Стратегия гликомики бактериальных гликопротеинов на основе неспецифического протеолиза

В данном исследовании представлен метод гликомического анализа гликопротеинов путем комбинации расщепления проназы Е, перметилирования и масс-спектрометрического анализа. Этот метод способен анализировать все типы N-связанных гликанов, включая бактериальные N-гликаны.

Гликозилирование белка является одной из наиболее распространенных и сложных посттрансляционных модификаций. Было разработано множество методик для характеристики специфической роли гликанов, взаимосвязи между их структурами и их влияния на функции белков. Распространенным методом анализа гликанов является использование расщепления экзогликозидазы для высвобождения N-связанных гликанов из гликопротеинов или гликопептидов с использованием пептид-N-гликозидазы F (PNGase F). Тем не менее, гликан-белковые связи у бактерий различны, и не существует фермента, который мог бы высвобождать гликаны из бактериальных гликопротеинов. Кроме того, свободные гликаны также были описаны в клетках млекопитающих, бактериях, дрожжах, растениях и рыбах. В этой статье мы представляем метод, который может охарактеризовать N-связанную систему гликозилирования у Campylobacter jejuni путем обнаружения аспарагин-связанных (Asn) и свободных гликанов, которые не присоединены к их белкам-мишеням. В этом методе общие белки C. jejuni расщеплялись проназой Е с более высоким отношением ферментов к белкам (2:1−3:1) и более длительным временем инкубации (48−72 ч). Полученные Asn-гликаны и свободные гликаны затем очищали с помощью пористых графитовых углеродных картриджей, перметилировали и анализировали с помощью масс-спектрометрии.

N-гликозилирование белка является одной из наиболее распространенных и сложных посттрансляционных модификаций у эукариот¹. N-гликаны играют важную роль в сворачивании белка, а также влияют на сортировку белков в биосинтетическом трафике². Масс-спектрометрия широко используется для анализа гликанов, высвобождаемых при расщеплении экзогликозидазы (гликомика). Остальные дегликозилированные пептиды (гликопротеомика) обычно используются для идентификации последовательностей гликозилированных пептидов у эукариот³. Идентификация N-связанных гликанов у Campylobacter jejuni показала, что N-гликозилирование не ограничивается эукариотами 4,5,6,7,8. Однако для бактерий не хватает эффективных экзогликозидаз или эндогликозидаз для высвобождения олигосахаридов для анализа гликанов.

Был разработан альтернативный подход к характеристике сайтов гликозилирования и структур гликанов в гликопротеинах, который основан на использовании неспецифического протеолиза для переваривания основного остова большинства пептидов и получения псевдоолигосахаридов, которые содержат всего несколько аминокислот. Для получения псевдоолигосахаридов использовались различные неспецифические ферменты, и было обнаружено, что проназа Е обеспечивает наиболее эффективное и воспроизводимое^{пищеварение.} Мы разработали стратегию гликомики на основе проназы Е для анализа N-гликанов C. jejuni ^10,11. Псевдоолигосахариды анализировали непосредственно с помощью масс-спектрометрии с капиллярным электрофорезом (CE-MS) и/или с помощью матричной лазерной десорбционной/ионизационной времяпролетной масс-спектрометрии (MALDI-TOF MS) после перметилирования.

Здесь описан универсальный метод гликомического анализа, который использует неспецифическое расщепление и перметилирование проназы Е для изучения гликозилирования из патогена слизистой оболочки C. jejuni. Этот метод способен охарактеризовать N-связанные гликаны, экспрессируемые как эукариотическими, так и бактериальными системами, а также полезен для идентификации новых промежуточных продуктов в путях N-связанного гликозилирования.

1. Культивирование C. jejuni 11168H и экстракция общих белков

ПРИМЕЧАНИЕ: C. jejuni 11168H является гипермоторным клональным производным NCTC 11168¹².

