使用肝脏代谢组学评估传统草药糖浆治疗贫血的机制

本研究主要介绍了肝脏代谢组学在研究石六不血糖浆治疗贫血的有效性中的应用。

作为一种著名的维吾尔药物，石六不血糖浆 （SLBXS） 在中国已被广泛用于治疗贫血 20 多年。然而，其治疗贫血的有效性的潜在机制仍不清楚。在这项研究中，肝脏代谢组学主要用于确定 SLBXS 治疗贫血的潜在调节机制。进行肝脏代谢组学分析以表征 SLBXS 在乙酰苯肼诱导的小鼠贫血模型中的作用机制。SLBXS 显示可降低肝脏指数、白细胞计数和血小板计数，同时增加红细胞计数、血红蛋白和血细胞比容水平。选择核心靶标使用 Western blotting 进行验证。SLBXS 主要通过调节半乳糖代谢和 HIF-1 信号通路对贫血具有显着的治疗作用，如贫血小鼠肝组织中 HIF-1α 、 NOS3 、 VEGFA 和 GLA 蛋白的下调所示。本研究阐明了 SLBXS 给药治疗贫血对肝脏代谢的潜在调节机制。

贫血是一个紧迫且普遍的全球健康问题，影响着世界 25% 的人口和所有年龄段的人，尤其是青少年和孕妇 ^1,2,3。它与早产和孕产妇死亡风险增加有关，并可能导致身体发育障碍和心血管功能受损⁴。这种情况也可能对青少年的健康状况产生负面影响，导致感染和心力衰竭⁵。目前的治疗主要包括输血、补铁和促红细胞生成素治疗。然而，这些治疗有缺点和不良副作用，例如过敏反应、胃肠道不适、铁超负荷和荨麻疹¹。因此，确定治疗贫血副作用较少的有效药物至关重要。

中医，包括维吾尔医学，在防治多因素疾病方面具有多成分配方、多靶点作用、多环节相互作用、副作用少等优点。石六不雪糖浆 （SLBXS） 是维吾尔医学中一种著名的传统药物，用于补血和造血。它被公认为一种可以降低肝热的血液调节药物，并已被列入治疗贫血的少数药物临床使用指南。它还获得了中国国家食品药品监督管理局 （Z20026094）^6,7,8 的许可。在过去的二十年里，SLBXS 在中国被广泛用于治疗贫血相关疾病。然而，其治疗贫血的潜在机制仍然未知，需要进一步研究。代谢组学研究生物系统对疾病、药物干预或环境条件的动态代谢反应⁹，越来越多地用于通过评估外部刺激后生物样本中代谢生物标志物的变化来阐明传统中医的作用机制 ^9,10。

因此，本研究采用肝脏代谢组学方法来确定 SLBXS 治疗贫血的潜在治疗机制。首先，建立了乙酰苯肼 （APH） 诱导的小鼠贫血模型。接下来，在 SLBXS 给药后，使用肝脏代谢组学气相色谱-质谱 （GC-MS） 和多变量数据方法研究内源性代谢物的代谢途径。最后，通过实验分析关键靶点以阐明 SLBXS 的抗贫血作用和分子机制。

所有实验程序均经湖北中医药大学实验动物伦理委员会 （HBUCMS201912015） 批准。雄性 C57BL/6 小鼠 （体重 20-22 g） 饲养在相对湿度为 50%-60% 且温度为 22 °C ± 2 °C 的特定无病原体房间内，进行 12 h 光照/12 h 黑暗循环，并提供免费食物和水。在实验开始之前，所有小鼠都被允许一周来适应环境。将小鼠随机分配到以下四组之一 （n = 12）：对照组、模型组、福方娥角糖浆 （FFEJS，阳性药物，以 7.8 mL/kg 的剂量灌胃给药）和 SLBXS （以 11.7 mL/kg 的胃内给药）。对照组和模型组的小鼠接受等体积的盐水。各组小鼠灌胃给药相应药物 1 次，每日 1 次，持续 2 周。本研究中使用的药物、试剂和设备的详细信息列在 材料表中。

1. 小鼠贫血模型的建立

1. 使用电子天平称取 2 g 乙酰苯肼 （APH） 并将其转移到 150 mL 烧杯中。加入 100 mL 生理盐水，用玻璃棒搅拌，直到 APH 完全溶解。
2. 通过在第^{1 天、}第 4 天和第 7 天皮下注射步骤 1.1 中制备的 2% APH 以分别为 200 mg/kg、100 mg/kg 和 100 mg/kg 的剂量建立贫血小鼠模型¹¹。
   注意：从第一天开始，FFEJS （7.8 mL/kg） 和 SLBXS （11.7 mL/kg） 组的小鼠每天一次灌胃给药，持续 2 周。对照组和模型组的小鼠每天一次接受等体积的生理盐水，持续 2 周。

2. 确定肝脏指数

1. 在实验结束时，使用电子秤称量每只小鼠。
2. 通过吸入 2% 异氟醚麻醉小鼠。挤压小鼠的眼球，使其充血和突出。用镊子快速取出眼球，并将血液收集在肝素化样本管中。
3. 将步骤 2.2 中麻醉的小鼠固定到手术作板上。
4. 用手术刀沿腹部中线做一个完整的切口。仔细解剖并分离完整的肝组织¹²，然后用电子天平测量其重量。
   注意：使用以下公式计算每只小鼠的肝脏指数：肝脏指数 = 肝脏重量/体重。

3. 血液学分析

1. 轻轻摇晃含有步骤 2.2 中肝素化血液样本的试管，以防止血液凝固。
2. 将血液样本放在注射针下方，以确保其完全浸入针头中。
3. 单击 “自动检测” 按钮，使用全自动血细胞分析仪测量红细胞计数 （RBC）、血细胞比容 （HCT）、白细胞计数 （WBC）、血红蛋白 （HGB） 水平和血小板计数 （PLT）。

