Оценка механизма применения традиционного травяного сиропа для лечения анемии с использованием метаболомики печени

Это исследование в первую очередь знакомит с применением метаболомики печени в изучении эффективности сиропа Ши-Лю-Бу-Сюэ в лечении анемии.

Как известное уйгурское лекарство, сироп Ши-Лю-Бу-Сюэ (SLBXS) широко используется для лечения анемии в Китае уже более 20 лет. Тем не менее, основные механизмы его эффективности в лечении анемии остаются неясными. В этом исследовании метаболомика печени в первую очередь использовалась для определения потенциальных регуляторных механизмов SLBXS при лечении анемии. Было проведено профилирование метаболомики печени для характеристики механизма действия SLBXS в мышиной модели анемии, индуцированной ацетилфенилгидразином. Было показано, что SLBXS снижает индекс печени, количество лейкоцитов и количество тромбоцитов, одновременно увеличивая количество эритроцитов, гемоглобина и гематокрита. Основные мишени были выбраны для верификации с помощью вестерн-блоттинга. SLBXS продемонстрировал значительный терапевтический эффект при анемии, в первую очередь, за счет регуляции метаболизма галактозы и сигнального пути HIF-1, о чем свидетельствует подавление белков HIF-1α, NOS3, VEGFA и GLA в тканях печени анемичных мышей. Это исследование проясняет потенциальные регуляторные механизмы метаболизма печени при введении SLBXS при лечении анемии.

Анемия является насущной и распространенной глобальной проблемой здравоохранения, затрагивающей 25% населения мира и людей всех возрастов, особенно подростков и беременных женщин ^1,2,3. Он связан с повышенным риском преждевременных родов и материнской смертности и может привести к нарушениям физического развития и нарушению сердечно-сосудистой деятельности⁴. Это состояние также может негативно сказаться на состоянии здоровья подростков, приводя к инфекциям и сердечной недостаточности⁵. Современные методы лечения в основном включают переливание крови, добавки железа и терапию эритропоэтином. Тем не менее, эти методы лечения имеют недостатки и неблагоприятные побочные эффекты, такие как анафилаксия, расстройство желудочно-кишечного тракта, перегрузка железом и крапивница^. Поэтому определение эффективных препаратов с меньшим количеством побочных эффектов для лечения анемии имеет решающее значение.

Традиционная китайская медицина, в том числе уйгурская, предлагает ряд преимуществ, таких как многокомпонентные составы, многоцелевые эффекты, многозвенные взаимодействия и меньшее количество побочных эффектов в профилактике и лечении многофакторных заболеваний. Сироп Ши-Лю-Бу-Сюэ (SLBXS) является известным традиционным средством в уйгурской медицине, используемым для тонизирования крови и производства крови. Он признан препаратом, регулирующим кровь, который может снизить температуру печени и был включен в рекомендации по клиническому использованию препаратов меньшинств для лечения анемии. Он также лицензирован Китайским государственным управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (Z20026094)^6,7,8. За последние два десятилетия SLBXS широко использовался в Китае для лечения заболеваний, связанных с анемией. Тем не менее, его потенциальные механизмы лечения анемии остаются неизвестными и требуют дальнейшего изучения. Метаболомика, изучающая динамические метаболические реакции биологических систем на болезни, лекарственные вмешательства^{или условия окружающей} среды, все чаще используется для выяснения механизмов действия традиционной китайской медицины путем оценки изменений метаболических биомаркеров в биологических образцах ^{после внешних} стимулов^.

Соответственно, в этом исследовании был принят подход к метаболомике печени для определения основных терапевтических механизмов SLBXS при лечении анемии. Во-первых, была создана мышиная модель анемии, индуцированная ацетилфенилгидразином (APH). Затем были исследованы метаболические пути эндогенных метаболитов с использованием метаболомики печени с помощью газовой хромато-масс-спектрометрии (ГХ-МС) и методов многомерных данных после введения SLBXS. Наконец, ключевые мишени были проанализированы экспериментально, чтобы выяснить антианемические эффекты и молекулярные механизмы SLBXS.

