JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

تقدم هذه الدراسة طريقة لتحليل الجلوكوميات للبروتينات السكرية عن طريق مزيج من هضم البروناز E ، والبيرميثيلاسیون ، وتحليل الطيف الكتلي. هذه الطريقة قادرة على تحليل جميع أنواع الجليكان المرتبطة ب N ، بما في ذلك N-glycans البكتيرية.

Abstract

يعد ارتباط البروتين بالارتباط أحد أكثر التعديلات شيوعا وتعقيدا بعد الترجمة. تم تطوير العديد من التقنيات لتوصيف الأدوار المحددة للجليكانات ، والعلاقة بين هياكلها وتأثيرها على وظائف البروتينات. تتمثل إحدى الطرق الشائعة لتحليل الجليكان في استخدام انقسام exoglycosidase لإطلاق الجليكان المرتبط ب N من البروتينات السكرية أو جليكوببتيدات باستخدام الببتيد-N-Glycosidase F (PNGase F). ومع ذلك ، فإن روابط البروتين الجليكان في البكتيريا مختلفة ولا يوجد إنزيم متاح لإطلاق الجليكان من البروتينات السكرية البكتيرية. بالإضافة إلى ذلك ، تم وصف الجليكان الحر أيضا في خلايا الثدييات والبكتيريا والخميرة والنباتات والأسماك. في هذه المقالة ، نقدم طريقة يمكن أن تميز نظام الارتباط بالجليكوزيل المرتبط ب N في العطيفة الصائمية عن طريق الكشف عن الجليكان الحر المرتبط بالأسباراجين (Asn) غير المرتبط بالبروتينات المستهدفة. في هذه الطريقة ، البروتينات الكلية من C. jejuni تم هضمها بواسطة Pronase E بنسبة إنزيم إلى بروتين أعلى (2: 1-3: 1) ووقت حضانة أطول (48-72 ساعة). ثم تم تنقية Asn-glycans الناتجة والجليكان الحر باستخدام خراطيش الكربون الجرافيتية المسامية ، وبيرميلاتها ، وتحليلها بواسطة قياس الطيف الكتلي.

Introduction

يعد Protein N-glycosylation أحد أكثر التعديلات شيوعا وتعقيدا بعد الترجمة في حقيقيات النوى1. تلعب N-glycans دورا أساسيا في طي البروتين ولها أيضا تأثير على فرز البروتين في حركة التخليق الحيوي2. تم استخدام قياس الطيف الكتلي على نطاق واسع في تحليل الجليكان المنبعث من انقسام جليكوزيداز خارجي (الجليكوميكس). تم استخدام الببتيدات المتبقية منزوعة الغليكوزيلات (glycoproteomics) بشكل شائع لتحديد تسلسل الببتيدات الجليكوزيلية في حقيقيات النوى3. يشير تحديد الجليكان المرتبط ب N في العطيفة الصائمية إلى أن الارتباط بالجليكوزيل N لا يقتصر على حقيقيات النوى4،5،6،7،8. ومع ذلك ، بالنسبة للبكتيريا ، هناك نقص في exoglycosidases الفعالة أو endoglycosidases لإطلاق السكريات قليلة السكاريد لتحليل الجليكان.

تم تطوير نهج بديل لتوصيف مواقع الارتباط بالجليكوزيل وهياكل الجليكان في البروتينات السكرية ، والذي يعتمد على استخدام التحلل البروتيني غير المحدد لهضم العمود الفقري لمعظم الببتيدات وتوليد السكريات قليلة السكريات الزائفة التي تحتوي فقط على عدد قليل من الأحماض الأمينية. تم استخدام العديد من الإنزيمات غير المحددة لتوليد السكريات قليلة السكريات الزائفة ووجد أن Pronase E يوفر الهضم الأكثر كفاءة وقابلية للتكرار9. لقد طورنا استراتيجية علم السكر على أساس Pronase E لتحليل C. jejuni N-glycans10،11. تم تحليل السكريات قليلة السكريات الزائفة مباشرة عن طريق قياس الطيف الكتلي للرحلان الكهربائي الشعري (CE-MS) و / أو عن طريق الامتصاص بالليزر بمساعدة المصفوفة / قياس الطيف الكتلي لوقت الرحلة (MALDI-TOF MS) بعد الميثيل.

