Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

פיתחנו תוסף Micro-Manager בקוד פתוח, המאפשר תצפית בתצוגה חיה של דיפולים פלואורסצנטיים במיקרוסקופ תאורה מובנה. התוסף תומך בהתבוננות בכיוון דיפול דו-ממדי ותלת-ממדי כאחד.

Abstract

מיקרוסקופ קיטוב פלואורסצנטי (FPM) יכול לדמות את המיקום והכיוון הדיפול של פלואורופורים. למרות ההישגים של מיקרוסקופ קיטוב פלואורסצנטי ברזולוציה גבוהה, ההסתמכות שלהם על לאחר הרכישה מעכבת תצפית בזמן אמת. מיקרוסקופ תאורה מובנה מקוטב (pSIM) מציע הדמיה ברזולוציה גבוהה של דיפולים פלואורסצנטיים עם מהירות הדמיה גבוהה ומתאים היטב ליישומי תאים חיים. פיתחנו יישום קוד פתוח לשחזור בזמן אמת של תמונות קיטוב והצגת הדיפולים הפלואורסצנטיים. בנוסף, הרחבנו את השיטה להשגת מיפוי אוריינטציה תלת מימדי (3DOM), והרחבנו את התועלת שלה למחקרים ביולוגיים מורכבים. יתר על כן, הצגנו מבוא יסודי להרחבת מיקרוסקופ SIM קיים על הדמיית קיטוב וסיפקנו מדריך תצורה מפורט של Micro-Manager 2.0 לשליטה במיקרוסקופ, המאפשר תצוגה מקדימה בזמן אמת של הדמיה מקוטבת. בנוסף, סיפקנו את קוד MATLAB לשחזור מלא המקיף הן את pSIM והן את 3DOM. מדריך מקיף זה נועד לסייע למתחילים לשלוט במהירות ולהתחיל בקלות בפעולות.

Introduction

מיקרוסקופ קיטוב פלואורסצנטי (FPM) התגלה כטכניקה רבת עוצמה להדמיה בו זמנית הן של המיקום והן של כיוון הדיפול של פלואורופורים, ומציעה תובנות עמוקות לגבי הדמיה ביולוגית 1,2. על ידי הקלה על תצפית כיוון על כיווני הביו-מולקולות, FPM חושף את הסידור המורכב של מקרו-מולקולות כגון אקטין 3,4,5, מיקרו-צינורית5, ספטין6, חוט DNA 7-9, קומפלקס נקבוביות גרעיניות10 וחלבוני ממברנה11. היכולות המהירות הגבוהה, הלא פולשניות והתואמות לתאים חיים מאפשרות מעקב אחר דינמיקת סיבוב מולקולרית ברזולוציה זמנית גבוהה11,12. בשילוב עם בדיקות ביו-כוח, FPM לא רק ממפה את גדלי הכוח ברזולוציה תת-תאית אלא גם מודד כיווני כוח, ובכך מקדם את הבנתנו את התהליכים הביומכניים על ידי חשיפת כיוון הכוחות13.

בעשורים האחרונים, מיקרוסקופ קיטוב פלואורסצנטי ברזולוציה גבוהה עבר אבולוציה מהירה. התקדמות בולטת בתחום זה היא מיקרוסקופ לוקליזציה של אוריינטציה של מולקולה אחת, המכונה גם SMOLM, שיכול למקם הן את המיקום והן את הכיוון של פלואורופורים, ובכך לאפשר לוקליזציה רב-ממדית. ניתן לבצע מדידת קיטוב ב-SMOLM באמצעות אפנון עירור קיטוב7, זיהוי מקוטב רב-ערוצי3, או פונקציית התפשטות נקודה רגישה לקיטוב (PSF) 14. למרות ש-SMOLM משיגה רזולוציה מרחבית בסדר גודל של עשרות ננומטר ומודדת את הקיטוב של מולקולות בודדות, היא סובלת מזמן הדמיה ממושך. זאת בשל המחזורים החוזרים ונשנים של מצמוץ פלואורופור ולוקליזציה, המהווים אתגר להדמיה בקצב וידאו ויישומי תאים חיים.