1. Начните культивирование клеток с регидратации клеточной гранулы (приблизительно 0,15 г, NCTC) с помощью приблизительно 5 мл питательной среды Мюллера-Хинтона. Используйте несколько капель первичной пробирки с бульоном для инокуляции агаровой пластины Мюллера-Хинтона. Инкубировать при 37 °C в течение 18 ч в микроаэрофильной атмосфере, т.е. 5%_O2, 10%_CO2 и 85%_N2.
2. Соберите бактериальные газоны с 1 мл бульона Brain Heart Infusion (BHI). Разбавьте собранный урожай примерно до 1 x 10⁵ c.f.u./мл с бульоном BHI. Выращивать клетки в течение 18 ч с встряхиванием (100 об/мин) в микроаэрофильной атмосфере при 37 °С.
3. Охладите ячейки, положив пластины на лед на 10 минут, и соберите клетки центрифугированием (4 500 x g при 4 °C). Выбросьте надосадочную жидкость и промойте клетки 2x в 3 л ледяного 0,1 М Tris-HCl (pH 7,8).
4. Ресуспендируйте клетки (10 8-10 и¹¹клеток C. jejuni) в 8 мл ледяного 0,1 М Tris-HCl (pH 7,8) и лизируйте с помощью ультразвука (Таблица материалов). Выполняйте ультразвуковую обработку следующим образом: импульс 4 с, выкл 1 с, каждый раз по 1 минуте и всего три раза. 
5. Центрифугируйте при давлении 9 500 x g в течение 45 мин при 4 °C и перенесите надосадочную жидкость в другую пробирку. Диализируйте белки надосадочной жидкости 2x против 0,1 М Tris-HCl (pH 7,5) при 4 °C в течение 3 ч.
6. Определяйте концентрации белка с помощью коммерчески доступного Protein Assay¹³ (должен быть в диапазоне от 4 до 6 мкг/мкл).
7. Растворите 1 мг белков в 1 мл 0,1 М буфера Tris-HCl (pH 7,5) и добавьте в раствор 2,5 мг Pronase E. Инкубировать при 37 °C в течение 48 ч, после чего кипятить раствор при 100 °C в течение 5 мин для дезактивации фермента.
8. Храните раствор для расщепления белка при температуре -80 °C для дальнейшего использования.

2. Очистка с использованием пористого графитового углерода (ПГК)

1. Активируйте картриджи PGC (100 мг, 5 мл) путем добавления 1 мл 80% (v/v) ацетонитрила (ACN), содержащего 0,1% трифлоуксусной кислоты (TFA), и повторите 2 раза.
2. Промойте картридж PGC 1 мл воды 3 раза.
3. Загрузите расщепление проназы Е из 1 мг белка на ПГК (объем зависит от концентрации белка).
4. Каждый раз промывайте картридж 1 мл воды, чтобы удалить соли.
5. Элюируйте Asn-гликаны с 1 мл 25% АКН в 0,1 % ТЖК, а затем 1 мл 50% АКН в 0,1 % ТЖК.
6. Объедините обе фракции и высушите образцы с помощью охлаждаемого вакуумного концентратора (Таблица материалов) для дальнейшей обработки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте растворители класса MS для очистки Asn-гликаном.

