Bewertung des Mechanismus eines traditionellen pflanzlichen Sirups zur Behandlung von Anämie mit Hilfe der Lebermetabolomik

Diese Studie stellt in erster Linie die Anwendung der Lebermetabolomik bei der Untersuchung der Wirksamkeit von Shi-Liu-Bu-Xue-Sirup bei der Behandlung von Anämie vor.

Als bekanntes uigurisches Arzneimittel wird Shi-Liu-Bu-Xue-Sirup (SLBXS) in China seit über 20 Jahren häufig zur Behandlung von Anämie eingesetzt. Die zugrunde liegenden Mechanismen seiner Wirksamkeit bei der Behandlung von Anämie sind jedoch unklar. In dieser Studie wurde die Lebermetabolomik hauptsächlich eingesetzt, um die potenziellen Regulationsmechanismen von SLBXS bei der Behandlung von Anämie zu bestimmen. Um den Wirkmechanismus von SLBXS in einem Acetylphenylhydrazin-induzierten Mausmodell für Anämie zu charakterisieren, wurde ein Lebermetabolomics-Profiling durchgeführt. Es wurde gezeigt, dass SLBXS den Leberindex, die Anzahl der weißen Blutkörperchen und die Thrombozytenzahl senkt, während die Anzahl der roten Blutkörperchen, des Hämoglobins und des Hämatokritspiegels erhöht wird. Die Kernziele wurden für die Verifizierung mittels Western-Blotting ausgewählt. SLBXS zeigte eine signifikante therapeutische Wirkung auf Anämie, vor allem durch die Regulierung des Galaktosestoffwechsels und des HIF-1-Signalwegs, wie die Herunterregulierung von HIF-1α-, NOS3-, VEGFA- und GLA-Proteinen im Lebergewebe anämischer Mäuse zeigt. Diese Studie klärt die möglichen Regulationsmechanismen des Leberstoffwechsels durch SLBXS-Verabreichung bei der Behandlung von Anämie.

Anämie ist ein drängendes und weit verbreitetes globales Gesundheitsproblem, von dem 25 % der Weltbevölkerung und Menschen jeden Alters, insbesondere Jugendliche und schwangere Frauen, betroffen sind ^1,2,3. Sie ist mit einem erhöhten Risiko für Frühgeburten und Müttersterblichkeit verbunden und kann zu körperlichen Entwicklungsstörungen und einer Beeinträchtigung der kardiovaskulären Leistungsfähigkeit führen⁴. Dieser Zustand kann sich auch negativ auf den Gesundheitszustand von Jugendlichen auswirken und zu Infektionen und Herzinsuffizienz führen⁵. Zu den derzeitigen Behandlungen gehören in erster Linie Bluttransfusionen, Eisenergänzungen und Erythropoetin-Therapie. Diese Behandlungen haben jedoch Nachteile und nachteilige Nebenwirkungen wie Anaphylaxie, Magen-Darm-Störungen, Eisenüberladung und Nesselsucht¹. Daher ist es von entscheidender Bedeutung, wirksame Medikamente mit weniger Nebenwirkungen zur Behandlung von Anämie zu identifizieren.

Die traditionelle chinesische Medizin, einschließlich der uigurischen Medizin, bietet mehrere Vorteile, wie z. B. Formulierungen mit mehreren Inhaltsstoffen, Multi-Target-Effekte, Multi-Link-Wechselwirkungen und weniger Nebenwirkungen bei der Vorbeugung und Behandlung von multifaktoriellen Krankheiten. Shi-Liu-Bu-Xue-Sirup (SLBXS) ist ein bemerkenswertes traditionelles Mittel in der uigurischen Medizin, das für Blutstärkungsmittel und die Blutproduktion verwendet wird. Es ist als blutregulierendes Medikament anerkannt, das die Leberhitze reduzieren kann, und wurde in die Leitlinien für die klinische Anwendung von Minderheitenarzneimitteln zur Behandlung von Anämie aufgenommen. Es ist auch von der chinesischen staatlichen Lebensmittel- und Arzneimittelbehörde (Z20026094)^6,7,8 zugelassen. In den letzten zwei Jahrzehnten wurde SLBXS in China in großem Umfang zur Behandlung von Anämie-bedingten Erkrankungen eingesetzt. Die möglichen Mechanismen zur Behandlung von Anämie sind jedoch noch unbekannt und bedürfen weiterer Untersuchungen. Die Metabolomik, die die dynamischen metabolischen Reaktionen biologischer Systeme auf Krankheiten, medikamentöse Interventionen oder Umweltbedingungen untersucht⁹, wird zunehmend eingesetzt, um die Wirkmechanismen der traditionellen chinesischen Medizin aufzuklären, indem Veränderungen der metabolischen Biomarker in biologischen Proben nach externen Reizen bewertet^{werden 9,10}.