לעומת זאת, מיקרוסקופ תאורה מובנה מקוטב (pSIM) מציע רזולוציה מרחבית של כ-100 ננומטר, יחד עם רכישת מידע קיטוב עם אותו מערך נתונים של SIM. יש לציין כי pSIM יכול להשיג מהירויות הדמיה בקצב וידאו והוא תואם מאוד להדמיית תאים חיים, ללא דרישות מחמירות על מולקולות פלואורסצנטיות. לאחרונה, pSIM חשף בהצלחה את מבנה טבעת האקטין בשלד המחזורי הקשור לממברנה (MPS)5 ואיפשר מיפוי ברזולוציה גבוהה של כוחות ביולוגיים13.

עם זאת, pSIM דורש שחזור תמונה לאחר הרכישה, המונע הדמיה בזמן אמת של תוצאות הקיטוב. עיכוב זה מעכב את התצפית המיידית של תופעות ביולוגיות, ומונע מחוקרים ללכוד במהירות תופעות ביולוגיות מעניינות ולבצע התאמות בזמן אמת לדגימות ולתנאי הדמיה. כדי להתמודד עם מגבלה זו, פיתחנו יישום קוד פתוח המאפשר רכישת תמונות ושחזור והצגה בזמן אמת של תוצאות קיטוב, המבוססות על פלטפורמת ImageJ ו-Micro-Manager (https://github.com/KarlZhanghao/live-pol-imaging).

יתר על כן, בעוד ש-pSIM הוגבל לספק מידע על קיטוב דו-ממדי במישור, הרחבנו לאחרונה את יכולותיו להשיג מיפוי כיוון תלת-ממדי באמצעות כמעט אותו ציוד15, המכונה מיפוי כיוון תלת-ממדי (3DOM). תוכנת קוד פתוח זו מספקת גם שליטה, שחזור והדמיה של 3DOM. מודולי השחזור וההדמיה תואמים גם ליישום מעקב אחר כיוון מולקולה בודדת. כל הפונקציות הללו משפרות את התועלת של הדמיית קיטוב במחקרים ביולוגיים מורכבים.

Protocol

1. הרחבת מיקרוסקופ תאורה מובנה קיים להדמיית קיטוב

  1. הכן מיקרוסקופ SIM.
    הערה: אנו מניחים שלקוראים יש בסיס מסוים בהגדרת מיקרוסקופ וכבר יש להם מיקרוסקופ אור מובנה. אם חסר לך ניסיון רלוונטי, עיין במאמר זה, המספק תיאור מפורט כיצד לבנות מיקרוסקופ SIM16. ניתן להחליף את יחידת בקרת הקיטוב של "HWP+WQP+LCVR" בצלחת גל מערבולת פיצה בעבודת pSIM5 שלנו או בצלחת חצי גל פיצה17.
  2. מדוד יחסי הכחדת קיטוב של שלושה כיווני פסים על ידי טעינת דפוסים שונים על מאפנן אור מרחבי (SLM). הנח וסובב מקטב מיד לאחר המטרה והשתמש במד כוח כדי למדוד את עוצמת הלייזר. עבור pSIM, סובב את לוחית הגל כדי לשמור על קיטוב s של שלושה כיוונים עם יחס הכחדה > 10.
  3. עבור 3DOM, סובב את ה-HWP2 כדי לשמור על קיטוב p של שישה כיוונים. החלף את המסכה המרחבית של ה-SIM במסכה המרחבית 3DOM כדי לאפשר לאלומות מסדר אחד של שישה כיוונים לעבור דרכן (ראה איור 1B).
    הערה: קיטוב s נדרש ב-pSIM ואילו קיטוב p נדרש ב-3DOM. הגדרה מפורטת כלולה במקום אחר עבור pSIM5 ו-3DOM15.