هنا ، يتم وصف طريقة عالمية لتحليل الجلوكوميات التي تستخدم هضم Pronase E غير المحدد والبيرميثيلاسیون لدراسة الارتباط بالجليكوزيل من مسببات الأمراض المخاطية C. jejuni. هذه الطريقة قادرة على توصيف الجليكان المرتبط ب N المعبر عنها كل من أنظمة حقيقية النواة والبكتيرية وهي مفيدة أيضا في تحديد المواد الوسيطة الجديدة في مسارات الارتباط بالجليكوزيل المرتبطة ب N.

Protocol

1. زراعة C. jejuni 11168H واستخراج البروتينات الكلية

ملاحظة: C. jejuni 11168H هو مشتق نسيلي مفرط الحركة من NCTC 1116812.

  1. ابدأ زراعة الخلايا عن طريق ترطيب حبيبات الخلية (حوالي 0.15 جم ، NCTC) بحوالي 5 مل من وسط ثقافة مولر هينتون. استخدم عدة قطرات من أنبوب المرق الأساسي لتلقيح لوحة أجار مولر-هينتون. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 18 ساعة تحت جو دقيق ، أي 5٪ O2 ، 10٪ CO2 ، و 85٪ N2.
  2. حصاد المروج البكتيرية مع 1 مل من مرق تسريب القلب في الدماغ (BHI). خفف المحصول ليصل إلى حوالي 1 × 105 cf.u. / مل مع مرق BHI. تنمو الخلايا لمدة 18 ساعة مع الاهتزاز (100 دورة في الدقيقة) في جو دقيق عند 37 درجة مئوية.
  3. قم بتبريد الخلايا عن طريق وضع الصفائح على الجليد لمدة 10 دقائق وحصاد الخلايا عن طريق الطرد المركزي (4,500 × جم عند 4 درجات مئوية). تخلص من المادة الطافية واغسل الخلايا 2x في 3 لتر من الثلج البارد 0.1 M Tris-HCl (الرقم الهيدروجيني 7.8).
  4. إعادة تعليق الخلايا (108-10 11 C. jejuni الخلايا) في 8 مل من الجليد البارد 0.1 M Tris-HCl (الرقم الهيدروجيني 7.8) والليز عن طريق الصوتنة (جدول المواد). أداء صوتنة على النحو التالي: 4 ثانية نبض, 1 ثانية قبالة, 1 دقيقة في كل مرة وثلاث مرات المجموع.
  5. جهاز طرد مركزي عند 9,500 × جم لمدة 45 دقيقة عند 4 درجات مئوية ونقل المادة الطافية إلى أنبوب آخر. غسيل البروتينات في المادة الطافية 2x مقابل 0.1 M Tris-HCl (الرقم الهيدروجيني 7.5) عند 4 درجات مئوية لمدة 3 ساعات.
  6. حدد تركيزات البروتين باستخدام مقايسة البروتين13 المتوفرة تجاريا (يجب أن تكون في نطاق من 4 إلى 6 ميكروغرام / ميكرولتر).
  7. قم بإذابة 1 مجم من البروتينات في 1 مل من 0.1 M Tris-HCl المؤقت (الرقم الهيدروجيني 7.5) وأضف 2.5 مجم من Pronase E إلى المحلول. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 48 ساعة ، متبوعا بغلي المحلول عند 100 درجة مئوية لمدة 5 دقائق لتعطيل الإنزيم.
  8. قم بتخزين محلول هضم البروتين عند -80 درجة مئوية لمزيد من الاستخدام.

