蛍光双極子のライブビューイメージングのためのオープンソースのMicro-Managerプラグイン

オープンソースのMicro-Managerプラグインを開発し、構造化照明顕微鏡で蛍光双極子のライブビュー観察を可能にしました。このプラグインは、2Dと3Dの両方の双極子向きの観測をサポートしています。

蛍光偏光顕微鏡(FPM)は、蛍光色素の位置と双極子配向を画像化できます。超解像蛍光偏光顕微鏡の成果にもかかわらず、取得後への依存がリアルタイム観察を妨げています。偏光構造化照明顕微鏡(pSIM)は、蛍光双極子の超解像イメージングを高速に行え、生細胞アプリケーションに最適です。私たちは、偏光画像のリアルタイム再構成と蛍光双極子の表示のためのオープンソースの実装を開発しました。さらに、3D方位マッピング(3DOM)を達成するために手法を拡張し、複雑な生物学的研究への有用性を広げました。さらに、既存のSIMマイクロスコープを偏光イメージングに拡張する方法を徹底的に紹介し、マイクロスコープを制御するためのMicro-Manager 2.0の詳細な構成ガイドを提供し、偏光イメージングのリアルタイムプレビューを可能にしました。さらに、pSIMと3DOMの両方を網羅する完全な再構成のためのMATLABコードを提供しています。この包括的なガイドは、初心者が操作をすばやく習得し、簡単に開始できるように支援することを目的としています。

蛍光偏光顕微鏡(FPM)は、蛍光色素の位置と双極子の配向の両方を同時にイメージングするための強力な技術として登場し、生物学的イメージング^1,2に深い洞察を提供しています。FPMは、生体分子の配向の方向観察を容易にすることにより、アクチン^3,4,5、微小管⁵、セプチン⁶、DNAフィラメント^7-9、核孔複合体¹⁰、膜タンパク質¹¹などの高分子の複雑な配列を明らかにします.その高速、非侵襲的、および生細胞互換の機能により、高い時間分解能^11,12で分子回転ダイナミクスの追跡が可能になります。バイオフォースプローブと統合すると、FPMは細胞内分解能で力の大きさをマッピングするだけでなく、力の方向も測定し、力の方向を明らかにすることで生体力学的プロセスの理解を進める¹³。

過去数十年で、超解像蛍光偏光顕微鏡法は急速な進化を遂げました。この分野での注目すべき進歩は、SMOLMとも呼ばれる単一分子配向局在化顕微鏡法であり、蛍光色素の位置と配向の両方を局在化できるため、多次元の局在化が可能になります。SMOLMでの偏光測定は、偏光励起変調⁷、マルチチャネル偏光検出³、または工学的偏光感受性点像分布関数(PSF)¹⁴を使用して実行できます。SMOLMは数十ナノメートルオーダーの空間分解能を達成し、単一分子の分極を測定するにもかかわらず、イメージング時間が長くなるという課題があります。これは、蛍光色素の点滅と局在化の繰り返しサイクルによるもので、ビデオレートイメージングや生細胞アプリケーションには課題となっています。

対照的に、偏光構造化照明顕微鏡(pSIM)は、最大約100nmの空間分解能を提供し、同じSIMデータセットで偏光情報を取得することができます。特に、pSIMはビデオレートのイメージング速度を達成でき、蛍光分子に厳しい要件を課すことなく、生細胞イメージングと高い互換性があります。最近、pSIMは膜関連周期骨格(MPS)⁵ のアクチン環構造を明らかにすることに成功し、生体力の超解像マッピングを可能にしました¹³。

しかし、pSIMは取得後の画像再構成を必要とするため、偏光結果をリアルタイムで可視化することができません。この遅延は、生命現象の即時観察を妨げ、研究者が関心のある生物学的現象を迅速に捉え、サンプルやイメージング条件をリアルタイムで調整することを妨げます。この制限に対処するために、ImageJおよびMicro-Managerプラットフォーム(https://github.com/KarlZhanghao/live-pol-imaging)に基づいて、画像取得と偏光結果のリアルタイム再構成および表示を容易にするオープンソースの実装を開発しました。