2. הגדרת מיקרו-מנהל

  1. הורד את גרסת Micro-Manager 2.0 מהאתר הרשמי, התקן את התוכנה על ידי ביצוע ההוראות.
  2. הכן את מנהלי ההתקנים והתוכנה המתאימים כדי להתחבר בהצלחה למערכת Micro-Manager. במערכת מיקרוסקופ זו, השתמש במיקרו-מנהל כדי לשלוט במצלמה, שלב התרגום, הלייזר, לוח ה-DAQ והמיקרוסקופ.
    הערה: המכשירים הנתמכים מפורטים ב-https://micro-manager.org/Device_Support. עיין בטבלת החומרים לפרטים על המכשירים שיש לחבר. התקן מנהלי התקנים או תוכנה רשמית/תומכת וחבר את המכשיר למחשב באמצעות כבל USB.
  3. הוסף את המכשירים ל-Micro-Manager באמצעות אשף קביעת תצורת החומרה.
    1. פתח את התוכנה ובחר ללא מהרשימה הנפתחת הראשונית.
    2. בחר מכשירים | אשף קביעת תצורת החומרה... | צור תצורה חדשה ולחץ על הבא כדי להיכנס לדף התצורה.
    3. אתר את התוסף מצלמה / לייזר / שלב / DAQ / מיקרוסקופ ברשימת החומרה הנפתחת ולחץ על הוסף | אישור | הבא.
    4. עבור אל בחר התקני ברירת מחדל ובחר הגדרת תריס אוטומטי. הגדר את מצלמת ברירת המחדל, תריס ברירת המחדל ושלב המיקוד המוגדר כברירת מחדל. לחץ על הבא עד שתגיע לשמירת תצורה ויציאה , ושמור את שם קובץ התצורה. לחץ על סיום.
  4. הגדרות תבנית נפוצות
    1. שמור תבנית עבור מצב חי ומצב הצמדה של SIM.
    2. הגדר את זמן החשיפה ומצב ההפעלה באופן הבא: בחר קבוצה '+' בהגדרות התצורה, תן שם לשם הקבוצה כ'מצב', בחר מצב חשיפה וטריגר, לחץ על אישור.
    3. בחר Preset '+' כדי להוסיף קביעות מוגדרות מראש שונות עבור הקבוצה 'Mode'. תן שם להגדרה מוגדרת מראש אחת 'חי' עבור הגדרות חשיפה במצב חי, ו-'SIM' אחר למצב SIM. לדוגמה, במצב 'חי', הגדר את זמן החשיפה ל-15 אלפיות השנייה, ואילו עבור מצב הצמדת SIM, הגדר 10 אלפיות השנייה לזמן החשיפה ומצב ההדק הוא סטנדרטי (חפיפה).
      הערה: קובץ תצורה (MMConfig_psim_demo.cfg) כלול במאגר הקוד שלנו, אותו ניתן לטעון ישירות על ידי Micro-Manager 2.0.

3. כיול מערכת עם חרוזים פלואורסצנטיים

  1. טבלו את הכיסויים באתנול 75%, שטפו את הכיסויים פי 3 במים נטולי יונים (ddH2O) וייבשו אותם.
  2. מערבולת את חרוזי הפלואורסצנט של 100 ננומטר (מדולל ל-1:1,000 עם מי מלח חוצצים פוספט [PBS]) ופיפטה את המתלה ישירות על החלקות הכיסוי. יש לדגור במשך 5-10 דקות בסביבה חשוכה, ולאחר מכן לשטוף בעדינות עם PBS.
  3. הוסף 20 מיקרוליטר של אמצעי הרכבה על שקופית המיקרוסקופ, ומקם את הכיסוי מעליו, הקפד להימנע מבועות. שמור על הטמפרטורה על 4 מעלות צלזיוס ושמור על המגלשה בחושך, כך שהמגלשה עם חרוזי פלורסנט של 100 ננומטר מוכנה לכיול המערכת.
  4. עבור pSIM, רכשו שלוש תמונות של שלושת השלבים השונים של חרוזים פלואורסצנטיים. קוד MATLAB מותאם אישית (Bead_calib.m) לוקח את התמונות כקלט ומוציא שתי תמונות כיול (calib1.tif, calib2.tif) להמשך ניתוח.
    הערה: כפי שהודגם קודם לכן5, ניתן לבצע את ניסוי ה-pSIM ברוב המערכות המסחריות. במיקרוסקופי SIM ביתיים או מסחריים, נדרש כיול מערכת כדי למנוע את שגיאת המדידה של דיפולים פלואורסצנטיים, הנגרמת על ידי תאורה לא אחידה במהלך שלושה כיווני תבנית. ניסוי הכיול מניח את הקיטוב האיזוטרופי של חרוזים פלואורסצנטיים ודורש רק את התמונות הגולמיות במהלך רכישת ה-SIM. נוהל כיול מפורט כלול בעבודה המקורית שלנו5. הפלט של שתי תמונות כיול calib1.tif ו-calib2.tif נדרש לשחזור pSIM, המציין את אנרגיית התאורה הפיקסלית של כיוון התבנית 2; 3 מתייחס לכיוון התבנית 1.

