Unspezifische Proteolyse-basierte Glykomik-Strategie für bakterielle Glykoproteine

In dieser Arbeit wird eine Methode zur Glykomik-Analyse von Glykoproteinen durch eine Kombination aus Pronase-E-Verdau, Permethylierung und Massenspektrometrie vorgestellt. Diese Methode ist in der Lage, alle Arten von N-verknüpften Glykanen zu analysieren, einschließlich bakterieller N-Glykane.

Die Proteinglykosylierung ist eine der häufigsten und komplexesten posttranslationalen Modifikationen. Es wurden viele Techniken entwickelt, um die spezifische Rolle von Glykanen, die Beziehung zwischen ihren Strukturen und ihren Einfluss auf die Funktionen von Proteinen zu charakterisieren. Eine gängige Methode zur Glykananalyse ist die Verwendung der Exoglykosidase-Spaltung, um N-verknüpfte Glykane aus Glykoproteinen oder Glykopeptiden unter Verwendung von Peptid-N-Glykosidae F (PNGase F) freizusetzen. Die Glykan-Protein-Bindungen in Bakterien sind jedoch unterschiedlich und es steht kein Enzym zur Verfügung, um Glykane aus bakteriellen Glykoproteinen freizusetzen. Darüber hinaus wurden freie Glykane auch in Säugetierzellen, Bakterien, Hefen, Pflanzen und Fischen beschrieben. In diesem Artikel stellen wir eine Methode vor, die das N-verknüpfte Glykosylierungssystem in Campylobacter jejuni charakterisieren kann, indem Asparagin (Asn)-gebundene und freie Glykane nachgewiesen werden, die nicht an ihre Zielproteine gebunden sind. Bei dieser Methode wurden Gesamtproteine von C. jejuni von Pronase E mit einem höheren Enzym-Protein-Verhältnis (2:1-3:1) und einer längeren Inkubationszeit (48-72 h) verdaut. Die resultierenden Asn-Glykane und freien Glykane wurden dann mit porösen graphitischen Kohlenstoffpatronen gereinigt, permethyliert und mittels Massenspektrometrie analysiert.

Die Protein-N-Glykosylierung ist eine der häufigsten und komplexesten posttranslationalen Modifikationen in Eukaryoten¹. N-Glykane spielen eine wesentliche Rolle bei der Proteinfaltung und haben auch einen Einfluss auf die Proteinsortierung im Biosyntheseverkehr². Die Massenspektrometrie wird häufig bei der Analyse von Glykanen eingesetzt, die durch die Exoglykosidase-Spaltung (Glykomik) freigesetzt werden. Die verbleibenden deglykosylierten Peptide (Glykoproteomik) wurden häufig verwendet, um die Sequenzen glykosylierter Peptide in Eukaryoten^{zu identifizieren 3}. Die Identifizierung von N-verknüpften Glykanen in Campylobacter jejuni deutet darauf hin, dass die N-Glykosylierung nicht auf Eukaryoten beschränkt ist 4,5,6,7,8. Für Bakterien fehlt es jedoch an wirksamen Exoglykosidasen oder Endoglykosidasen, um Oligosaccharide für die Glykananalyse freizusetzen.

Zur Charakterisierung von Glykosylierungsstellen und Glykanstrukturen in Glykoproteinen wurde ein alternativer Ansatz entwickelt, der auf der Verwendung von unspezifischer Proteolyse basiert, um das Rückgrat der meisten Peptide zu verdauen und Pseudo-Oligosaccharide zu erzeugen, die nur wenige Aminosäuren enthalten. Verschiedene unspezifische Enzyme wurden zur Erzeugung von Pseudo-Oligosacchariden verwendet, und es wurde festgestellt, dass Pronase E den effizientesten und reproduzierbarsten Aufschluss bot⁹. Wir haben eine Glykomics-Strategie auf Basis von Pronase E entwickelt, um C. jejuni N-Glykane^10,11 zu analysieren. Die Pseudo-Oligosaccharide wurden direkt mittels Kapillarelektrophorese-Massenspektrometrie (CE-MS) und/oder mittels matrixgestützter Laserdesorption/Ionisations-Flugzeit-Massenspektrometrie (MALDI-TOF MS) nach Permethylierung analysiert.

Hier wird eine universelle Methode für die Glykomics-Analyse beschrieben, die den unspezifischen Pronase-E-Verdau und die Permethylierung verwendet, um die Glykosylierung aus dem Schleimhauterreger C. jejuni zu untersuchen. Diese Methode ist in der Lage, N-verknüpfte Glykane zu charakterisieren, die sowohl von eukaryotischen als auch von bakteriellen Systemen exprimiert werden, und ist auch nützlich bei der Identifizierung neuer Zwischenprodukte in N-verknüpften Glykosylierungswegen.

1. Kultur von C. jejuni 11168H und Extraktion der Gesamtproteine

HINWEIS: C. jejuni 11168H ist ein hypermotiles klonales Derivat von NCTC 11168¹².