また、pSIMはこれまで2次元面内偏波情報の提供に限られていましたが、最近では、3DOM(3D Orientation Mapping)と呼ばれるほぼ同じ機器¹⁵を用いて3D方位マッピングを実現する機能を拡張しました。このオープンソースソフトウェアは、3DOMの制御、再構築、および視覚化も提供します。再構成モジュールと可視化モジュールは、単一分子配向追跡アプリケーションとも互換性があります。これらすべての機能により、複雑な生物学的研究における偏光イメージングの有用性が向上します。

1. 既存の構造化照明顕微鏡を偏光イメージング用に拡張

1. SIMマイクロスコープを準備します。
   注:読者は顕微鏡のセットアップに一定の基礎があり、すでに構造化された光学顕微鏡を所有していることを前提としています。関連する経験がない場合は、SIMマイクロスコープ^{の構築方法16}について詳しく説明したこのホワイトペーパーを参照してください。「HWP+WQP+LCVR」の偏波制御ユニットは、当社のpSIMワーク⁵ ではピザ渦波板、またはピザ半波板¹⁷に置き換えることができる。
2. 空間光変調器(SLM)に異なるパターンをロードすることにより、3つのストライプ方向の偏光消光比を測定します。対物レンズの直後に偏光子を配置して回転させ、パワーメーターを使用してレーザー出力を測定します。pSIMの場合、波長板を回転させて、消光比が10>3方向のs偏光を維持します。
3. 3DOM の場合、HWP2 を回転させて 6 方向の p 偏光を維持します。SIM 空間マスクを 3DOM 空間マスクに置き換えて、6 方向の 1 次ビームが通過できるようにします ( 図 1B を参照)。
   注:pSIMではS偏波が必要であり、3DOMではP偏波が必要です。pSIM⁵ と 3DOM¹⁵ の詳細なセットアップは、他の場所に含まれています。

2. Micro-Managerのセットアップ

1. 公式WebサイトからMicro-Manager 2.0バージョンをダウンロードし、指示に従ってソフトウェアをインストールします。
2. Micro-Managerシステムに正常に接続するために、対応するデバイスドライバーとソフトウェアを準備します。この顕微鏡システムでは、Micro-Managerを使用して、カメラ、並進ステージ、レーザー、DAQボード、顕微鏡を制御します。
   注意: サポートされている機器は https://micro-manager.org/Device_Support に記載されています。接続する機器の詳細については、材料表 を参照してください。ドライバーまたは公式/サポートソフトウェアをインストールし、USBケーブルを使用して機器をコンピューターに接続します。
3. ハードウェア構成ウィザードを使用して、装置をMicro-Managerに追加します。
   1. ソフトウェアを開き、最初のドロップダウンリストから [なし ]を選択します。
   2. デバイスの選択 |ハードウェア構成ウィザード... |新しい設定を作成し、[次へ] をクリックして設定ページに入ります。
   3. ドロップダウンハードウェアリストでカメラ/レーザー/ステージ/ DAQ/顕微鏡プラグインを見つけて、[ 追加]をクリックします|わかりました |次へ。
   4. [デフォルトのデバイスを選択]に移動し、自動シャッター設定を選択します。デフォルトのカメラ、デフォルトのシャッター、デフォルトのフォーカスステージを設定します。[Save configuration and exit] に到達するまで [Next] をクリックし、設定ファイルの名前を保存します。「終了」をクリックします。
4. 一般的なテンプレート設定
   1. ライブモードとSIMスナップモードのテンプレートを保存します。
   2. 露光時間とトリガーモードを次のように設定します:構成設定でグループ「+」を選択し、グループ名に「モード」という名前を付けて、露出とトリガーモードを選択して、[OK]をクリックします。
   3. プリセット「+」を選択して、「モード」グループに異なるプリセットを追加します。ライブモードの露出設定には1つのプリセットに「live」、SIMモードにはもう1つのプリセットに「SIM」という名前を付けます。たとえば、「ライブ」モードでは露光時間を15ミリ秒に設定し、SIMスナップモードの場合は露光時間を10ミリ秒に設定し、トリガーモードは標準(オーバーラップ)に設定します。
      注:設定ファイル(MMConfig_psim_demo.cfg)はコードリポジトリに含まれており、Micro-Manager 2.0で直接ロードできます。