4. הכנת דגימה: אקטין בתאים קבועים

  1. טבלו את הכיסויים ב-75% אתנול, שטפו את הכיסויים פי 3 עם ddH2O. הניחו את הכיסויים בצלחת תרבית תאים עם שש בארות.
  2. תרבית תאי U2OS (קו תאים ATCC HTB-96) במדיום הנשר המותאם (DMEM) של Dulbecco בתוספת 10% (v/v) סרום בקר עוברי (FBS) ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 על תלושי כיסוי עד שהם מגיעים לכ-75% מפגש.
  3. שטפו בעדינות את התאים פי 3 עם PBS. לקיבוע תאים, יש למרוח 4% פרפורמלדהיד למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הקיבוע יש לשטוף את התאים שוב פי 3 עם PBS.
  4. כדי לשפר את חדירות הממברנה, טפל בתאים עם 0.1% Triton X-100 ב-PBS למשך 5 דקות, ולאחר מכן שטוף את התאים פי 3 עם PBS.
  5. ממיסים פלואורסצנטי פלואורסצנטי עם 150 מיקרוליטר של DMSO לתמיסת מלאי (66 מיקרומטר). הכן את תמיסת העבודה של צבע הפאלודין על ידי דילול 5 מיקרוליטר מתמיסת המלאי ב-995 מיקרוליטר של PBS. דגרו על התאים בחושך עם תמיסת עבודה של צבע פלואידין בטמפרטורת החדר למשך ~1 שעה. שוטפים את התאים למשך 3 x 3 דקות עם PBS.
  6. הוסף 20 מיקרוליטר של מדיום הרכבה על שקופית המיקרוסקופ. הנח בזהירות את הכיסוי על המגלשה ללא בועות. אחסן את השקופית בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס ושמור אותה במקום חשוך.

5. הכנת דגימה: λ-DNA במבחנה

  1. ממיסים 0.5 גרם פולי מתיל מתאקרילט ב-10 מ"ל של חומרי בסיס תותבות. לאחר פירוק יסודי, יש למרוח את התמיסה באופן שווה על פני השקופית, ולאחר מכן להמתין עד שהיא תתאדה ליצירת סרט.
  2. לדלל 0.3 מיקרוליטר של λ-DNA ו-32 מיקרוליטר של 1,000x SYTOX כתם חומצת גרעין כתום ב-968 מיקרוליטר של PBS. הוסף 1 מיקרוליטר מהתמיסה המוכנה לשקופית והניח לה להתייבש.
  3. אטום את הכיסוי על המגלשה עם התושבת כדי להגן ולשמור על הדגימה. אחסן את השקופית בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס בסביבה חשוכה.