1. Beginnen Sie die Zellkultur, indem Sie das Zellpellet (ca. 0,15 g, NCTC) mit ca. 5 ml Mueller-Hinton-Kulturmedium rehydrieren. Verwenden Sie einige Tropfen des primären Brühröhrchens, um eine Mueller-Hinton-Agarplatte zu impfen. Inkubieren Sie bei 37 °C für 18 h unter mikroaerophiler Atmosphäre, d. h. 5 % O₂, 10 % CO₂ und 85 % N₂.
2. Ernten Sie bakterielle Rasenflächen mit 1 ml Brain Heart Infusion (BHI) Brühe. Verdünnen Sie die Ernte auf ca. 1 x 10⁵ c.f.u./ml mit BHI-Brühe. Züchten Sie die Zellen 18 h lang unter Schütteln (100 U/min) in einer mikroaerophilen Atmosphäre bei 37 °C.
3. Kühlen Sie die Zellen, indem Sie die Platten 10 Minuten lang auf Eis legen und die Zellen durch Zentrifugation (4.500 x g bei 4 °C) ernten. Entsorgen Sie den Überstand und waschen Sie die Zellen 2x in 3 L eiskaltem 0,1 M Tris-HCl (pH 7,8).
4. Die Zellen (10,^8-10,¹¹ C. jejuni ) werden in 8 ml eiskaltem 0,1 M Tris-HCl (pH 7,8) resuspendiert und durch Beschallung lysiert (Tabelle der Materialien). Die Beschallung ist wie folgt durchzuführen: 4 s Impuls, 1 s aus, jeweils 1 Minute und insgesamt dreimal.
5. Bei 9.500 x g für 45 min bei 4 °C zentrifugieren und den Überstand in ein anderes Röhrchen umfüllen. Dialysieren Sie Proteine im Überstand 2x gegen 0,1 M Tris-HCl (pH 7,5) bei 4 °C für 3 h.
6. Bestimmen Sie die Proteinkonzentrationen mit einem kommerziell erhältlichen Protein Assay¹³ (sollte in einem Bereich von 4 bis 6 μg/μL liegen).
7. Löse 1 mg Proteine in 1 ml 0,1 M Tris-HCl-Puffer (pH 7,5) und füge der Lösung 2,5 mg Pronase E hinzu. Inkubieren Sie die Lösung 48 Stunden lang bei 37 °C und kochen Sie die Lösung anschließend 5 Minuten lang bei 100 °C, um das Enzym zu deaktivieren.
8. Lagern Sie die Proteinaufschlusslösung zur weiteren Verwendung bei -80 °C.

2. Reinigung mit porösem graphitischem Kohlenstoff (PGC)

1. Aktivieren Sie PGC-Patronen (100 mg, 5 mL) durch Zugabe von 1 mL 80 % (v/v) Acetonitril (ACN) mit 0,1 % Trifluoessigsäure (TFA) und wiederholen Sie den Vorgang 2x.
2. Waschen Sie die PGC-Kartusche 3x mit 1 mL Wasser.
3. Laden Sie die Pronase E-Verdauung von 1 mg Protein auf PGC (das Volumen hängt von der Proteinkonzentration ab).
4. Waschen Sie die Kartusche jedes Mal 3x mit 1 mL Wasser, um Salze zu entfernen.
5. Eluieren Sie Asn-Glykane mit 1 ml 25 % ACN in 0,1 % TFA, gefolgt von 1 ml 50 % ACN in 0,1 % TFA.
6. Bündeln Sie beide Fraktionen und trocknen Sie die Proben mit dem gekühlten Vakuumkonzentrator (Table of Materials) für die weitere Verarbeitung.
   HINWEIS: Verwenden Sie Lösungsmittel in MS-Qualität für die Asn-Glykan-Reinigung.

3. Permethylierung von Asn-Glykanen

1. Solubilizieren Sie getrocknete Asn-Glykane mit 100 μl Dimethylsulfoxid (DMSO) in einem 1,5 mL Röhrchen.
2. Bereiten Sie DMSO-NaOH-Aufschlämmung vor, indem Sie zwei Pellets NaOH mit 2 mL DMSO mischen. Geben Sie 200 μl DMSO-NaOH-Aufschlämmung und 100 μl Methyliodid in die Probe.
3. Verschließen Sie das Röhrchen fest und rühren Sie 10 Minuten lang bei 3.000 U/min bei Raumtemperatur mit einem Vortex-Mischer.
4. Quälen Sie die Permethylierung, indem Sie 1 ml Wasser hinzufügen.
5. Fügen Sie 1 ml Chloroform hinzu und wirbeln Sie 1 Minute lang, um permethylierte Asn-Glykane zu extrahieren.
6. Zentrifugieren bei 9.000 x g für 3 min. Den Überstand entfernen und die untere Chloroformphase mit permethylierten Asn-Glykanen belassen.
7. Waschen Sie die organische Schicht, indem Sie 1 mL Wasser hinzufügen und 1 Minute lang vortexen. Bei 9.000 x g 3 min zentrifugieren und den Überstand entfernen. 2x wiederholen.
8. Legen Sie die organische Phase in einen Abzug und lassen Sie sie mit einem Stickstoffstrom bei Raumtemperatur trocknen.
9. Permethylierte Asn-Glykane für die massenspektrometrische Analyse bei -80 °C lagern.

