Valutazione del meccanismo di uno sciroppo a base di erbe tradizionale per il trattamento dell'anemia utilizzando la metabolomica epatica

Questo studio introduce principalmente l'applicazione della metabolomica epatica nello studio dell'efficacia dello sciroppo Shi-Liu-Bu-Xue nel trattamento dell'anemia.

Come noto medicinale uiguro, lo sciroppo Shi-Liu-Bu-Xue (SLBXS) è stato ampiamente utilizzato per trattare l'anemia in Cina per oltre 20 anni. Tuttavia, i meccanismi alla base della sua efficacia nel trattamento dell'anemia rimangono poco chiari. In questo studio, la metabolomica epatica è stata impiegata principalmente per determinare i potenziali meccanismi regolatori di SLBXS nel trattamento dell'anemia. La profilazione metabolomica epatica è stata condotta per caratterizzare il meccanismo d'azione di SLBXS in un modello murino di anemia indotta da acetilfenilidrazina. È stato dimostrato che SLBXS riduce l'indice epatico, la conta dei globuli bianchi e la conta piastrinica, aumentando al contempo la conta dei globuli rossi, l'emoglobina e i livelli di ematocrito. Gli obiettivi principali sono stati selezionati per la verifica utilizzando il Western blotting. SLBXS ha dimostrato un effetto terapeutico significativo sull'anemia principalmente regolando il metabolismo del galattosio e la via di segnalazione HIF-1, come indicato dalla sottoregolazione delle proteine HIF-1α, NOS3, VEGFA e GLA nei tessuti epatici di topi anemici. Questo studio chiarisce i potenziali meccanismi regolatori del metabolismo epatico mediante somministrazione di SLBXS nel trattamento dell'anemia.

L'anemia è un problema di salute globale urgente e diffuso, che colpisce il 25% della popolazione mondiale e le persone di tutte le età, in particolare gli adolescenti e le donne in gravidanza ^1,2,3. È associato a un aumento del rischio di travaglio pretermine e di mortalità materna e può portare a disturbi dello sviluppo fisico e a una compromissione delle prestazioni cardiovascolari⁴. Questa condizione può anche avere un impatto negativo sullo stato di salute degli adolescenti, con conseguenti infezioni e insufficienza cardiaca⁵. I trattamenti attuali includono principalmente la trasfusione di sangue, l'integrazione di ferro e la terapia con eritropoietina. Tuttavia, questi trattamenti presentano svantaggi ed effetti collaterali negativi, come anafilassi, disturbi gastrointestinali, sovraccarico di ferro e orticaria¹. Pertanto, è fondamentale identificare farmaci efficaci con meno effetti collaterali per il trattamento dell'anemia.

La medicina tradizionale cinese, compresa la medicina uigura, offre diversi vantaggi, come formulazioni multi-ingrediente, effetti multi-target, interazioni multi-link e meno effetti collaterali nella prevenzione e nel trattamento delle malattie multifattoriali. Lo sciroppo Shi-Liu-Bu-Xue (SLBXS) è un notevole agente tradizionale della medicina uigura utilizzato per i tonici del sangue e la produzione di sangue. È riconosciuto come un farmaco regolatore del sangue che può ridurre il calore del fegato ed è stato incluso nelle linee guida per l'uso clinico di farmaci minoritari per il trattamento dell'anemia. È inoltre autorizzato dalla Food and Drug Administration (Z20026094) dello Stato ^cinese6,7,8. Negli ultimi due decenni, SLBXS è stato ampiamente utilizzato in Cina per trattare le condizioni legate all'anemia. Tuttavia, i suoi potenziali meccanismi per il trattamento dell'anemia rimangono sconosciuti e richiedono ulteriori indagini. La metabolomica, che esamina le risposte metaboliche dinamiche dei sistemi biologici a malattie, interventi farmacologici o condizioni ambientali⁹, è sempre più utilizzata per chiarire i meccanismi d'azione della medicina tradizionale cinese valutando i cambiamenti nei biomarcatori metabolici in campioni biologici a seguito di stimoli esterni ^9,10.

Di conseguenza, in questo studio è stato adottato un approccio di metabolomica epatica per determinare i meccanismi terapeutici sottostanti di SLBXS nel trattamento dell'anemia. In primo luogo, è stato stabilito un modello murino di anemia indotta da acetilfenilidrazina (APH). Successivamente, le vie metaboliche dei metaboliti endogeni sono state studiate utilizzando la metabolomica epatica con gascromatografia-spettrometria di massa (GC-MS) e metodi di dati multivariati dopo la somministrazione di SLBXS. Infine, i bersagli chiave sono stati analizzati sperimentalmente per chiarire gli effetti anti-anemici e i meccanismi molecolari di SLBXS.

