用于荧光偶极子实时成像的开源 Micro-Manager 插件

我们开发了一个开源的 Micro-Manager 插件，它可以在结构照明显微镜上实时观察荧光偶极子。该插件支持观察 2D 和 3D 偶极子方向。

荧光偏振显微镜 （FPM） 可以对荧光团的位置和偶极子方向进行成像。尽管超分辨率荧光偏振显微镜取得了成就，但它们对采集后的依赖阻碍了实时观察。偏振结构照明显微镜 （pSIM） 以快速的成像速度提供荧光偶极子的超分辨率成像，非常适合活细胞应用。我们开发了一种开源实现，用于实时重建偏振图像和显示荧光偶极子。此外，我们扩展了该方法以实现 3D 取向映射 （3DOM），拓宽了其在复杂生物学研究中的适用性。此外，我们还全面介绍了如何在偏振成像上扩展现有 SIM 显微镜，并提供了 Micro-Manager 2.0 的详细配置指南来控制显微镜，从而实现偏振成像的实时预览。此外，我们还提供了用于完全重建的 MATLAB 代码，包括 pSIM 和 3DOM。本综合指南旨在帮助初学者快速掌握并轻松上手作。

荧光偏振显微镜 （FPM） 已成为一种强大的技术，可同时对荧光团的位置和偶极子方向进行成像，为生物成像提供了深刻的见解 ^1,2。通过促进生物分子方向的定向观察，FPM 揭示了大分子的复杂排列，例如肌动蛋白 ^3,4,5、微管⁵、septin⁶、DNA 丝 ^7-9、核孔复合物¹⁰ 和膜蛋白 ¹¹.其高速、无创和活细胞兼容能力允许以高时间分辨率跟踪分子旋转动力学^11,12。当与 bioforce 探针集成时，FPM 不仅可以以亚细胞分辨率绘制力的大小，还可以测量力的方向，从而通过揭示力的方向来推进我们对生物力学过程的理解¹³。

在过去的几十年里，超分辨率荧光偏振显微镜经历了快速发展。该领域的一个显着进步是单分子取向定位显微镜，也称为 SMOLM，它可以定位荧光团的位置和方向，从而实现多维定位。SMOLM 中的极化测量可以使用偏振激发调制⁷、多通道极化检测³ 或工程偏振敏感点扩散函数 （PSF） ¹⁴ 进行。尽管 SMOLM 实现了数十纳米量级的空间分辨率并测量了单个分子的极化，但它的成像时间较长。这是由于荧光团闪烁和定位的重复循环，这对视频速率成像和活细胞应用构成了挑战。

相比之下，偏振结构照明显微镜 （pSIM） 提供大约 100 nm 的空间分辨率，并且使用相同的 SIM 数据集采集偏振信息。值得注意的是，pSIM 可以达到视频速率的成像速度，并且与活细胞成像高度兼容，对荧光分子没有严格的要求。最近，pSIM 成功揭示了膜相关周期骨架 （MPS） 中的肌动蛋白环结构⁵ ，并实现了生物力量的超分辨率映射¹³。

然而，pSIM 需要采集后图像重建，这阻碍了偏振结果的实时可视化。这种延迟阻碍了对生物现象的即时观察，使研究人员无法快速捕获感兴趣的生物现象并实时调整样品和成像条件。为了解决这一限制，我们开发了一种开源实现，基于 ImageJ 和 Micro-Manager 平台 （https://github.com/KarlZhanghao/live-pol-imaging） 促进了图像采集和实时重建和显示偏振结果。

此外，虽然 pSIM 仅限于提供 2D 面内极化信息，但我们最近扩展了其功能，使用几乎相同的设备¹⁵ 实现 3D 取向映射，称为 3D 取向映射 （3DOM）。该开源软件还提供 3DOM 的控制、重建和可视化。重建和可视化模块还与单分子取向跟踪应用程序兼容。所有这些功能都增强了偏振成像在复杂生物学研究中的实用性。