Dementsprechend wurde in dieser Studie ein Ansatz der Lebermetabolomik gewählt, um die zugrundeliegenden therapeutischen Mechanismen von SLBXS bei der Behandlung von Anämie zu bestimmen. Zunächst wurde ein Acetylphenylhydrazin (APH)-induziertes Mausmodell für Anämie etabliert. Anschließend wurden die Stoffwechselwege endogener Metaboliten mittels Lebermetabolomik mit Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC-MS) und multivariaten Datenmethoden nach SLBXS-Verabreichung untersucht. Schließlich wurden wichtige Ziele experimentell analysiert, um die antianämische Wirkung und die molekularen Mechanismen von SLBXS aufzuklären.

Alle experimentellen Verfahren wurden von der Ethikkommission für Versuchstiere der Universität für Chinesische Medizin Hubei (HBUCMS201912015) genehmigt. Männliche C57BL/6-Mäuse (Gewicht 20-22 g) wurden in einem spezifischen, erregerfreien Raum mit einer relativen Luftfeuchtigkeit von 50%-60% und einer Temperatur von 22 °C ± 2 °C untergebracht, einem 12-stündigen Licht-/12-stündigen Dunkelzyklus unterzogen und erhielten freien Zugang zu Futter und Wasser. Bevor das Experiment begann, hatten alle Mäuse eine Woche Zeit, sich an die Umgebung zu gewöhnen. Die Mäuse wurden nach dem Zufallsprinzip einer der folgenden vier Gruppen (n = 12) zugeteilt: Kontrolle, Modell, Fu-Fang-E-Jiao-Sirup (FFEJS, ein positives Medikament, intragastrisch verabreicht mit 7,8 ml/kg) und SLBXS (intragastrisch verabreicht mit 11,7 ml/kg). Mäuse in der Kontroll- und der Modellgruppe erhielten gleiche Mengen an Kochsalzlösung. Mäuse in allen Gruppen erhielten 2 Wochen lang einmal täglich die intragastrischen Verabreichung der entsprechenden Arzneimittel. Einzelheiten zu den in dieser Studie verwendeten Arzneimitteln, Reagenzien und Geräten sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Etablierung eines Anämiemodells bei Mäusen

1. Wiegen Sie 2 g Acetylphenylhydrazin (APH) mit einer elektronischen Waage und geben Sie es in ein 150-ml-Becherglas. Fügen Sie 100 mL Kochsalzlösung hinzu und rühren Sie mit einem Glasstab um, bis sich die APH vollständig aufgelöst hat.
2. Etablierung des Mausmodells der Anämie durch subkutane Injektion von 2 % APH, wie in Schritt 1.1 hergestellt, am 1^., 4^. und 7^. Tag in Dosierungen von 200 mg/kg, 100 mg/kg bzw. 100 mg/kg¹¹.
   HINWEIS: Ab dem ersten Tag erhielten Mäuse in den Gruppen FFEJS (7,8 ml/kg) und SLBXS (11,7 ml/kg) einmal täglich über einen Zeitraum von 2 Wochen eine intragastrische Verabreichung. Mäuse in der Kontroll- und Modellgruppe erhielten 2 Wochen lang einmal täglich die gleichen Mengen Kochsalzlösung.

2. Bestimmung des Leberindex

1. Wiegen Sie am Ende des Experiments jede Maus mit einer elektronischen Waage.
2. Betäuben Sie die Mäuse durch Inhalation von 2% Isofluran. Drücken Sie den Augapfel der Mäuse zusammen, um ihn hyperämisch und hervorstehend zu machen. Entfernen Sie schnell den Augapfel mit einer Pinzette und sammeln Sie das Blut in heparinisierten Probenröhrchen.
3. Befestigen Sie die anästhesierten Mäuse aus Schritt 2.2 auf einer chirurgischen Manipulationsplatte.
4. Machen Sie mit einem Skalpell einen vollständigen Schnitt entlang der Mittellinie des Bauches. Das intakte Lebergewebe¹² wird sorgfältig präpariert und isoliert, und dann wird sein Gewicht mit einer elektronischen Waage gemessen.
   HINWEIS: Der Leberindex jeder Maus wird nach der folgenden Formel berechnet: Leberindex = Lebergewicht/Körpergewicht.

3. Hämatologische Analyse

1. Schütteln Sie das Röhrchen mit der heparinisierten Blutprobe aus Schritt 2.2 vorsichtig, um eine Blutgerinnung zu verhindern.
2. Legen Sie die Blutprobe unter die Injektionsnadel, um sicherzustellen, dass sie vollständig in die Nadel eingetaucht ist.
3. Klicken Sie auf die Schaltfläche Auto Detect , um die Anzahl der roten Blutkörperchen (RBC), des Hämatokrits (HCT), der Anzahl der weißen Blutkörperchen (WBC), des Hämoglobins (HGB) und der Thrombozytenzahl (PLT) mit einem vollautomatischen Hämozytenanalysator zu messen.

4. Studie zur Metabolomik der Leber

1. Vorbereitung von Leberproben
   1. Lebergewebeproben (50 mg) aus Schritt 2.4 werden mit 1 ml vorgekühltem Methanol homogenisiert. Bei 18.759 x g für 10 min bei 4 °C zentrifugieren, um den Niederschlag zu entfernen.
   2. 200 μl des Überstands werden mit einer Pipette in ein Probengefäß überführt und in einem Gefriertrockner bei 35 °C 2 Stunden lang vakuumgetrocknet.
   3. Die getrockneten Proben werden 90 Minuten lang bei 30 °C mit 40 μl einer 40 mg/ml-Lösung von Methoxyaminhydrochlorid in Pyridin umgesetzt. Dann 80 μl N-Methyl-N-(trimethylsilyl)trifluoracetamid (MSTFA) mit 1 % Trimethylchlorsilan (TMCS) zugeben und 60 min bei 37 °C inkubieren.
   4. Geben Sie 10 μl n-Hexan in das Fläschchen, um die Derivatisierungsreaktion zu beenden.
2. Analyse des Leberstoffwechsels
   1. Analysieren Sie die derivatisierten Proben (1 μl) mit einem GC-MS-System. Trennen Sie die Derivate mit einer DB-5MS-Kapillarsäule (30 m × 0,25 mm × 0,25 μm).
      HINWEIS: Die Bedingungen für das Ofentemperaturprogramm wurden wie folgt eingestellt: 60 °C für 1 min; Bei einer Geschwindigkeit von 10 °C/min auf 325 °C anheben und 10 min halten. Die Temperaturen des Injektors, der Ionenquelle und der MS wurden auf 250 °C, 230 °C bzw. 150 °C eingestellt. Als Trägergas wurde Helium (99,999 %) mit einer Durchflussrate von 1,1 mL/min verwendet, und das Split-Verhältnis wurde auf 10:1 eingestellt. Es wurde eine Elektronenstrahlenergie von 70 eV und eine Lösungsmittelverzögerungszeit von 5,9 min verwendet.
3. Datenverarbeitung und -analyse
   1. Erfassen und konvertieren Sie GC-MS-Rohdaten mit der kompatiblen MassHunter-Software.
   2. Führen Sie eine Spektralanalyse mit dem AMDIS-Tool (Automated Mass Spectral Deconvolution and Identification System)¹² durch.
   3. Identifizieren Sie alle Metaboliten mit Hilfe der NIST- und HMDB-Datenbanken (siehe Materialtabelle).
   4. Importieren Sie die Daten in das MetaboAnalyst-Werkzeug für die partielle Analyse der kleinsten Quadrate (PLS-DA), t-Tests, Pfadanalyse und Netzwerkanalyse¹².

5. Western-Blot-Analyse

1. Extrahieren Sie die Gesamtproteine aus dem Lebergewebe der Maus
   1. Geben Sie 50 mg Lebergewebe aus Schritt 2.4 und 250 μl Zelllysat in einen 1 mL Glashomogenisator und mahlen Sie es 5 Minuten lang auf Eis.
   2. Das Lebergewebehomogenat aus Schritt 5.1.1 wird mit einer Pipettorin in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen überführt und bei 18.759 x g für 10 min bei 4 °C zentrifugiert. Übertragen Sie dann den Überstand mit einer Pipette in ein neues 1,5-ml-Röhrchen.
2. Bestimmung von Proteinkonzentrationen und Vorverarbeitung von Proteinproben
   1. Geben Sie 2 μl Überstand aus Schritt 5.1.2, 18 μl PBS und 180 μl BCA-Arbeitslösung in eine 96-Well-Mikrotiterplatte⁸.
   2. Oszillieren Sie die Platte 30 s lang auf einem Oszillator, lassen Sie sie 30 min bei 37 °C stehen und bestimmen Sie die Extinktion bei 562 nm mit einem Mikroplatten-Reader.
3. Trennen Sie die Gesamtproteine mit SDS-PAGE, übertragen Sie sie auf Polyvinylidenfluoridmembranen und blockieren Sie sie mit 5 % fettfreier Milch⁸.
4. Die Membranen aus Schritt 5.3 werden über Nacht bei 4 °C mit Primärantikörpern gegen HIF-1α (1:1000), VEGFA (1:1000), GLA (1:1000), NOS3 (1:1000) und β-Aktin (1:5000) inkubiert.
5. Legen Sie die Membranen aus Schritt 5.4 in eine Antikörper-Inkubationsbox, fügen Sie 10 mL TBST hinzu und schütteln Sie sie horizontal bei 111 x g bei Raumtemperatur, um ungebundene Primärantikörper dreimal für jeweils 5 Minuten abzuwaschen.
6. 200 μl Anti-Kaninchen-IgG (H + L)-HRP (1:1000) werden zu jeder Membran aus Schritt 5.5 gegeben und 2 h bei Raumtemperatur inkubiert. Wiederholen Sie dann Schritt 5.5, um den ungebundenen Sekundärantikörper (Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG (H + L)-HRP) abzuwaschen.
7. Geben Sie 200 μl ultrahochempfindliche ECL-Chemilumineszenzlösung auf die Oberfläche jeder Membran aus Schritt 5.6 und visualisieren Sie sofort Proteinbanden mit einem automatischen Chemilumineszenz-Bildgebungsanalysesystem.

6. Statistische Analyse

1. Analysieren Sie die Daten mit Hilfe von Statistik- und Grafiksoftware mit unidirektionaler ANOVA, gefolgt von Tukeys Test.
2. Stellen Sie die Ergebnisse als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) dar und betrachten Sie einen p-Wert < 0,05 als statistisch signifikant.

Um die erfolgreiche Etablierung des Mausmodells der Anämie zu bestätigen und die Wirkung von SLBXS auf die Anämie zu analysieren, wurden zunächst der Leberindex und hämatologische Parameter untersucht. Abbildung 1 zeigt, dass die Modellgruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe eine signifikante Abnahme (P < 0,01) der Anzahl der roten Blutkörperchen (RBC), des Hämoglobins (HGB) und des Hämatokrits (HCT) aufwies. Umgekehrt waren der Leberindex, d...

Anämie ist eine häufige Erkrankung, von der viele Menschen weltweit betroffen sind, insbesondere in Entwicklungsländern¹. In China wenden Patienten häufig traditionelle chinesische Medizin an, einschließlich uigurischer Medizin, um die Anzeichen und Symptome von Anämie zu lindern. SLBXS ist ein uigurisches Medikament, das seit vielen Jahren in der klinischen Praxis eingesetzt wird. Der genaue Wirkmechanismus gegen Anämie ist jedoch nach wie vor wenig versta...

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Diese Arbeit wurde unterstützt durch den Special Training Plan for Minority Science and Technology Talents, die Natural Science Foundation of Xinjiang Uyghur Autonomous Region (2020D03021), das Funds for Key Program for Traditional Chinese Medicine der Hubei University of Chinese Medicine (2022ZZXZ004) und das Tianshan Innovation Team Program (2020D14030).