4. 肝脏代谢组学研究

1. 肝脏样品制备
   1. 用 1 mL 预冷甲醇匀浆步骤 2.4 中的肝组织样品 （50 mg）。在 4 °C 下以 18,759 x g 离心 10 分钟以去除沉淀物。
   2. 使用移液管将 200 μL 上清液转移到样品瓶中，并在 35 °C 的冷冻干燥器中真空干燥 2 小时。
   3. 将干燥的样品与 40 μL 40 mg/mL 盐酸甲氧基胺溶液的吡啶溶液在 30 °C 下反应 90 分钟。 然后，加入 80 μL N-甲基-N-（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺 （MSTFA） 和 1% 三甲基氯硅烷 （TMCS），并在 37 °C 下孵育 60 分钟。
   4. 向样品瓶中加入 10 μL 正己烷以终止衍生化反应。
2. 肝脏代谢分析
   1. 使用 GC-MS 系统分析衍生化样品 （1 μL）。使用 DB-5MS 毛细管柱（30 m × 0.25 mm × 0.25 μm）分离衍生物。
      注：烘箱温度程序条件设置如下：60 °C 1 分钟;以 10 °C/min 的速率升高至 325 °C，并保持 10 分钟。将进样器、离子源和 MS 温度分别设置为 250 °C、230 °C 和 150 °C。使用氦气 （99.999%） 作为载气，流速为 1.1 mL/min，分流比设置为 10：1。使用电子束能量为 70 eV，溶剂延迟时间为 5.9 min。
3. 数据处理和分析
   1. 使用兼容的 MassHunter 软件采集和转换原始 GC-MS 数据。
   2. 使用自动质谱反卷积和识别系统 （AMDIS） 工具进行光谱分析¹².
   3. 使用 NIST 和 HMDB 数据库鉴定所有代谢物（参见 材料表）。
   4. 将数据导入 MetaboAnalyst 工具，用于偏最小二乘判别分析 （PLS-DA）、 t 检验、通路分析和网络分析¹²。

5. 蛋白质印迹分析

1. 从小鼠肝组织中提取总蛋白
   1. 将步骤 2.4 中的 50 mg 肝组织和 250 μL 细胞裂解物添加到 1 mL 玻璃匀浆器中，并在冰上研磨 5 分钟。
   2. 使用移液器将步骤 5.1.1 中的肝组织匀浆转移到 1.5 mL 微量离心管中，并在 4 °C 下以 18,759 x g 离心 10 分钟。 然后使用移液器将上清液转移到新的 1.5 mL 试管中。
2. 测定蛋白质浓度并预处理蛋白质样品
   1. 将步骤 5.1.2 中的 2 μL 上清液、18 μL PBS 和 180 μL BCA 工作溶液添加到 96 孔微量滴定板^{中 8}.
   2. 将板在振荡器上振荡 30 秒，在 37 °C 下放置 30 分钟，并使用酶标仪测定 562 nm 处的吸光度。
3. 使用 SDS-PAGE 分离总蛋白，转移到聚偏二氟乙烯膜上，并用 5% 脱脂牛奶封闭⁸。
4. 将步骤 5.3 中的膜与抗 HIF-1α （1：1000）、VEGFA （1：1000）、GLA （1：1000）、NOS3 （1：1000） 和 β-肌动蛋白 （1：5000） 的一抗在 4 °C 下孵育过夜。
5. 将步骤 5.4 中的膜放入抗体孵育箱中，加入 10 mL TBST，并在室温下以 111 x g 水平摇动，以洗掉未结合的一抗 3 次，每次 5 分钟。
6. 从步骤 5.5 开始，向每个膜中加入 200 μL 山羊抗兔 IgG （H + L）-HRP （1：1000），并在室温下孵育 2 小时。然后，重复步骤 5.5 以洗掉未结合的二抗（山羊抗兔 IgG （H + L）-HRP）。
7. 从步骤 5.6 开始，向每个膜的表面添加 200 μL 超高灵敏度 ECL 化学发光溶液，并立即使用自动化学发光成像分析系统可视化蛋白质条带。

6. 统计分析

1. 使用统计和绘图软件分析数据，采用单因素方差分析，然后进行 Tukey 检验。
2. 将结果表示为均值±标准差 （SD），并将 P 值 < 0.05 视为统计显著性。

为确认小鼠贫血模型的成功建立并分析 SLBXS 对贫血的影响，首先研究了肝脏指数和血液学参数。 图 1 表明，与对照组相比，模型组的红细胞计数 （RBC） 、血红蛋白 （HGB） 和血细胞比容 （HCT） 显着降低 （P < 0.01）。相反，模型组的肝脏指数、白细胞计数 （WBC） 和血小板计数 （PLT） 显著升高 （P < 0.05 或 P < 0.01）。这些结果?...

贫血是一种常见疾病，影响着全世界许多人，尤其是在发展中国家¹。在中国，患者经常使用中医，包括维吾尔医学，来缓解贫血的体征和症状。SLBXS 是一种在临床实践中使用多年的维吾尔药物;然而，其对抗贫血的确切作用机制仍然知之甚少¹³。在本研究中，建立了乙酰苯肼 （APH） 诱导的贫血小鼠模型，通过代谢组学分析阐明 SLBXS 治?...

作者没有什么可披露的。

这项工作得到了少数民族科技人才专项培养计划、新疆维吾尔自治区自然科学基金（2020D03021）、湖北中医药大学中医药重点项目资金（2022ZZXZ004）和天山创新团队计划（2020D14030）的支持。