4. Elektrospray-Ionisations-Massenspektrometrie (ESI-MS) und ESI-MS/MS-Analyse

1. Permethylierte Asn-Glykane werden in 20 μl 50%igem 2-Propanol in Wasser (v/v) gelöst.
2. Führen Sie die CE-ESI-MS-Analyse mit einer 90 cm langen Kapillare aus blankem Quarzglas mit einem Mantelfluss von 50 % 2-Propanol in Wasser bei 1 μL/min durch.
   HINWEIS: CE-MS ist ein System, das Kapillarelektrophorese (CE) und Massenspektrometrie kombiniert. CE trennt Ionen auf der Grundlage ihrer Ionenmobilität. In diesem Protokoll wird das CE-System eingesetzt, um ein winziges Probenvolumen einzubringen und eine Online-Entsalzung durchzuführen.
3. Stellen Sie die ESI-Spannung auf 5 kV im positiven Modus ein.
4. Permethylierte Asn-Glykan-Proben werden 0,2 min lang bei 500 mbar geladen, was etwa 100 nL entspricht.
5. Erfassen Sie MS-Daten mit einem Massenspektrometer (Materialtabelle) unter Verwendung der folgenden Erfassungsparameter.
   1. Für volle MS stellen Sie die Verweilzeit auf 2,0 ms pro Schritt von 0,1 m/z Einheit ein. In den Experimenten MS² und^{MS 3} mit Enhanced Product Ion Scan (EPI) wurde die Scangeschwindigkeit auf 4.000 Da/s mit Q0-Trapping eingestellt. Legen Sie die Füllzeit der Überfüllung auf dynamisch und die Auflösung von Q1 auf Einheit fest. Stellen Sie für MS^{3-Experimente} den Anregungskoeffizienten so ein, dass nur der Monoisotopen-Peak für einen einzelnen geladenen Vorläufer ausgewählt wird. Stellen Sie die Anregungszeiten auf 100 ms ein.

5. Analyse von permethylierten Glykanen mittels MALDI-TOF MS

1. Permethylierte Asn-Glykane werden in 10 μl 50 % Methanol/Wasser (v/v) gelöst.
2. Mischen Sie 1 μl gelöste Asn-Glykane mit 2 μl 2,5-Dihydroxybenzoesäurelösung (10 mg/ml in 50 % Acetonitril/Wasser (v/v)).
3. Geben Sie 1 μl der gemischten Probe in eine 384-Well-MALDI-Platte und warten Sie, bis die Probe vollständig getrocknet ist.
4. Setzen Sie die Platte in ein MALDI-TOF-Massenspektrometer ein, das mit einem gepulsten Stickstofflaser (337 nm) ausgestattet ist. Stellen Sie die Beschleunigungsspannung auf 20 kV im positiven Modus ein.
5. Stellen Sie die Laserleistung auf eine beliebige Skala von 6.000 ein und erfassen Sie Daten im positiven Reflektronmodus von m/z 1.000 bis 5.000.

Die Methode, die auf der Kombination von Pronase-E-Aufschluss und Permethylierung basiert, wurde auf die N-Glykan-Analyse aus Gesamtproteinextrakten von C. jejuni 11168H angewendet. Abbildung 1 zeigt ein Flussdiagramm des experimentellen Verfahrens. Bei der typischen Verdauung wurde das Verhältnis von Enzym zu Glykoprotein zwischen 1:100 und 1:20 eingestellt. Hier wurde das Verhältnis von Pronase E zu Protein auf 2:1-3:1 erhöht und ein längerer ...

Das Protokoll für die Umsetzung dieser universellen Glykomics-Strategie besteht aus zwei entscheidenden Schritten. Der erste kritische Schritt ist der Abschluss der Abgasreinigung. Diese Methode hängt stark vom Abschluss des Pronase-E-Aufschlusses ab. Es ist daher wichtig, eine lange Verdauungszeit und ein hohes Enzym-Protein-Verhältnis zu verwenden. Typischerweise wird empfohlen, ein Verhältnis von 2:1-3:1 für Pronase E/Protein und eine Inkubationszeit von 48 h zu verwenden. Es wur...

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte.

Die Autoren danken Kenneth Chan, David J. McNally, Harald Nothaft, Christine M. Szymanski, Jean-Robert Brisson und Eleonora Altman für die Unterstützung und hilfreichen Diskussionen.