Все экспериментальные процедуры были одобрены Комитетом по этике лабораторных животных Хубэйского университета китайской медицины (HBUCMS201912015). Самцов мышей C57BL/6 (вес 20-22 г) содержали в специальном помещении, свободном от патогенов, с относительной влажностью 50%-60% и температурой 22 °C ± 2 °C, подвергали 12-часовому световому/12-часовому темному циклу и обеспечивали свободный доступ к пище и воде. Перед началом эксперимента всем мышам дали одну неделю на акклиматизацию к окружающей среде. Мыши были случайным образом распределены в одну из следующих четырех групп (n = 12): контрольная, модельная, сироп Fu-Fang-E-Jiao (FFEJS, положительный препарат, вводимый внутрижелудочно в дозе 7,8 мл/кг) и SLBXS (вводимый внутрижелудочно в дозе 11,7 мл/кг). Мыши в контрольной и модельной группах получали равные объемы физиологического раствора. Мышам во всех группах вводили соответствующие препараты внутрижелудочно один раз в сутки в течение 2 недель. Подробная информация о лекарственных препаратах, реактивах и оборудовании, использованных в этом исследовании, приведена в Таблице материалов.

1. Установление модели анемии у мышей

1. Взвесьте 2 г ацетилфенилгидразина (АПГ) с помощью электронных весов и переложите его в стакан объемом 150 мл. Добавьте 100 мл физиологического раствора и перемешайте стеклянной палочкой до полного растворения APH.
2. Устанавливают мышиную модель анемии путем подкожного введения 2% АПГ, приготовленного на шаге 1.1, на^1-й,^4-й и^7-й дни в дозах 200 мг/кг, 100 мг/кг и 100 мг/кг соответственно11.
   Примечание: Начиная с первого дня, мышам в группах FFEJS (7,8 мл/кг) и SLBXS (11,7 мл/кг) вводили внутрижелудочное введение один раз в день в течение 2 недель. Мыши в контрольной и модельной группах получали равные объемы физиологического раствора один раз в день в течение 2 недель.

2. Определение печеночного индекса

1. В конце эксперимента взвесьте каждую мышь с помощью электронных весов.
2. Обезболите мышей, вдыхая 2% изофлуран. Сожмите глазное яблоко мыши, чтобы оно стало гиперемированным и выступающим. Быстро удалите глазное яблоко с помощью щипцов и соберите кровь в гепаринизированные пробирки для образцов.
3. Закрепите мышей под наркозом из шага 2.2 на пластине для хирургических манипуляций.
4. Сделайте скальпелем полный разрез по средней линии живота. Тщательно препарируйте и изолируйте неповрежденную ткань печени¹², затем измерьте ее вес с помощью электронных весов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Индекс печени каждой мыши рассчитывается по следующей формуле: Индекс печени = масса печени/масса тела.

3. Гематологический анализ

1. Осторожно встряхните пробирку, содержащую образец гепаринизированной крови, начиная с шага 2.2, чтобы предотвратить свертывание крови.
2. Поместите образец крови под иглу для инъекций, чтобы убедиться, что она полностью погружена в иглу.
3. Нажмите кнопку «Автоматическое обнаружение », чтобы измерить количество эритроцитов (RBC), гематокрита (HCT), количество лейкоцитов (WBC), гемоглобина (HGB) и количество тромбоцитов (PLT) с помощью полностью автоматического анализатора гемоцитов.

4. Исследование метаболомики печени

1. Подготовка образцов печени
   1. Гомогенизируйте образцы тканей печени (50 мг) на этапе 2.4 1 мл предварительно охлажденного метанола. Центрифугируйте при давлении 18 759 x g в течение 10 минут при 4 °C для удаления осадка.
   2. Перелейте 200 мкл надосадочной жидкости во флакон с образцом с помощью пипетки и вакуумируйте в сублимационной сушилке при температуре 35 °C в течение 2 часов.
   3. Провести реакцию на высушенных образцах с 40 мкл 40 мг/мл раствора метоксиамина гидрохлорида в пиридине в течение 90 мин при 30 °С. Затем добавьте 80 мкл N-метил-N-(триметилсилил)трифторацетамида (MSTFA) с 1% триметилхлорсиланом (TMCS) и инкубируйте в течение 60 минут при 37 °C.
   4. Добавьте в флакон 10 мкл н-гексана, чтобы завершить реакцию дериватизации.
2. Метаболический анализ печени
   1. Анализируйте дериватизированные образцы (1 μл) с помощью системы ГХ-МС. Отделить производные с помощью капиллярной колонки DB-5MS (30 м × 0,25 мм × 0,25 мкм).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Условия программы температуры печи были установлены следующим образом: 60 °C в течение 1 мин; увеличить до 325 °C со скоростью 10 °C/мин и выдержать в течение 10 мин. Температура инжектора, источника ионов и MS была установлена на 250 °C, 230 °C и 150 °C соответственно. В качестве газа-носителя использовался гелий (99,999%) с расходом 1,1 мл/мин, а коэффициент разделения был установлен на 10:1. Использовалась энергия электронного пучка 70 эВ и время задержки растворителя 5,9 мин.
3. Обработка и анализ данных
   1. Получение и преобразование необработанных данных GC-MS с помощью совместимого программного обеспечения MassHunter.
   2. Проведение спектрального анализа с использованием инструмента Автоматизированная масс-спектральная система деконволюции и идентификации (AMDIS)¹².
   3. Определите все метаболиты с помощью баз данных NIST и HMDB (см. Таблицу материалов).
   4. Импортируйте данные в инструмент MetaboAnalyst для частичного дискриминантного анализа по методу наименьших квадратов (PLS-DA), t-критериев, анализа путей и сетевого анализа¹².

