포를 세척합니다.
6. 20μL의 장착 매체를 현미경 슬라이드에 추가합니다. 기포 없이 커버슬립을 슬라이드에 조심스럽게 놓습니다. 슬라이드는 4°C에서 보관하고 어두운 곳에 보관하십시오.

5. 시료 전처리: in-vitro λ-DNA

1. 0.5g의 Poly Methyl Methacrylate를 10mL의 의치 기반 재료에 용해시킵니다. 철저한 용해 후에, 활주의 표면에 해결책을 고르게 적용하고, 필름을 형성하기 위하여 증발할 때까지 그 후에 기다립니다.
2. 0.3 μL의 λ-DNA와 32 μL의 1,000x SYTOX 오렌지 핵산 염색을 968 μL의 PBS에 희석합니다. 준비된 용액 1μL를 슬라이드에 넣고 건조시킵니다.
3. 샘플을 보호하고 보존하기 위해 마운트런트로 커버슬립을 슬라이드에 밀봉합니다. 어두운 환경에서 4°C의 슬라이드를 보관하십시오.

6. 이미징

1. 커버 슬립을 샘플 홀더에 놓고 라이브 모드에서 초점면으로 조정합니다. 512 x 512 픽셀 ROI를 선택하고 노출 시간과 레이저 강도를 조정합니다.
2. 공간 광 변조기의 독립 제어 소프트웨어를 열고 pSIM/3DOM 또는 라이브 모드에 적합한 조명 패턴 시퀀스 경로를 선택합니다.
   참고: pSIM의 경우 조명 패턴에는 세 가지 다른 편광 각도와 세 가지 다른 위상이 포함됩니다. 3DOM의 경우 조명 패턴에는 6개의 서로 다른 편광 각도가 포함됩니다.
3. SIM 캡처 모드를 선택하고, Multi-D Acq.를 선택하고, 시점을 선택하고, 열린 창에서 개수(pSIM 또는 3DOM의 경우 9개 또는 6개 이미지) 및 간격(0ms)을 설정합니다. Acquire!를 클릭합니다.
4. TriggerSLM.bsh(구성 파일은 코드 저장소에 포함되어 있음)를 클릭하면 MyDaq 수집 카드가 공간 광 변조기를 활성화하여 사진을 촬영합니다.

7. pSIM 및 3DOM의 라이브 뷰 플러그인

1. FakeCamera 및 이미지 액세스 경로 구성: Devices(장치MMConfig_FakeCam_demo) | Load Hardware Configuration.... Configure the local directory of images in Devices (장치에서 이미지의 로컬 디렉토리 구성) | 장치 속성 브라우저 ... | 카메라 경로 마스크(그림 2A-C).
   참고: 스크립트의 획득 부분은 하드웨어 설정에 따라 다르므로 데모를 위해 하드 디스크의 로컬 이미지를 읽을 수 있도록 FakeCamera 장치를 사용하는 버전(MMConfig_FakeCam_demo.cfg)을 제공했습니다. 사용자는 버전을 변경할 수 있습니다. 이미지 읽기 경로(Camera-Path 마스크)를 변경하는 것을 잊지 마십시오.
2. Tools (도구) | 빠른 액세스 패널 | 새 패널을 만듭니다. 왼쪽 하단 모서리에 있는 설정 아이콘을 클릭하고 'psim.bsh' 및 '3DOM.bsh'를 로드할 수 있는 상단 부분에 'Run Script' 약물을 클릭합니다(그림 2D).
   참고: 빠른 액세스 패널 시스템을 통해 사용자는 사용자 정의 창을 만들고 가장 자주 필요한 Micro-Manager의 컨트롤에 쉽게 액세스할 수 있습니다. 'Live', 'Snap' 또는 기타 채널도 그림 2D와 같이 추가할 수 있습니다.
3. pSIM을 예로 들어 'psim.bsh'를 클릭하여 실시간 편광 이미지 재구성을 수행합니다. 편광 결과와 함께 실시간으로 재구성된 이미지를 관찰합니다(그림 2E). 'psim.bsh' 파일(calibPath = " 캘리브레이션 이미지 파일 경로")에서 캘리브레이션 이미지 경로를 변경해야 합니다.
   참고: 라이브 뷰 플러그인은 스크립트 패널에서 실행할 수 있는 빈쉘 스크립트(psim.bsh 및 3DOM.bsh)입니다. 플러그인은 pSIM에 대한 9개의 이미지 또는 3DOM에 대한 6개의 이미지를 획득하고 광시야 이미지를 기반으로 방향 매핑 결과를 계산합니다. 방향 매핑 이미지는 실시간 편광 정보를 제공하기 위해 표시되며, 이는 낮은 해상도에도 불구하고 즉각적인 검사를 용이하게 합니다.