Tutte le procedure sperimentali sono state approvate dal Comitato Etico degli Animali da Laboratorio dell'Università di Medicina Cinese di Hubei (HBUCMS201912015). I topi maschi C57BL/6 (peso 20-22 g) sono stati alloggiati in una stanza specifica priva di agenti patogeni con un'umidità relativa del 50%-60% e una temperatura di 22 °C ± 2 °C, sottoposti a un ciclo di 12 ore luce/12 ore di buio e dotati di libero accesso a cibo e acqua. Prima dell'inizio dell'esperimento, a tutti i topi è stata concessa una settimana per acclimatarsi all'ambiente. I topi sono stati assegnati in modo casuale a uno dei seguenti quattro gruppi (n = 12): controllo, modello, sciroppo Fu-Fang-E-Jiao (FFEJS, un farmaco positivo, somministrato per via intragastrica a 7,8 ml/kg) e SLBXS (somministrato per via intragastrica a 11,7 ml/kg). I topi nei gruppi di controllo e modello hanno ricevuto volumi uguali di soluzione salina. Ai topi di tutti i gruppi è stata somministrata la somministrazione intragastrica dei farmaci corrispondenti una volta al giorno per 2 settimane. I dettagli dei farmaci, dei reagenti e delle attrezzature utilizzate in questo studio sono elencati nella Tabella dei materiali.

1. Istituzione di un modello di anemia nei topi

1. Pesare 2 g di acetilfenilidrazina (APH) utilizzando una bilancia elettronica e trasferirlo in un becher da 150 mL. Aggiungere 100 ml di soluzione salina e mescolare con una bacchetta di vetro fino a quando l'APH non è completamente sciolto.
2. Stabilire il modello murino di anemia iniettando per via sottocutanea il 2% di APH come preparato al passaggio 1.1 il 1^°, 4° e 7^{° giorno a} dosaggi di 200 mg/kg, 100 mg/kg e 100 mg/kg, rispettivamente ¹¹.
   NOTA: A partire dal primo giorno, ai topi dei gruppi FFEJS (7,8 ml/kg) e SLBXS (11,7 ml/kg) è stata somministrata una volta al giorno per 2 settimane. I topi nei gruppi di controllo e modello hanno ricevuto volumi uguali di soluzione salina una volta al giorno per 2 settimane.

2. Determinazione dell'indice epatico

1. Al termine dell'esperimento, pesare ogni topo utilizzando una bilancia elettronica.
2. Anestetizzare i topi inalando isoflurano al 2%. Stringi il bulbo oculare dei topi per renderlo iperemico e sporgente. Rimuovere rapidamente il bulbo oculare con una pinza e raccogliere il sangue in provette per campioni eparinizzate.
3. Fissare i topi anestetizzati dal passaggio 2.2 a una piastra di manipolazione chirurgica.
4. Fai un'incisione completa lungo la linea mediana dell'addome con un bisturi. Sezionare e isolare con cura il tessuto epatico intatto¹², quindi misurarne il peso con una bilancia elettronica.
   NOTA: L'indice epatico di ciascun topo viene calcolato utilizzando la seguente formula: Indice epatico = peso epatico/peso corporeo.

3. Analisi ematologiche

1. Agitare delicatamente la provetta contenente il campione di sangue eparinizzato dal passaggio 2.2 per prevenire la coagulazione del sangue.
2. Posizionare il campione di sangue sotto l'ago per iniezione per assicurarsi che sia completamente immerso nell'ago.
3. Fare clic sul pulsante Rilevamento automatico per misurare la conta dei globuli rossi (RBC), l'ematocrito (HCT), la conta dei globuli bianchi (WBC), i livelli di emoglobina (HGB) e la conta piastrinica (PLT) utilizzando un analizzatore di emociti completamente automatico.

4. Studio di metabolomica epatica

1. Preparazione di campioni di fegato
   1. Omogeneizzare i campioni di tessuto epatico (50 mg) dalla fase 2.4 con 1 mL di metanolo pre-raffreddato. Centrifugare a 18,759 x g per 10 minuti a 4 °C per eliminare il precipitato.
   2. Trasferire 200 μl di surnatante in una fiala di campione utilizzando una pipetta e asciugare sotto vuoto in un liofilizzatore a 35 °C per 2 ore.
   3. Far reagire i campioni essiccati con 40 μL di una soluzione da 40 mg/mL di metossiammina cloridrato in piridina per 90 minuti a 30 °C. Quindi, aggiungere 80 μl di N-metil-N-(trimetilsilil)trifluoroacetammide (MSTFA) con l'1% di trimetilclorosilano (TMCS) e incubare per 60 minuti a 37 °C.
   4. Aggiungere 10 μL di n-esano alla fiala per terminare la reazione di derivatizzazione.
2. Analisi metabolica epatica
   1. Analizzare i campioni derivatizzati (1 μL) utilizzando un sistema GC-MS. Separare i derivati utilizzando una colonna capillare DB-5MS (30 m × 0,25 mm × 0,25 μm).
      NOTA: Le condizioni del programma di temperatura del forno sono state impostate come segue: 60 °C per 1 min; aumentare a 325 °C a una velocità di 10 °C/min e mantenere per 10 minuti. Le temperature dell'iniettore, della sorgente ionica e della MS sono state impostate rispettivamente a 250 °C, 230 °C e 150 °C. L'elio (99,999%) è stato utilizzato come gas di trasporto a una velocità di flusso di 1,1 mL/min e il rapporto di divisione è stato impostato su 10:1. Sono stati utilizzati un'energia del fascio di elettroni di 70 eV e un tempo di ritardo del solvente di 5,9 minuti.
3. Elaborazione e analisi dei dati
   1. Acquisisci e converti i dati grezzi GC-MS utilizzando il software MassHunter compatibile.
   2. Condurre analisi spettrali utilizzando lo strumento AMDIS (Automated Mass Spectral Deconvolution and Identification System)¹².
   3. Identificare tutti i metaboliti utilizzando i database NIST e HMDB (vedi Tabella dei materiali).
   4. Importa i dati nello strumento MetaboAnalyst per l'analisi discriminante dei minimi quadrati parziali (PLS-DA), i test t, l'analisi dei percorsi e l'analisi delle reti¹².