5. Вестерн-блоттинг

1. Извлекайте общее количество белков из ткани печени мыши
   1. Добавьте 50 мг ткани печени с шага 2.4 и 250 мкл клеточного лизата в стеклянный гомогенизатор объемом 1 мл и измельчите на льду в течение 5 минут.
   2. Перенесите гомогенат ткани печени с этапа 5.1.1 в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл с помощью пипеттора и центрифугируйте при 18 759 x g в течение 10 мин при 4 °C. Затем перенесите надосадочную жидкость в новую пробирку объемом 1,5 мл с помощью пипеттора.
2. Определение концентраций белка и предварительная обработка образцов белка
   1. Добавьте 2 мкл надосадочной жидкости из стадии 5.1.2, 18 мкл PBS и 180 мкл рабочего раствора BCA в 96-луночный микротитровальный планшет⁸.
   2. Покачайте пластину на осцилляторе в течение 30 с, оставьте на 30 мин при температуре 37 °C и определите поглощение на длине волны 562 нм с помощью считывателя микропланшетов.
3. Отделите общее количество белков с помощью SDS-PAGE, перенесите на мембраны из поливинилиденфторида и заблокируйте 5% обезжиренного молока⁸.
4. Инкубируйте мембраны с этапа 5.3 с первичными антителами против HIF-1α (1:1000), VEGFA (1:1000), GLA (1:1000), NOS3 (1:1000) и β-актина (1:5000) в течение ночи при 4 °C.
5. Поместите мембраны из этапа 5.4 в инкубационный бокс для антител, добавьте 10 мл TBST и горизонтально встряхните при 111 x g при комнатной температуре, чтобы смыть несвязанные первичные антитела три раза в течение 5 мин каждый.
6. Добавьте по 200 мкл козьего антикроличьего IgG (H + L)-HRP (1:1000) в каждую мембрану с шага 5,5 и инкубируйте в течение 2 ч при комнатной температуре. Затем повторите шаг 5.5, чтобы смыть несвязанное вторичное антитело (козий антикроличий IgG (H + L)-HRP).
7. Добавьте 200 мкл сверхвысокочувствительного хемилюминесцентного раствора ECL на поверхность каждой мембраны из шага 5.6 и немедленно визуализируйте белковые полосы с помощью автоматической системы анализа хемилюминесценции.

6. Статистический анализ

1. Анализируйте данные с помощью статистического и графического программного обеспечения с односторонним ANOVA с последующим тестом Тьюки.
2. Представьте результаты в виде среднего значения ± стандартного отклонения (SD) и примите значение P, < 0,05, как статистически значимое.

Для подтверждения успешного создания мышиной модели анемии и анализа влияния SLBXS на анемию сначала были исследованы индекс печени и гематологические показатели. На рисунке 1 показано, что в модельной группе наблюдалось значительное снижение (P < 0,01

Анемия является распространенным заболеванием, поражающим многих людей во всем мире, особенно в развивающихся странах¹. В Китае пациенты часто используют традиционную китайскую медицину, в том числе уйгурскую, для облегчения признаков и симптомов анеми?...

Авторам нечего раскрывать.

Эта работа была поддержана Специальным планом обучения талантов в области науки и техники из числа меньшинств, Фондом естественных наук Синьцзян-Уйгурского автономного района (2020D03021), Фондами ключевой программы по традиционной китайской медицине Хубэйского университета китайской медицины (2022ZZXZ004) и Программой инновационной группы Тяньшаня (2020D14030).