1. 扩展现有的结构照明显微镜以进行偏振成像

1. 准备 SIM 显微镜。
   注意：我们假设读者在显微镜设置方面有一定的基础，并且已经拥有结构光显微镜。如果您缺乏相关经验，请参阅本文，其中详细介绍了如何构建 SIM 显微镜¹⁶。“HWP+WQP+LCVR”的偏振控制单元可以替换为我们的 pSIM 工作⁵ 中的披萨涡流波片或披萨半波片¹⁷。
2. 通过在空间光调制器 （SLM） 上加载不同的图案来测量三个条纹方向的偏振消光比。在物镜后放置并旋转偏振器，并使用功率计测量激光功率。对于 pSIM，旋转波片以保持三个方向的 s 偏振，消光比> 10。
3. 对于 3DOM，旋转 HWP2 以保持六个方向的 p 极化。将 SIM 空间掩码替换为 3DOM 空间掩码，以允许六个方向的 1 阶光束通过（参见 图 1B）。
   注意：pSIM 需要 s 极化，而 3DOM 需要 p 极化。pSIM⁵ 和 3DOM¹⁵ 的详细设置包含在其他位置。

2. Micro-Manager 设置

1. 从官网下载 Micro-Manager 2.0 版本，按照说明安装软件。
2. 准备相应的设备驱动程序和软件，以成功连接到 Micro-Manager 系统。在该显微镜系统中，使用 Micro-Manager 控制相机、平移台、激光器、DAQ 板和显微镜。
   注：https://micro-manager.org/Device_Support 中列出了支持的仪器。有关要连接的仪器的详细信息，请参阅材料表 。安装驱动程序或官方/支持软件，并使用 USB 数据线将仪器连接到计算机。
3. 使用 硬件配置向导将仪器添加到 Micro-Manager。
   1. 打开软件并选择 无 从初始下拉列表中。
   2. 选择 设备 |硬件配置向导 |创建新配置 ，然后单击 下一步 进入配置页面。
   3. 在下拉硬件列表中找到 Camera / Laser / Stage / DAQ/ microscope 插件，然后单击 Add |确定 |下一步。
   4. 转到 选择默认设备 ，然后选择 自动快门设置。设置 Default camera、Default shutter 和 Default focus stage。单击 Next（下一步 ），直到到达 Save configuration and exit（保存配置并退出 ），然后保存配置文件名。单击 Finish。
4. 常用模板设置
   1. 保存实时模式和 SIM 卡对齐模式的模板。
   2. 设置曝光时间和触发模式如下：在配置设置中选择 Group ' +'，将组名称命名为 'Mode'，选择 Exposure and Trigger Mode，点击 OK。
   3. 选择 预设 '+' 为 '模式' 组添加不同的预设。将一个预设命名为“实时”用于实时模式曝光设置，将另一个预设命名为“SIM”用于 SIM 模式。例如，在“实时”模式下，将曝光时间设置为 15 毫秒，而对于 SIM 卡捕捉模式，将曝光时间设置为 10 毫秒，触发模式为标准（重叠）。
      注意：我们的代码仓库中包含一个配置文件 （MMConfig_psim_demo.cfg），可以通过 Micro-Manager 2.0 直接加载。