3. 蛍光ビーズによるシステムキャリブレーション

1. カバーガラスを75%エタノールに浸し、脱イオン水(ddH₂O)でカバーガラスを3回すすぎ、乾燥させます。
2. 100 nmの蛍光ビーズ(リン酸緩衝生理食塩水[PBS]で1:1,000に希釈)をボルテックスし、懸濁液をカバーガラスに直接ピペットで移します。暗所で5〜10分間インキュベートした後、PBSでやさしく洗浄します。
3. 顕微鏡スライドに20 μLの封入剤を加え、気泡を避けながらカバースリップをその上に置きます。温度を4°Cに保ち、スライドを暗所に置いておくと、100 nmの蛍光ビーズが入ったスライドがシステムキャリブレーション用に準備されます。
4. pSIMの場合、蛍光ビーズの3つの異なるフェーズの3つの画像を取得します。カスタム MATLAB コード (Bead_calib.m) は、イメージを入力として受け取り、さらに解析するために 2 つのキャリブレーション イメージ (calib1.tif、calib2.tif) を出力します。
   注:前述の⁵で示したように、pSIMの実験はほとんどの商用システムで実行できます。自作または市販のSIM顕微鏡では、3パターン方向の不均一な照明によって引き起こされる蛍光双極子の測定誤差を排除するために、システムキャリブレーションが必要です。キャリブレーション実験では、蛍光ビーズの等方性偏光を前提としており、SIM取得中には生の画像のみが必要です。詳細なキャリブレーション手順は、当社のオリジナル作品^{に含まれています 5}.pSIMの再構成には、calib1.tifとcalib2.tifの2つのキャリブレーション画像の出力が必要であり、これはパターン方向2のピクセル単位の照明エネルギーを示します。3はパターン方向1を指す。

4.サンプル調製:固定細胞内のアクチン

1. カバースリップを75%エタノールに浸し、カバースリップをddH₂Oで3回すすぎ、カバースリップを6ウェル細胞培養プレートに入れる。
2. U2OS細胞(ATCC HTB-96細胞株)をダルベッコ改変イーグルス培地(DMEM)で培養し、37°Cで10%(v/v)ウシ胎児血清(FBS)を添加し、カバースリップ上で5%CO₂ を約75%のコンフルエントに達するまで培養します。
3. 細胞をPBSで3回優しく洗浄します。細胞固定には、4%パラホルムアルデヒドを室温で15分間適用します。固定後、PBSで細胞を再度3回洗浄します。
4. 膜透過性を高めるには、0.1% Triton X-100をPBS溶液で5分間処理し、その後、PBSで細胞を3回洗浄します。
5. 蛍光ファロイジンを150μLのDMSO溶液(66μM)に溶解します。Phalloidin色素ワーキング溶液を調製するには、ストック溶液5 μLをPBS995 μLで希釈します。暗所で細胞をファロイジン色素ワーキング溶液と室温で~1時間インキュベートします。細胞をPBSで3 x 3分間洗浄します。
6. 20 μLの封入剤を顕微鏡スライドに加えます。カバースリップを気泡が入らないようにスライドに慎重に置きます。スライドは4°Cで保管し、暗い場所に保管してください。

5. サンプル調製:in-vitro λ-DNA

1. 0.5 gのポリメチルメタクリレートを10 mLの義歯ベース材料に溶解します。完全に溶解した後、溶液をスライドの表面に均一に塗布し、蒸発して膜を形成するのを待ちます。
2. 0.3 μL の λ-DNA と 32 μL の 1,000x SYTOX Orange Nucleic Acid Stain を 968 μL の PBS で希釈します。調製した溶液1μLをスライドに加え、乾燥させます。
3. カバーガラスを封入剤でスライドに密封し、サンプルを保護および保存します。スライドは暗所で4°Cで保管してください。

6. イメージング

1. カバースリップをサンプルホルダーに置き、ライブモードで焦点面に調整します。512 x 512ピクセルのROIを選択し、露光時間とレーザー強度を調整します。
2. 空間光変調器の独立した制御ソフトウェアを開き、pSIM / 3DOMまたはライブモードの適切な照明パターンシーケンスパスを選択します。
   注:pSIMの場合、照明パターンには3つの異なる偏光角度と3つの異なる位相が含まれます。3DOMの場合、照明パターンには6つの異なる偏光角度が含まれています。
3. SIMキャプチャモードを選択し、Multi-D Acq.を選択し、Time Pointsを選択し、開いているウィンドウでカウント(pSIMまたは3DOMの場合は9または6枚の画像)と間隔(0ミリ秒)を設定します。[取得] をクリックします。
4. TriggerSLM.bsh(設定ファイルはコードリポジトリに含まれています)をクリックすると、MyDaq取得カードが空間光変調器をアクティブにして写真を撮ります。