6. הדמיה

  1. הנח את הכיסוי על הדגימה מחזיק והתאם למישור המוקד במצב חי. בחר החזר ROI של 512 x 512 פיקסלים והתאם את זמן החשיפה ועוצמת הלייזר.
  2. פתח את תוכנת הבקרה העצמאית של מאפנן האור המרחבי, ובחר את נתיב רצף דפוס התאורה המתאים עבור pSIM / 3DOM או מצב חי.
    הערה: עבור pSIM, דפוס התאורה כולל שלוש זוויות קיטוב שונות ושלושה שלבים שונים. עבור 3DOM, דפוס התאורה כולל שש זוויות קיטוב שונות.
  3. בחר את מצב לכידת ה-SIM , בחר Multi-D Acq., בחר נקודות זמן והגדר את הספירה (9 או 6 תמונות עבור pSIM או 3DOM) ואת המרווח (0 אלפיות השנייה) בחלון הפתוח. לחץ על Acquire!
  4. לחץ על TriggerSLM.bsh (קובץ תצורה כלול במאגר הקוד שלנו), כרטיס הרכישה של MyDaq מפעיל את אפנן האור המרחבי כדי לצלם את התמונות.

7. תוסף תצוגה חיה של pSIM ו-3DOM

  1. הגדר את נתיב הגישה ל-FakeCamera ולתמונה: טען את ה-scrip (MMConfig_FakeCam_demo.cfg) על ידי לחיצה על התקנים | טען תצורת חומרה.... הגדר את הספרייה המקומית של תמונות בהתקנים | דפדפן נכסי מכשירים... | מסיכת נתיב מצלמה (איור 2A-C).
    הערה: חלק הרכישה של הסקריפט תלוי בהגדרת החומרה, לכן סיפקנו גרסה (MMConfig_FakeCam_demo.cfg) המשתמשת בהתקן FakeCamera כדי לקרוא תמונות מקומיות בדיסק הקשיח לצורך הדגמה. משתמשים יכולים לבצע שינויים בגרסה שלנו. זכור לשנות את נתיב קריאת התמונה (מסיכת נתיב מצלמה).
  2. הגדר את לוח הגישה המהירה על ידי לחיצה על כלים | פנל לגישה מהירה | צור חלונית חדשה. לחץ על סמל ההגדרות בפינה השמאלית התחתונה, תרופה 'הפעל סקריפט' לחלק העליון, שיכול לטעון את 'psim.bsh' ו-'3DOM.bsh' (איור 2D).
    הערה: מערכת לוח הגישה המהירה מאפשרת למשתמשים ליצור חלונות מותאמים אישית ולגשת בקלות לפקדים ב-Micro-Manager, הדרושים בתדירות הגבוהה ביותר. ניתן להוסיף גם 'חי', 'הצמד' או ערוצים אחרים , כפי שמוצג באיור 2D.
  3. אם ניקח את pSIM כדוגמה, בצע שחזור תמונת קיטוב בזמן אמת על ידי לחיצה על 'psim.bsh'; התבונן בתמונות המשוחזרות בזמן אמת עם תוצאות קיטוב (איור 2E). זכור לשנות את נתיב תמונות הכיול בקובץ 'psim.bsh' (calibPath = " נתיב לקובץ תמונות כיול").
    הערה: תוסף התצוגה החיה הוא סקריפט beanshell (psim.bsh ו-3DOM.bsh), שניתן להריץ בלוח הסקריפטים. התוסף רוכש תשע תמונות עבור pSIM או שש תמונות עבור 3DOM ומחשב את תוצאות מיפוי הכיוון על סמך תמונות השדה הרחב. תמונות מיפוי הכיוון מוצגות כדי לספק מידע קיטוב בזמן אמת, מה שמקל על בדיקה מיידית, למרות הרזולוציה הנמוכה שלו.