3. Перметилирование Asn-гликанов

1. Солюбилизируйте высушенные Asn-гликаны со 100 мкл диметилсульфоксида (ДМСО) в пробирке объемом 1,5 мл.
2. Приготовьте суспензию ДМСО-NaOH, смешав две гранулы NaOH с 2 мл ДМСО. Добавьте в образец 200 μл суспензии DMSO-NaOH и 100 μл метилйодида.
3. Плотно закройте тюбик и помешивайте при 3 000 об/мин в течение 10 минут при комнатной температуре с помощью вихревого миксера.
4. Угасите перметилирование, добавив 1 мл воды.
5. Добавьте 1 мл хлороформа и вортекс на 1 мин для извлечения перметилированных Asn-гликанов.
6. Центрифуга при 9 000 x g в течение 3 мин. Удалите надосадочную жидкость и оставьте нижнюю хлороформную фазу с перметилированными Asn-гликанами.
7. Органический слой промыть, добавив 1 мл воды с вортексированием на 1 мин. Центрифугируйте при давлении 9 000 x g в течение 3 минут и удалите надосадочную жидкость. Повторите 2 раза.
8. Поместите органическую фазу в вытяжной шкаф и дайте ей высохнуть струей азота при комнатной температуре.
9. Храните перметилированные Asn-гликаны при температуре -80 °C для масс-спектрометрического анализа.

4. Масс-спектрометрия с ионизационной ионизацией электрораспылением (ЭСИ-МС) и анализ ЭСИ-МС/МС

1. Растворите перметилированные Asn-гликаны в 20 мкл 50% 2-пропанола в воде (v/v).
2. Анализ CE-ESI-MS проводят с использованием 90-сантиметрового капилляра из плавленого диоксида кремния с потоком 50% 2-пропанола в воде со скоростью 1 μл/мин.
   Примечание: КЭ-МС — это система, сочетающая в себе капиллярный электрофорез (КЭ) и масс-спектрометрию. CE разделяют ионы на основе их ионной подвижности. В этом протоколе система CE используется для ввода мельчайшего объема проб и выполнения обессоливания в режиме реального времени.
3. Установите напряжение ESI на 5 кВ в положительный режим.
4. Загрузите перметилированные образцы Asn-гликана при давлении 500 мбар на 0,2 мин, что соответствует примерно 100 нл.
5. Получение данных MS с помощью масс-спектрометра (Таблица материалов) с использованием следующих параметров сбора.
   1. Для полного МС установите время задержки на уровне 2,0 мс с шагом 0,1 м/з. В экспериментах MS² и MS³ с расширенным сканированием ионов продукта (EPI) установите скорость сканирования на 4000 Да/с с захватом Q0. Установите время заполнения ловушки как Динамическое и разрешение Q1 как Единица измерения. Для экспериментов MS³ установите коэффициент возбуждения, чтобы убедиться, что выбран только моноизотопный пик для одного заряженного прекурсора. Установите время возбуждения на 100 мс.

5. Анализ перметилированных гликанов методом MALDI-TOF MS

1. Растворите перметилированные Asn-гликаны в 10 мкл 50% метанола/воды (v/v).
2. Смешайте 1 мкл растворенных Asn-гликанов с 2 мкл раствора 2,5-дигидроксибензойной кислоты (10 мг/мл в 50% ацетонитриле/воде (v/v)).
3. Добавьте 1 л смешанного образца в 384-луночный планшет MALDI и подождите, пока образец полностью высохнет.
4. Вставьте пластину в масс-спектрометр MALDI-TOF, оснащенный импульсным азотным лазером (337 нм). Установите ускоряющее напряжение на 20 кВ в положительный режим.
5. Установите мощность лазера на произвольный масштаб 6 000 и получите данные в режиме положительного рефлектрона от m/z от 1 000 до 5 000.

Метод, основанный на сочетании расщепления проназы Е и перметилирования, был применен к анализу N-гликанов из экстрактов общего белка C. jejuni 11168H. На рисунке 1 показана блок-схема экспериментальной процедуры. При типичном пищеварении соотношение фе?...

В протоколе есть два важнейших шага для реализации этой универсальной стратегии гликомики. Первым важным этапом является завершение сбраживания выхлопных газов. Этот метод сильно зависит от завершения расщепления проназы Е. Таким образом, важно использовать длител?...

У авторов нет конфликта интересов.

Авторы благодарят Кеннета Чана, Дэвида Макнелли, Харальда Нотхафта, Кристин М. Шимански, Жана-Робера Бриссона и Элеонору Альтман за помощь и полезные дискуссии.