3. 使用荧光微珠进行系统校准

1. 将盖玻片浸入 75% 乙醇中，用去离子水 （ddH₂O） 冲洗盖玻片 3 次，然后干燥。
2. 涡旋 100 nm 荧光珠（用磷酸盐缓冲盐水 [PBS] 稀释至 1：1,000）并将悬浮液直接移液到盖玻片上。在黑暗环境中孵育 5-10 分钟，然后用 PBS 轻轻洗涤。
3. 在显微镜载玻片上加入 20 μL 封固剂，将盖玻片放在上面，确保避免任何气泡。将温度保持在 4 °C 并将载玻片保持在黑暗中，因此制备带有 100 nm 荧光珠的载玻片用于系统校准。
4. 对于 pSIM，获取荧光珠的三个不同阶段的三个图像。自定义 MATLAB 代码 （Bead_calib.m） 将图像作为输入，并输出两个校准图像 （calib1.tif、calib2.tif） 以供进一步分析。
   注意：如前所述^5，pSIM 实验可以在大多数商业系统上进行。在自制或商用 SIM 显微镜上，都需要进行系统校准，以消除荧光偶极子的测量误差，这是由三个图案方向的不均匀照明引起的。校准实验假设荧光珠的各向同性极化，并且只需要 SIM 采集期间的原始图像。详细的校准程序包含在我们的原始工作⁵ 中。pSIM 重建需要两个校准图像 calib1.tif 和 calib2.tif 的输出，它表示图案方向 2 的像素照明能量;3 是指阵列方向 1。

4. 样品制备：固定细胞中的肌动蛋白

1. 将盖玻片浸入 75% 乙醇中，用 ddH₂O 冲洗盖玻片 3 次。将盖玻片放入六孔细胞培养板中。
2. 在补充有 10% （v/v） 胎牛血清 （FBS） 的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基 （DMEM） 中培养 U2OS 细胞（ATCC HTB-96 细胞系），在 37 °C 和 5% CO₂ 盖玻片上，直至它们达到约 75% 汇合。
3. 用 PBS 轻轻洗涤细胞 3 次。对于细胞固定，在室温下施用 4% 多聚甲醛 15 分钟。固定后，再次用 PBS 洗涤细胞 3 次。
4. 为了增强膜通透性，用 PBS 中的 0.1% Triton X-100 处理细胞 5 分钟，然后用 PBS 洗涤细胞 3 次。
5. 用 150 μL DMSO 溶解荧光鬼笔环肽，用于储备液 （66 μM）。通过在 995 μL PBS 中稀释 5 μL 储备液来制备鬼笔环肽染料工作溶液。在室温下用鬼笔环肽染料工作溶液在黑暗中孵育细胞 ~1 小时。用 PBS 洗涤细胞 3 x 3 分钟。
6. 在显微镜载玻片上添加 20 μL 封固剂。小心地将盖玻片放在载玻片上，不要有任何气泡。将载玻片储存在 4 °C 并保存在黑暗的地方。

5. 样品制备：体外 λ-DNA

1. 将 0.5 g 聚甲基丙烯酸甲酯溶解在 10 mL 义齿基托材料中。充分溶解后，将溶液均匀地涂在载玻片表面，然后等待其蒸发形成薄膜。
2. 在 968 μL PBS 中稀释 0.3 μL λ-DNA 和 32 μL 1,000x SYTOX Orange 核酸染料。向玻片中加入 1 μL 制备好的溶液，并使其干燥。
3. 用封固剂将盖玻片密封在载玻片上，以保护和保存样品。将载玻片储存在 4 °C 的黑暗环境中。

6. 成像

1. 将盖玻片放在样品架上，并在实时模式下调整到焦平面。选择 512 x 512 像素的 ROI 并调整曝光时间和激光强度。
2. 打开空间光调制器的独立控制软件，为 pSIM / 3DOM 或实时模式选择合适的照明图案序列路径。
   注意：对于 pSIM，照明模式包括三个不同的偏振角和三个不同的相位。对于 3DOM，照明模式包括六个不同的偏振角。
3. 选择 SIM 卡捕获模式，选择 Multi-D Acq.，选择 时间点 ，并在打开的窗口中设置 计数 （pSIM 或 9 6 张图像为 3 张图像）和 间隔 （0 ms）。单击 Acquire！
4. 点击 TriggerSLM.bsh （配置文件包含在我们的代码仓库中），MyDaq 采集卡激活空间光调制器拍照。

