细菌糖蛋白的非特异性基于蛋白水解的糖组学策略

本研究提出了一种通过链霉蛋白酶 E 消化、过甲基化和质谱分析相结合来分析糖蛋白的糖组学方法。该方法能够分析所有类型的 N-连接糖，包括细菌 N-糖。

蛋白质糖基化是最常见和最复杂的翻译后修饰之一。已经开发了许多技术来表征聚糖的特定作用、其结构之间的关系以及它们对蛋白质功能的影响。游离寡糖分析的常用方法是使用肽-N-糖苷酶 F （PNGase F） 利用外切糖苷酶裂解从糖蛋白或糖肽中释放 N-连接聚糖。然而，细菌中的聚糖-蛋白质键是不同的，没有酶可以从细菌糖蛋白中释放聚糖。此外，游离聚糖在哺乳动物细胞、细菌、酵母、植物和鱼类中也有报道。在本文中，我们提出了一种方法，该方法可以通过检测未附着在靶蛋白上的天冬酰胺 （Asn） 连接和游离聚糖来表征空肠弯曲杆菌中的 N-连接糖基化系统。在该方法中，空肠弯曲杆菌的总蛋白被链霉酶 E 消化，具有较高的酶蛋白比 （2：1-3：1） 和更长的孵育时间 （48-72 h）。然后使用多孔石墨碳小柱纯化所得的 Asn-糖和游离糖，进行全甲基化，并通过质谱分析。

蛋白质 N-糖基化是真核生物¹ 中最常见和最复杂的翻译后修饰之一。N-糖在蛋白质折叠中起着重要作用，也对生物合成运输中的蛋白质分选产生影响²。质谱法已广泛用于分析外切糖苷酶切割（糖组学）释放的聚糖。其余的去糖基化肽（糖蛋白质组学）通常用于鉴定真核生物中糖基化肽的序列³。空肠弯曲杆菌中 N-连接聚糖的鉴定表明 N-糖基化不仅限于真核生物 4,5,6,7,8。然而，对于细菌，缺乏有效的外切糖苷酶或内切糖苷酶来释放寡糖进行聚糖分析。

已经开发了一种替代方法来表征糖蛋白中的糖基化位点和聚糖结构，该方法基于使用非特异性蛋白水解来消化大多数肽的骨架并生成仅包含少量氨基酸的假寡糖。各种非特异性酶已被用于生成假寡糖，并且已经发现链霉蛋白酶 E 提供了最有效和可重复的消化⁹。我们开发了一种基于链霉蛋白酶 E 的糖组学策略来分析空肠弯曲杆菌 N-糖^10,11。过甲基化后，通过毛细管电泳质谱 （CE-MS） 和/或基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱 （MALDI-TOF MS） 直接分析假寡糖。

这里描述了一种用于糖组学分析的通用方法，该方法使用非特异性链霉蛋白酶 E 消化和过甲基化来研究粘膜病原体空 肠梭菌的糖基化。该方法能够表征真核和细菌系统表达的 N-连接聚糖，也可用于鉴定 N-连接糖基化途径中的新中间体。

1. 空肠梭 菌 11168H 的培养和总蛋白的提取

注： 空肠 C. jejuni 11168H 是 NCTC 11168¹² 的高运动克隆衍生物。

1. 通过用大约 5 mL 的 Mueller-Hinton 培养基重新水化细胞沉淀（约 0.15 g，NCTC）来开始细胞培养。使用几滴初级肉汤管接种 Mueller-Hinton 琼脂平板。在 37 °C 下在微需氧气氛（即 5% O₂、10% CO₂ 和 85% N₂）下孵育 18 小时。
2. 用 1 mL 脑心浸液 （BHI） 肉汤收获细菌草坪。用 BHI 肉汤稀释收获物，达到大约 1 x 10⁵ c.f.u./mL。在 37 °C 的微需氧气氛中振荡 （100 rpm） 培养细胞 18 小时。
3. 通过将板置于冰上10分钟来冷却细胞，并通过离心（4°C下4,500 x g ）收获细胞。弃去上清液，在 3 L 冰冷的 0.1 M Tris-HCl （pH 7.8） 中洗涤细胞 2 次。
4. 将细胞（10、^8-10、¹¹ 个空肠弯曲细胞）重悬于 8 mL 冰冷的 0.1 M Tris-HCl （pH 7.8） 中，并通过超声处理裂解（材料表）。按如下方式进行超声处理：4 秒脉冲，1 秒关闭，每次 1 分钟，总共 3 次。 
5. 在 4 °C 下以 9,500 x g 离心 45 分钟，然后将上清液转移到另一个试管中。在 4 °C 下用 0.1 M Tris-HCl （pH 7.5） 透析上清液中的蛋白质 2 次，持续 3 小时。
6. 使用市售的 Protein Assay¹³ 测定蛋白质浓度（应在 4 至 6 μg/μL 的范围内）。
7. 将 1 mg 蛋白质溶解在 1 mL 0.1 M Tris-HCl 缓冲液 （pH 7.5） 中，并向溶液中加入 2.5 mg 链霉蛋白酶 E。在 37 °C 下孵育 48 小时，然后将溶液在 100 °C 下煮沸 5 分钟以使酶失活。
8. 将蛋白质消化溶液储存在 -80 °C 以备进一步使用。