8. ניתוח נתונים עם שחזור ברזולוציה גבוהה

  1. התקן את MATLAB R2019b מהאתר (ראה טבלת החומרים).
  2. פתח את התוכנה; לשחזור pSIM, השג תשע תמונות, המורכבות משלושה שלבים שונים עבור כל אחת משלוש זוויות הכיוון. ודא ששמות תשע התמונות הם מ-'1.tif' עד '9.tif', הכנס אותן לקובץ בשם 'קלט' והפעל את התוכנית בשם 'PSIM.m'. התבונן בתמונת השדה הרחב, תמונת ה-SIM ותמונת ה-pSIM המשוחזרת באמצעות גלגל הצבעים.
    הערה: השחזור של pSIM דורש שני שלבים: שלב SIM וצעד PM. הנתונים מנותחים על ידי תוכנת MATLAB הכתובה בהתאמה אישית לאיתור באגים קל יותר. קבל את קוד השחזור מתיקיית 'reconsr' ב- GitHub.
  3. עבור 3DOM, צלמו שישה דמויות שונות של כיווני קיטוב. מיזגו את שש התמונות יחד, תנו לקובץ המתקבל את השם 'Raw_data.tif', והריצו את התוכנית בשם 'Recon_3DOM.m'. התבונן בתמונת השדה הרחב המשוחזרת ובתמונת 3DOM עם תוצאות אזימוטליות ותוצאות הזווית הקוטבית.
    הערה: במהלך תהליך השחזור, עלולה להתרחש שגיאה' --'פונקציה או משתנה 'bfopen' אינם מזוהים. 'bfopen' היא פונקציה בספריית הפורמטים הביולוגיים והיא משמשת בדרך כלל לפתיחה וקריאה של קבצי תמונה. הזן addpath ('path_to_bioformats_toolbox') בחלון הפקודה של MATLAB. החלף את 'path_to_bioformats_toolbox' בנתיב תיקיית הספרייה בפועל. הוספנו גם את התלות ב-Bio-Formats למאגר GitHub.

תוצאות

ניתן לבצע את שיטת ה-pSIM במיקרוסקופי SIM המבוססים על ההפרעה באמצעות קרני לייזר מקוטבות s. הפרעות קיטוב s הן סוג ה- SIM הנפוץ ביותר ויוצרות פסי תאורה בעלי ניגודיות גבוהה. אב הטיפוס האקדמי של מערך מיקרוסקופ נכלל בעבודה המקורית של pSIM5. הוצג בקצרה

Discussion

במחקר שלנו, פיתחנו תוסף המאפשר תצוגה מקדימה בזמן אמת של שתי טכניקות הדמיית קיטוב, pSIM ו-3DOM. ניתן לבצע את שתי הטכנולוגיות במערכת SIM קיימת עם שינוי קל. סיפקנו את השלבים המפורטים להתקנת מיקרוסקופ pSIM ו-3DOM והקמנו את Micro-Manager כדי לשלוט במיקרוסקופ ולהדגים כיצד להשיג את תוצאות הקיטו...

Disclosures

המחברים מצהירים שאין ניגודי אינטרסים.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי תוכנית המחקר והפיתוח הלאומית של סין (2022YFC3401100).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
100 nm Fluorescent beadsInvitrogenF8801
4% Formaldehyde solutionInvitrogenR37814
CameraTucsenDhyana 400BSI V3https://www.tucsen.com/download-software/
Denture base materials (Type I Thermally setting type, liquid)New Century DentalN/A
Dulbecco’s Modified Eagle’s MediumGibcoC11995500BT
Eclipse TE2000 Inverted MicroscopeNikonTE2000 E
Fetal Bovine SerumGibco10099141C
MATLAB R2019bMathWorksVersion R2019bhttps://ww2.mathworks.cn/downloads/
MetroCon V4.0KopinVersion 4.0Software of Spatial light modulator
Micro-Manager 2.0μΜanagerVersion 2.0Download Micro-Manager Latest Release
MS-2000 XYZ Automated StageApplied Scientific InstrumentationMIM3https://www.asiimaging.com/support/downloads/usb-support-on-ms-2000-wk-controllers/
myDAQNational Instruments781325-01Software and Driver Downloads - NI
OBIS 561 nm LS 20 mW LaserCoherent1325777
Phalloidin-AF568InvitrogenA12380
Phosphate buffered salineCorning21-040-CV
Poly Methyl MethacrylateSolarbioM9810
ProLong DiamondInvitrogenP36980
Spatial light modulatorKopinSXGA-12
SYTOX orange nucleic acid stainInvitrogenS11368
Triton X-100InvitrogenHFH10
TrypsinGibco25200056
λ-DNAInvitrogenS11368