7. pSIM 和 3DOM 的实时取景插件

1. 配置 FakeCamera 和图像访问路径：通过单击加载脚本 （MMConfig_FakeCam_demo.cfg） 设备 |加载硬件配置...在 设备 |设备 属性浏览器... |相机路径掩码（图 2A-C）。
   注意：脚本的采集部分取决于硬件设置，因此我们提供了一个版本 （MMConfig_FakeCam_demo.cfg） 使用 FakeCamera 设备读取硬盘上的本地图像进行演示。用户可以在我们的版本中进行更改。请记住更改图像读取路径 （Camera-Path mask）。
2. 通过单击工具 |快速访问面板 |创建新面板。单击左下角的“设置”图标，将“运行脚本”添加到顶部，可以加载“psim.bsh”和“3DOM.bsh”（图 2D）。
   注意： 快速访问面板 系统使用户能够创建自定义窗口并轻松访问 Micro-Manager 中的控件，这是最经常需要的。也可以添加 'Live'、'Snap' 或其他通道，如图 2D 所示。
3. 以 pSIM 为例，点击“psim.bsh”进行实时偏振图像重建;观察具有偏振结果的实时重建图像（图 2E）。请记住更改 'psim.bsh' 文件中的校准图像路径 （calibPath = “ 校准图像文件的路径”）。
   注意：实时视图插件是一个 beanshell 脚本（psim.bsh 和 3DOM.bsh），可以在 “脚本面板”中运行。该插件为 pSIM 获取 9 张图像，为 3DOM 获取 6 张图像，并根据宽视场图像计算方向映射结果。显示方向映射图像以提供实时偏振信息，尽管分辨率较低，但便于立即检查。

8. 超分辨率重建数据分析

1. 从网站安装 MATLAB R2019b（参见 材料表）。
2. 打开软件;对于 pSIM 重建，获得 9 张图像，由三个取向角中每个相位的三个不同相位组成。确保 9 张图像的名称从 1.tif 到 9.tif，将它们放入名为 'Input' 的文件中，然后运行名为 'PSIM.m' 的程序。用色轮观察重建的宽场图像、SIM 图像和 pSIM 图像。
   注意：pSIM 的重建需要两个步骤：SIM 步骤和 PM 步骤。数据由自定义编写的 MATLAB 程序进行分析，以便于调试。从 GitHub 中的 'reconsr' 文件夹获取 reconstruct 代码。
3. 对于 3DOM，捕获 6 个不同的偏振方向数字。将 6 张图像合并在一起，将生成的文件命名为 'Raw_data.tif'，然后运行名为 'Recon_3DOM.m' 的程序。观察重建的宽场图像和 3DOM 图像，其中包含方位角结果和极角结果。
   注意：在重建过程中，可能会出现错误'--'无法识别函数或变量'bfopen''。'bfopen' 是 bio-formats 库中的一个函数，通常用于打开和读取图像文件。在 MATLAB 命令窗口中输入 addpath （'path_to_bioformats_toolbox'）。将 'path_to_bioformats_toolbox' 替换为实际的库文件夹路径。我们还将 Bio-Formats 依赖项添加到 GitHub 存储库中。

pSIM 方法可以基于使用 s 偏振激光束的干涉在 SIM 显微镜上执行。S 偏振干涉是使用最广泛的 SIM 类型，可产生高对比度的照明条纹。显微镜设置的学术原型包含在 pSIM⁵ 的原始工作中。 如图 1 中简要介绍，空间光调制器 （SLM） 产生 ±1 级衍射光束，而披萨半波片保持三个方向的 s 偏振。虽然其他 SIM 替代方?...

在我们的研究中，我们开发了一个插件，可以实时预览两种偏振成像技术，pSIM 和 3DOM。这两种技术都可以在现有的 SIM 系统中执行，只需稍作修改。我们提供了安装 pSIM 和 3DOM 显微镜并设置 Micro-Manager 以控制显微镜并演示如何获得实时取景偏振结果的详细步骤。实验结果包括 pSIM 成像的肌动蛋白丝和 3DOM 成像的 λ-DNA。鬼笔环肽偶极子的方向大致平行于肌动蛋白丝的方向?...

作者声明没有利益冲突。

这项工作得到了国家重点研发计划 （2022YFC3401100） 的支持。