5. Analisi del Western blot

1. Estrarre le proteine totali dal tessuto epatico di topo
   1. Aggiungere 50 mg di tessuto epatico dal passaggio 2.4 e 250 μL di lisato cellulare a un omogeneizzatore di vetro da 1 mL e macinare con ghiaccio per 5 minuti.
   2. Trasferire l'omogeneizzato di tessuto epatico dal passaggio 5.1.1 a una provetta per microcentrifuga da 1,5 mL utilizzando un pipettatore e centrifugare a 18.759 x g per 10 minuti a 4 °C. Quindi trasferire il surnatante in una nuova provetta da 1,5 mL utilizzando un pipettatore.
2. Determinazione delle concentrazioni proteiche e pre-elaborazione dei campioni proteici
   1. Aggiungere 2 μl di surnatante dal passaggio 5.1.2, 18 μl di PBS e 180 μl di soluzione di lavoro BCA a una piastra per microtitolazione a 96 pozzetti⁸.
   2. Far oscillare la piastra su un oscillatore per 30 s, lasciarla per 30 minuti a 37 °C e determinare l'assorbanza a 562 nm utilizzando un lettore di micropiastre.
3. Separare le proteine totali utilizzando SDS-PAGE, trasferirle sulle membrane di fluoruro di polivinilidene e bloccarle con il 5% di latte scremato⁸.
4. Incubare le membrane dalla fase 5.3 con anticorpi primari contro HIF-1α (1:1000), VEGFA (1:1000), GLA (1:1000), NOS3 (1:1000) e β-actina (1:5000) per una notte a 4 °C.
5. Collocare le membrane del passaggio 5.4 in una scatola di incubazione degli anticorpi, aggiungere 10 mL di TBST e agitare orizzontalmente a 111 x g a temperatura ambiente per lavare via gli anticorpi primari non legati tre volte per 5 minuti ciascuna.
6. Aggiungere 200 μL di IgG (H + L)-HRP di capra anti-coniglio (1:1000) a ciascuna membrana dal passaggio 5.5 e incubare per 2 ore a temperatura ambiente. Quindi, ripetere il passaggio 5.5 per lavare via l'anticorpo secondario non legato (capra anti-coniglio IgG (H + L)-HRP).
7. Aggiungere 200 μl di soluzione chemiluminescente ECL ad altissima sensibilità sulla superficie di ciascuna membrana dal passaggio 5.6 e visualizzare immediatamente le bande proteiche utilizzando un sistema di analisi automatico di imaging a chemiluminescenza.

6. Analisi statistica

1. Analizza i dati utilizzando software statistici e grafici con ANOVA unidirezionale seguita dal test di Tukey.
2. Presentare i risultati come media ± deviazione standard (SD) e considerare un valore P < 0,05 come statisticamente significativo.

Per confermare il successo dell'istituzione del modello murino di anemia e analizzare l'effetto di SLBXS sull'anemia, sono stati prima studiati l'indice epatico e i parametri ematologici. La Figura 1 illustra che il gruppo modello ha mostrato una diminuzione significativa (P < 0,01) della conta dei globuli rossi (RBC), dell'emoglobina (HGB) e dell'ematocrito (HCT) rispetto al gruppo di controllo. Al contrario, l'indice epatico, la conta dei globuli ...

L'anemia è una condizione comune che colpisce molte persone in tutto il mondo, in particolare nei paesi in via di sviluppo¹. In Cina, i pazienti usano spesso la medicina tradizionale cinese, compresa la medicina uigura, per alleviare i segni e i sintomi dell'anemia. SLBXS è un medicinale uiguro utilizzato nella pratica clinica da molti anni; Tuttavia, il suo esatto meccanismo d'azione contro l'anemia rimane poco compreso¹³. In questo stud...

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Questo lavoro è stato sostenuto dal Piano di formazione speciale per i talenti delle minoranze scientifiche e tecnologiche, dalla Fondazione per le scienze naturali della regione autonoma uigura dello Xinjiang (2020D03021), dai fondi per il programma chiave per la medicina tradizionale cinese dell'Università di medicina cinese dell'Hubei (2022ZZXZ004) e dal programma Tianshan Innovation Team (2020D14030).