8. 초해상도 재구성을 통한 데이터 분석

1. 웹 사이트에서 MATLAB R2019b를 설치합니다( 자료표 참조).
2. 소프트웨어를 엽니다. pSIM 재구성을 위해 3개의 배향 각도 각각에 대해 3개의 서로 다른 위상으로 구성된 9개의 이미지를 얻습니다. 9개 이미지의 이름이 '1.tif'에서 '9.tif' 사이인지 확인하고, 'Input'이라는 파일에 넣고, 'PSIM.m'이라는 프로그램을 실행합니다. 재구성된 광시야 영상, SIM 영상, pSIM 영상을 컬러휠로 관찰합니다.
   참고: pSIM에 대한 재구성에는 SIM 단계와 PM 단계의 두 단계가 필요합니다. 데이터는 더 쉽게 디버깅할 수 있도록 사용자 지정 작성된 MATLAB 프로그램에 의해 분석됩니다. GitHub의 'reconsr' 폴더에서 재구성 코드를 가져옵니다.
3. 3DOM의 경우 6개의 서로 다른 편광 방향 그림을 캡처합니다. 6개의 이미지를 병합하고, 결과 파일의 이름을 'Raw_data.tif'로 지정한 다음, 'Recon_3DOM.m'이라는 이름의 프로그램을 실행합니다. 재구성된 광시야 영상과 3DOM 영상을 방위각 결과와 극각 결과로 관찰합니다.
   참고: 재구성 프로세스 중에 '--'function or variable 'bfopen' is not recognized' 오류가 발생할 수 있습니다. 'BFOpen'은 생체 형식 라이브러리의 함수이며 일반적으로 이미지 파일을 열고 읽는 데 사용됩니다. MATLAB 명령 창에 addpath('path_to_bioformats_toolbox')를 입력합니다. 'path_to_bioformats_toolbox'를 실제 라이브러리 폴더 경로로 바꿉니다. 또한 GitHub 리포지토리에 Bio-Formats 종속성을 추가했습니다.

pSIM 방법은 s-편광 레이저 빔을 사용한 간섭을 기반으로 SIM 현미경에서 수행할 수 있습니다. S-편광 간섭은 가장 널리 사용되는 SIM 유형이며 고대비 조명 스트립을 생성합니다. 현미경 설정의 아카데믹 프로토타입은 pSIM⁵의 원래 작업에 포함되어 있습니다. 그림 1에서 간략하게 소개된 SLM(spatial light modulator)?...

이 연구에서는 pSIM과 3DOM의 두 가지 편광 이미징 기술을 실시간으로 미리 볼 수 있는 플러그인을 개발했습니다. 두 기술 모두 기존 SIM 시스템에서 약간의 수정으로 수행할 수 있습니다. pSIM 및 3DOM 현미경을 설치하고 Micro-Manager를 설정하여 현미경을 제어하고 실시간 편광 결과를 얻는 방법을 시연하는 자세한 단계를 제공했습니다. 실험 결과에는 pSIM으로 이미징된 액틴 필?...

저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

이 작업은 중국 국가 핵심 연구 개발 프로그램(2022YFC3401100)의 지원을 받았습니다.