References

  1. Zhanghao, K., Gao, J., Jin, D., Zhang, X., Xi, P. Super-resolution fluorescence polarization microscopy. J Innov Opt Health Sci. 11 (01), 1730002 (2018).
  2. Alonso, M. A., Brasselet, S. Polarization microscopy: from ensemble structural imaging to single-molecule 3D orientation and localization microscopy. Optica. 10 (11), 1486-1510 (2023).
  3. Valades Cruz, C. A., et al. Quantitative nanoscale imaging of orientational order in biological filaments by polarized superresolution microscopy. Pro Natl Acad Sci USA. 113 (7), E820-E828 (2016).
  4. Zhanghao, K., et al. Super-resolution dipole orientation mapping via polarization demodulation. Light Sci Appli. 5 (10), e16166 (2016).
  5. Zhanghao, K., et al. Super-resolution imaging of fluorescent dipoles via polarized structured illumination microscopy. Nat Commun. 10 (1), 4694 (2019).
  6. Vrabioiu, A. M., Mitchison, T. J. Structural insights into yeast septin organization from polarized fluorescence microscopy. Nature. 443 (7110), 466-469 (2006).
  7. Backer, A. S., Lee, M. Y., Moerner, W. E. Enhanced DNA imaging using super-resolution microscopy and simultaneous single-molecule orientation measurements. Optica. 3 (6), 659-666 (2016).
  8. Backer, A. S., et al. Single-molecule polarization microscopy of DNA intercalators sheds light on the structure of S-DNA. Sci Adv. 5 (3), eaav1083 (2019).
  9. Hulleman, C. N., et al. Simultaneous orientation and 3D localization microscopy with a Vortex point spread function. Nat Commun. 12 (1), 5934 (2021).
  10. Kampmann, M., Atkinson, C. E., Mattheyses, A. L., Simon, S. M. Mapping the orientation of nuclear pore proteins in living cells with polarized fluorescence microscopy. Nat Struct Mol Biol. 18 (6), 643-649 (2011).
  11. Lazar, J., Bondar, A., Timr, S., Firestein, S. J. Two-photon polarization microscopy reveals protein structure and function. Nat Methods. 8 (8), 684-690 (2011).
  12. Dong, B., et al. Parallel Three-Dimensional Tracking of Quantum Rods Using Polarization-Sensitive Spectroscopic Photon Localization Microscopy. ACS Photonics. 4 (7), 1747-1752 (2017).
  13. Blanchard, A., et al. Turn-key mapping of cell receptor force orientation and magnitude using a commercial structured illumination microscope. Nat Commun. 12 (1), 4693 (2021).
  14. Toprak, E., et al. Defocused orientation and position imaging (DOPI) of myosin V. Proc Natl Acad Sci USA. 103 (17), 6495-6499 (2006).
  15. Zhong, S., et al. Three-dimensional dipole orientation mapping with high temporal-spatial resolution using polarization modulation. PhotoniX. 5 (1), 12 (2024).
  16. Young, L. J., Ströhl, F., Kaminski, C. F. A Guide to Structured Illumination TIRF Microscopy at High Speed with Multiple Colors. J Vis Exp. (111), e53988 (2016).
  17. Huang, X., et al. long-term, super-resolution imaging with Hessian structured illumination microscopy. Nat Biotechnol. 36 (5), 451-459 (2018).
  18. Ando, R., et al. StayGold variants for molecular fusion and membrane-targeting applications. Nat Methods. 21 (4), 648-656 (2024).
  19. Hirano, M., et al. A highly photostable and bright green fluorescent protein. Nat Biotechnol. 40 (7), 1132-1142 (2022).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

FPMPSIM3DOMSIMMATLAB

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved