Évaluation du mécanisme d’un sirop à base de plantes traditionnel pour le traitement de l’anémie à l’aide de la métabolomique hépatique

Cette étude introduit principalement l’application de la métabolomique hépatique dans l’étude de l’efficacité du sirop Shi-Liu-Bu-Xue dans le traitement de l’anémie.

En tant que médicament ouïghour bien connu, le sirop Shi-Liu-Bu-Xue (SLBXS) est largement utilisé pour traiter l’anémie en Chine depuis plus de 20 ans. Cependant, les mécanismes sous-jacents de son efficacité dans le traitement de l’anémie restent incertains. Dans cette étude, la métabolomique hépatique a été principalement utilisée pour déterminer les mécanismes de régulation potentiels de la SLBXS dans le traitement de l’anémie. Un profilage métabolomique hépatique a été effectué pour caractériser le mécanisme d’action de SLBXS dans un modèle murin d’anémie induit par l’acétylphénylhydrazine. Il a été démontré que SLBXS diminue l’indice hépatique, le nombre de globules blancs et le nombre de plaquettes, tout en augmentant le nombre de globules rouges, l’hémoglobine et les taux d’hématocrite. Les cibles principales ont été sélectionnées pour la vérification à l’aide du transfert Western. SLBXS a démontré un effet thérapeutique significatif sur l’anémie principalement en régulant le métabolisme du galactose et la voie de signalisation HIF-1, comme l’indique la régulation négative des protéines HIF-1α, NOS3, VEGFA et GLA dans les tissus hépatiques de souris anémiques. Cette étude clarifie les mécanismes potentiels de régulation du métabolisme hépatique par l’administration de SLBXS dans le traitement de l’anémie.

L’anémie est un problème de santé mondial urgent et répandu, qui touche 25 % de la population mondiale et des personnes de tous âges, en particulier les adolescents et les femmes enceintes ^1,2,3. Il est associé à un risque accru de travail prématuré et de mortalité maternelle et peut entraîner des troubles du développement physique et une altération des performances cardiovasculaires⁴. Cette condition peut également avoir un impact négatif sur l’état de santé des adolescents, entraînant des infections et une insuffisance cardiaque⁵. Les traitements actuels comprennent principalement la transfusion sanguine, la supplémentation en fer et le traitement à l’érythropoïétine. Cependant, ces traitements présentent des inconvénients et des effets secondaires indésirables, tels que l’anaphylaxie, les troubles gastro-intestinaux, la surcharge en fer et l’urticaire¹. Par conséquent, il est crucial d’identifier des médicaments efficaces avec moins d’effets secondaires pour traiter l’anémie.

La médecine traditionnelle chinoise, y compris la médecine ouïghoure, offre plusieurs avantages, tels que des formulations multi-ingrédients, des effets multi-cibles, des interactions multi-liens et moins d’effets secondaires dans la prévention et le traitement des maladies multifactorielles. Le sirop Shi-Liu-Bu-Xue (SLBXS) est un agent traditionnel notable de la médecine ouïghoure utilisé pour les toniques sanguins et la production de sang. Il est reconnu comme un médicament régulateur du sang qui peut réduire la chaleur du foie et a été inclus dans les directives pour l’utilisation clinique de médicaments minoritaires pour le traitement de l’anémie. Il est également homologué par l’Administration nationale chinoise des aliments et des médicaments (Z20026094)^6,7,8. Au cours des deux dernières décennies, le SLBXS a été largement utilisé en Chine pour traiter les affections liées à l’anémie. Cependant, ses mécanismes potentiels pour traiter l’anémie restent inconnus et nécessitent des recherches plus approfondies. La métabolomique, qui examine les réponses métaboliques dynamiques des systèmes biologiques à la maladie, aux interventions médicamenteuses ou aux conditions environnementales⁹, est de plus en plus utilisée pour élucider les mécanismes d’action de la médecine traditionnelle chinoise en évaluant les changements dans les biomarqueurs métaboliques dans les échantillons biologiques à la suite de stimuli externes ^9,10.

En conséquence, une approche métabolomique hépatique a été adoptée dans cette étude pour déterminer les mécanismes thérapeutiques sous-jacents de la SLBXS dans le traitement de l’anémie. Tout d’abord, un modèle murin d’anémie induit par l’acétylphénylhydrazine (APH) a été établi. Ensuite, les voies métaboliques des métabolites endogènes ont été étudiées à l’aide de métabolomique hépatique avec chromatographie en phase gazeuse couplée spectrométrie de masse (GC-MS) et de méthodes de données multivariées après administration de SLBXS. Enfin, des cibles clés ont été analysées expérimentalement pour élucider les effets anti-anémiques et les mécanismes moléculaires des SLBXS.

Toutes les procédures expérimentales ont été approuvées par le Comité d’éthique des animaux de laboratoire de l’Université de médecine chinoise du Hubei (HBUCMS201912015). Les souris C57BL/6 mâles (poids 20-22 g) ont été logées dans une pièce spécifique exempte d’agents pathogènes avec une humidité relative de 50 %-60 % et une température de 22 °C ± 2 °C, soumises à un cycle de 12 h de lumière/12 h d’obscurité, et ayant un accès libre à la nourriture et à l’eau. Avant le début de l’expérience, toutes les souris ont eu une semaine pour s’acclimater à l’environnement. Les souris ont été réparties au hasard dans l’un des quatre groupes suivants (n = 12) : contrôle, modèle, sirop Fu-Fang-E-Jiao (FFEJS, un médicament positif, administré par voie intragastrique à 7,8 ml/kg) et SLBXS (administré par voie intragastrique à 11,7 ml/kg). Les souris des groupes témoin et modèle ont reçu des volumes égaux de solution saline. Les souris de tous les groupes ont reçu une administration intragastrique des médicaments correspondants une fois par jour pendant 2 semaines. Les détails des médicaments, des réactifs et de l’équipement utilisés dans cette étude sont énumérés dans la table des matières.

1. Etablissement d’un modèle d’anémie chez la souris

1. Peser 2 g d’acétylphénylhydrazine (APH) à l’aide d’une balance électronique et les transférer dans un bécher de 150 ml. Ajouter 100 ml de solution saline et remuer à l’aide d’une tige de verre jusqu’à ce que l’APH soit complètement dissous.
2. Établir le modèle murin de l’anémie en injectant par voie sous-cutanée 2 % d’APH comme préparé à l’étape 1.1 les 1er^{, 4e et 7e} jours à des doses de 200 mg/kg, 100 mg/kg et 100 mg/kg, respectivement¹¹.
   REMARQUE : À partir du premier jour, les souris des groupes FFEJS (7,8 mL/kg) et SLBXS (11,7 mL/kg) ont reçu une administration intragastrique une fois par jour pendant 2 semaines. Les souris des groupes témoin et modèle ont reçu des volumes égaux de solution saline une fois par jour pendant 2 semaines.

2. Détermination de l’indice hépatique

1. À la fin de l’expérience, pesez chaque souris à l’aide d’une balance électronique.
2. Anesthésier les souris en inhalant 2 % d’isoflurane. Pressez le globe oculaire des souris pour le rendre hyperémique et saillant. Retirez rapidement le globe oculaire à l’aide d’une pince et recueillez le sang dans des tubes d’échantillon héparinisés.
3. Fixez les souris anesthésiées de l’étape 2.2 à une plaque de manipulation chirurgicale.
4. Faites une incision complète le long de la ligne médiane de l’abdomen à l’aide d’un scalpel. Disséquez soigneusement et isolez le tissu hépatique intact¹², puis mesurez son poids à l’aide d’une balance électronique.
   REMARQUE : L’indice hépatique de chaque souris est calculé à l’aide de la formule suivante : Indice hépatique = poids du foie/poids corporel.

3. Analyse hématologique

1. Secouez doucement le tube contenant l’échantillon de sang hépariné de l’étape 2.2 pour éviter la coagulation du sang.
2. Placez l’échantillon de sang sous l’aiguille d’injection pour vous assurer qu’il est complètement immergé dans l’aiguille.
3. Cliquez sur le bouton Détection automatique pour mesurer le nombre de globules rouges (RBC), l’hématocrite (HCT), le nombre de globules blancs (GB), le taux d’hémoglobine (HGB) et le nombre de plaquettes (PLT) à l’aide d’un analyseur d’hémocytes entièrement automatique.

4. Étude de la métabolomique hépatique

1. Préparation d’échantillons de foie
   1. Homogénéiser les échantillons de tissu hépatique (50 mg) de l’étape 2.4 avec 1 mL de méthanol pré-refroidi. Centrifuger à 18 759 x g pendant 10 min à 4 °C pour éliminer le précipité.
   2. Transférer 200 μL de surnageant dans un flacon d’échantillon à l’aide d’une pipette et sécher sous vide dans un lyophilisateur à 35 °C pendant 2 h.
   3. Faire réagir les échantillons séchés avec 40 μL d’une solution à 40 mg/mL de chlorhydrate de méthoxyamine dans de la pyridine pendant 90 min à 30 °C. Ensuite, ajoutez 80 μL de N-méthyl-N-(triméthylsilyl)trifluoroacétamide (MSTFA) avec 1 % de triméthylchlorosilane (TMCS) et incubez pendant 60 min à 37 °C.
   4. Ajouter 10 μL de n-hexane dans le flacon pour terminer la réaction de dérivatisation.
2. Analyse métabolique hépatique
   1. Analysez les échantillons dérivés, (1 μL), à l’aide d’un système GC-MS. Séparez les dérivés à l’aide d’une colonne capillaire DB-5MS (30 m × 0,25 mm × 0,25 μm).
      REMARQUE : Les conditions du programme de température du four ont été réglées comme suit : 60 °C pendant 1 min ; augmenter à 325 °C à une vitesse de 10 °C/min et maintenir pendant 10 min. Les températures de l’injecteur, de la source d’ions et du MS ont été réglées à 250 °C, 230 °C et 150 °C, respectivement. L’hélium (99,999 %) a été utilisé comme gaz porteur à un débit de 1,1 mL/min, et le rapport de séparation a été réglé à 10:1. Une énergie de faisceau d’électrons de 70 eV et un temps de retard de solvant de 5,9 min ont été utilisés.
3. Traitement et analyse des données
   1. Acquérez et convertissez des données GC-MS brutes à l’aide du logiciel compatible MassHunter.
   2. Effectuer une analyse spectrale à l’aide de l’outil AMDIS (Automated Mass Spectral Deconvolution and Identification System)¹².
   3. Identifiez tous les métabolites à l’aide des bases de données NIST et HMDB (voir la table des matériaux).
   4. Importez les données dans l’outil MetaboAnalyst pour l’analyse discriminante des moindres carrés partiels (PLS-DA), les tests t, l’analyse de trajectoire et l’analyse de réseau¹².

5. Analyse par transfert Western

1. Extraire les protéines totales du tissu hépatique de souris
   1. Ajouter 50 mg de tissu hépatique de l’étape 2.4 et 250 μL de lysat cellulaire dans un homogénéisateur en verre de 1 mL et broyer sur de la glace pendant 5 min.
   2. Transvaser l’homogénat de tissu hépatique de l’étape 5.1.1 dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL à l’aide d’une pipette, puis centrifuger à 18 759 x g pendant 10 min à 4 °C. Transférez ensuite le surnageant dans un nouveau tube de 1,5 mL à l’aide d’une pipette.
2. Déterminer les concentrations de protéines et prétraiter les échantillons de protéines
   1. Ajouter 2 μL de surnageant de l’étape 5.1.2, 18 μL de PBS et 180 μL de solution de travail BCA à une plaque de microtitration⁸ à 96 puits.
   2. Faites osciller la plaque sur un oscillateur pendant 30 s, laissez-la pendant 30 min à 37 °C et déterminez l’absorbance à 562 nm à l’aide d’un lecteur de microplaques.
3. Séparez les protéines totales à l’aide de SDS-PAGE, transférez-les sur des membranes de fluorure de polyvinylidène et bloquez avec 5 % de lait écrémé⁸.
4. Incuber les membranes à partir de l’étape 5.3 avec des anticorps primaires contre HIF-1α (1:1000), VEGFA (1:1000), GLA (1:1000), NOS3 (1:1000) et β-actine (1:5000) pendant une nuit à 4 °C.
5. Placez les membranes de l’étape 5.4 dans une boîte d’incubation d’anticorps, ajoutez 10 ml de TBST et agitez horizontalement à 111 x g à température ambiante pour éliminer les anticorps primaires non liés trois fois pendant 5 minutes chacune.
6. Ajouter 200 μL d’IgG (H + L)-HRP (1:1000) de chèvre anti-lapin à chaque membrane de l’étape 5.5 et incuber pendant 2 h à température ambiante. Ensuite, répétez l’étape 5.5 pour éliminer l’anticorps secondaire non lié (IgG (H + L) anti-lapin de chèvre).
7. Ajoutez 200 μL de solution chimiluminescente ECL ultra-haute sensibilité à la surface de chaque membrane à partir de l’étape 5.6 et visualisez immédiatement les bandes de protéines à l’aide d’un système d’analyse automatique par imagerie par chimiluminescence.

6. Analyse statistique

1. Analysez les données à l’aide d’un logiciel statistique et graphique avec une ANOVA à un facteur suivie d’un test de Tukey.
2. Présentez les résultats sous forme de moyenne ± écart-type (ET) et considérez une valeur P < 0,05 comme statistiquement significative.

Pour confirmer l’établissement réussi du modèle murin d’anémie et analyser l’effet de SLBXS sur l’anémie, l’indice hépatique et les paramètres hématologiques ont d’abord été étudiés. La figure 1 illustre que le groupe modèle a montré une diminution significative (P < 0,01) du nombre de globules rouges (GR), de l’hémoglobine (HGB) et de l’hématocrite (HCT) par rapport au groupe témoin. À l’inverse, l’indice hépa...

L’anémie est une maladie courante qui touche de nombreuses personnes dans le monde, en particulier dans les pays en développement¹. En Chine, les patients utilisent fréquemment la médecine traditionnelle chinoise, y compris la médecine ouïghoure, pour soulager les signes et les symptômes de l’anémie. Le SLBXS est un médicament ouïghour utilisé dans la pratique clinique depuis de nombreuses années ; Cependant, son mécanisme d’action exact contre ...

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Ce travail a été soutenu par le Plan spécial de formation pour les talents scientifiques et technologiques minoritaires, la Fondation des sciences naturelles de la région autonome ouïghoure du Xinjiang (2020D03021), les Fonds pour le programme clé de médecine traditionnelle chinoise de l’Université de médecine chinoise du Hubei (2022ZZXZ004) et le programme d’équipe d’innovation Tianshan (2020D14030).