2. 使用多孔石墨碳 （PGC） 进行纯化

1. 通过添加 1 mL 含有 0.1% 三氟乙酸 （TFA） 的 80% （v/v） 乙腈 （ACN） 来激活 PGC 小柱（100 mg，5 mL），并重复 2 次。
2. 用 1 mL 水清洗 PGC 小柱 3 次。
3. 从 PGC 上的 1 mg 蛋白质中加载链霉蛋白酶 E 消化物（体积取决于蛋白质浓度）。
4. 每次用 1 mL 水清洗小柱 3 次，以去除盐分。
5. 用 1 mL 25% ACN 和 0.1% TFA 洗脱 Asn-糖，然后用 1 mL 50% ACN 和 0.1% TFA 洗脱。
6. 混合两种馏分，并使用冷冻真空浓缩器（材料表）干燥样品以进行进一步处理。
   注：使用 MS 级溶剂进行 Asn-糖纯化。

3. Asn-聚糖的过甲基化

1. 在 1.5 mL 试管中用 100 μL 二甲基亚砜 （DMSO） 溶解干燥的 Asn-糖。
2. 通过将两个 NaOH 颗粒与 2 mL DMSO 混合来制备 DMSO-NaOH 浆液。向样品中加入 200 μL DMSO-NaOH 浆液和 100 μL 碘甲烷。
3. 盖紧管子，并在室温下用涡旋混合器以 3,000 rpm 搅拌 10 分钟。
4. 加入 1 mL 水淬灭过甲基化。
5. 加入 1 mL 氯仿并涡旋 1 分钟以提取全甲基化 Asn-糖。
6. 以 9,000 x g 离心 3 分钟。去除上清液，用全甲基化 Asn-聚糖保留下层氯仿相。
7. 加入 1 mL 水涡旋 1 分钟，洗涤有机层。以 9,000 x g 离心 3 分钟并去除上清液。重复 2 次。
8. 将有机相放入通风橱中，在室温下用氮气流干燥。
9. 将全甲基化 Asn-聚糖储存在 -80 °C 用于质谱分析。

4. 电喷雾电离质谱 （ESI-MS） 和 ESI-MS/MS 分析

1. 将全甲基化 Asn-糖溶解在 20 μL 50% 2-丙醇的水溶液中 （v/v）。
2. 使用 90 cm 裸熔融石英毛细管进行 CE-ESI-MS 分析，鞘流为 50% 2-丙醇水溶液，流速为 1 μL/min。
   注：CE-MS 是一种结合了毛细管电泳 （CE） 和质谱的系统。CE 根据离子淌度分离离子。在该方案中，使用 CE 系统引入微量样品并进行在线脱盐。
3. 在正模式下将 ESI 电压设置为 5 kV。
4. 以 500 mbar 的压力加载全甲基化 Asn-糖样品 0.2 min，相当于约 100 nL。
5. 使用以下采集参数，使用质谱仪（材料表）采集 MS 数据。
   1. 对于全 MS，将驻留时间设置为 0.1 m/z 单位每步 2.0 ms。在使用增强型子离子扫描 （EPI） 的 MS² 和 MS³ 实验中，将扫描速度设置为 4,000 Da/s，并使用 Q0 捕获。将陷阱填充时间设置为 Dynamic（ 动态 ），将 Q1 的分辨率设置为 Unit（单位）。对于 MS³ 实验，设置激发系数以确保仅选择单个带电母离子的单同位素峰。将激发时间设置为 100 ms。

5. 使用 MALDI-TOF MS 分析全甲基化游离寡糖

1. 将全甲基化的 Asn-糖溶解在 10 μL 50% 甲醇/水 （v/v） 中。
2. 将 1 μL 溶解的 Asn-糖与 2 μL 2,5-二羟基苯甲酸溶液（10 mg/mL，溶于 50% 乙腈/水 （v/v））中）混合。
3. 将 1 μL 混合样品添加到 384 孔 MALDI 板中，并等待样品完全干燥。
4. 将板插入配备有脉冲氮激光 （337 nm） 的 MALDI-TOF 质谱仪中。在正模式下将加速电压设置为 20 kV。
5. 将激光功率设置为任意比例 6,000，并在 m/z 1,000 到 5,000 的正反射器模式下采集数据。

基于链霉酶 E 消化和过甲基化组合的方法应用于空肠弯曲杆菌 11168H 总蛋白提取物的 N-糖分析。图 1 显示了实验程序的流程图。在典型的消化中，酶与糖蛋白的比例设定在 1：100 到 1：20 之间。在这里，链霉蛋白酶 E 与蛋白质的比例增加到 2：1-3：1，并通过在 37 °C 下孵育 48 小时采用更长的消化时间以获得废气消化。然后通过 PGC 纯化废气消化...

方案中有两个关键步骤来实施这种通用的糖组学策略。第一个关键步骤是完成废气消化。该方法在很大程度上依赖于链霉蛋白酶 E 消化的完成。因此，必须使用较长的消化时间和较高的酶蛋白比。通常，建议对链霉蛋白酶 E/蛋白使用 2：1-3：1 的比例，孵育时间为 48 小时。已经证明，这种提出的废气消解产生了以单个氨基酸为主要成分的聚糖¹⁰。废气消?...

作者没有利益冲突。

作者感谢 Kenneth Chan、David J. McNally、Harald Nothaft、Christine M. Szymanski、Jean-Robert Brisson 和 Eleonora Altman 提供的帮助和有益的讨论。