7. pSIMと3DOMのライブビュープラグイン

1. FakeCameraと画像のアクセスパスを設定しますMMConfig_FakeCam_demo:デバイス|ハードウェア構成の読み込み....デバイスのイメージのローカルディレクトリを構成します|Devices プロパティ ブラウザ |カメラ パス マスク (図 2A-C)。
   注:スクリプトの取得部分はハードウェアのセットアップに依存するため、 FakeCamera デバイスを使用してハードディスク上のローカル画像を読み取るバージョン(MMConfig_FakeCam_demo.cfg)を提供しました。ユーザーはバージョンに変更を加えることができます。画像の読み取りパス(カメラパスマスク)を変更することを忘れないでください。
2. クイックアクセスパネルを設定するには、[ツール] |クイックアクセスパネル |新しいパネルを作成します。左下隅にある[設定]アイコンをクリックし、[スクリプトの実行]を上部に配置して、「psim.bsh」と「3DOM.bsh」をロードできます(図2D)。
   注意: クイックアクセスパネル システムを使用すると、ユーザーはカスタマイズされたウィンドウを作成し、最も頻繁に必要とされるMicro-Managerのコントロールに簡単にアクセスできます。「ライブ」、「スナップ」、またはその他のチャネルも追加できます 、 図2Dに示すように。
3. pSIMを例にとると、「psim.bsh」をクリックしてリアルタイムの偏波画像の再構築を実行します。偏光結果とともにリアルタイムで再構成された画像を観察します(図2E)。'psim.bsh' ファイルのキャリブレーション画像のパスを変更することを忘れないでください (calibPath = " キャリブレーション画像ファイルへのパス)。
   注: ライブビュープラグインは、 スクリプトパネルで実行できる Bean シェルスクリプト (psim.bsh および 3DOM.bsh) です。プラグインは、pSIM用に9つの画像、または3DOM用に6つの画像を取得し、広視野画像に基づいて向きマッピング結果を計算します。方位マッピング画像が表示され、リアルタイムの偏光情報が得られるため、解像度が低いにもかかわらず、すぐに検査できます。

8. 超解像再構成によるデータ解析

1. MATLAB R2019b を Web サイトからインストール します (資料の表を参照)。
2. ソフトウェアを開きます。pSIM再構成では、3つの方位角のそれぞれについて3つの異なる位相からなる9つの画像を取得します。9 つのイメージの名前が '1.tif' から '9.tif' であることを確認し、それらを 'Input' という名前のファイルに入れて、'PSIM.m' という名前のプログラムを実行します。再構成された広視野画像、SIM画像、pSIM画像をカラーホイールで観察します。
   注: pSIM の再構築には、SIM ステップと PM ステップの 2 つのステップが必要です。データは、デバッグを容易にするために、カスタムメイドのMATLABプログラムによって解析されます。GitHub の 'reconsr' フォルダから再構築コードを取得します。
3. 3DOM の場合、6 つの異なる偏光方向の図形をキャプチャします。6つの画像を結合し、結果のファイルに「Raw_data.tif」という名前を付けて、「Recon_3DOM.m」という名前のプログラムを実行します。再構成された広視野画像と3DOM画像、方位角の結果、極角の結果を観察します。
   注:再構築プロセス中に、「関数または変数「bfopen」が認識されません」というエラーが発生する可能性があります。「bfopen」はBio-formatsライブラリの関数で、画像ファイルを開いたり読み込んだりするために一般的に使用されます。MATLAB コマンド ウィンドウに addpath ('path_to_bioformats_toolbox') を入力します。'path_to_bioformats_toolbox' を実際のライブラリフォルダパスに置き換えます。また、Bio-Formats の依存関係を GitHub リポジトリに追加しました。

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著者は、利益相反を宣言しません。

この研究は、中国の国家重点研究開発プログラム(2022YFC3401100)の支援を受けました。