2. تنقية باستخدام الكربون الجرافيتي المسامي (PGC)

  1. قم بتنشيط خراطيش PGC (100 مجم ، 5 مل) عن طريق إضافة 1 مل من 80٪ (حجم / حجم) أسيتونيتريل (ACN) يحتوي على 0.1٪ حمض ثلاثي فلورو أسيتيك (TFA) وكرر 2x.
  2. اغسل خرطوشة PGC ب 1 مل من الماء 3x.
  3. قم بتحميل هضم Pronase E من 1 مجم من البروتين على PGC (يعتمد الحجم على تركيز البروتين).
  4. اغسل الخرطوشة 3 مرات ب 1 مل من الماء في كل مرة لإزالة الأملاح.
  5. Elute Asn-glycans مع 1 مل من 25٪ ACN في 0.1٪ TFA ، متبوعا ب 1 مل من 50٪ ACN في 0.1٪ TFA.
  6. قم بتجميع كلا الكسرين وجفف العينات باستخدام مكثف التفريغ المبرد (جدول المواد) لمزيد من المعالجة.
    ملاحظة: استخدم مذيبات درجة MS لتنقية Asn-glycan.

3. بيرمثيل Asn-glycans

  1. قم بإذابة Asn-glycans المجففة ب 100 ميكرولتر من ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) في أنبوب 1.5 مل.
  2. تحضير ملاط DMSO-NaOH عن طريق خلط حبيبات من هيدروكسيد الصوديوم مع 2 مل من DMSO. أضف 200 ميكرولتر من ملاط DMSO-NaOH و 100 ميكرولتر من يوديد الميثيل إلى العينة.
  3. قم بتغطية الأنبوب بإحكام وحركه بسرعة 3,000 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة باستخدام خلاط دوامة.
  4. قم بإخماد البيريثيل بإضافة 1 مل من الماء.
  5. أضف 1 مل من الكلوروفورم والدوامة لمدة 1 دقيقة لاستخراج بيرميثيل Asn-glycans.
  6. جهاز طرد مركزي عند 9,000 × جم لمدة 3 دقائق. قم بإزالة المادة الطافية واحتفظ بمرحلة الكلوروفورم السفلية باستخدام الجليكان البيرميثلي.
  7. اغسل الطبقة العضوية بإضافة 1 مل من الماء مع الدوامة لمدة 1 دقيقة. جهاز طرد مركزي عند 9,000 × جم لمدة 3 دقائق وإزالة المادة الطافية. كرر 2x.
  8. ضع المرحلة العضوية في غطاء الدخان واتركها تجف بتيار نيتروجين في درجة حرارة الغرفة.
  9. قم بتخزين البيرميثيل Asn-glycans عند -80 درجة مئوية لتحليل القياس الطيفي الكتلي.

4. قياس الطيف الكتلي للتأين بالرش الكهربائي (ESI-MS) وتحليل ESI-MS / MS

  1. قم بإذابة بيرميثيل Asn-glycans في 20 ميكرولتر من 50٪ 2-propanol في الماء (حجم / حجم).
  2. قم بإجراء تحليل CE-ESI-MS باستخدام شعيرات دموية عارية من السيليكا المنصهرة مقاس 90 سم مع تدفق غمد بنسبة 50٪ 2-بروبانول في الماء عند 1 ميكرولتر / دقيقة.
    ملاحظة: CE-MS هو نظام يجمع بين الرحلان الكهربائي الشعري (CE) وقياس الطيف الكتلي. CE تفصل الأيونات بناء على حركتها الأيونية. في هذا البروتوكول ، يتم استخدام نظام CE لإدخال حجم دقيق من العينات وإجراء تحلية المياه عبر الإنترنت.
  3. اضبط جهد ESI على 5 كيلو فولت في الوضع الموجب.
  4. قم بتحميل عينات Asn-glycan بيرميثيل عند 500 ملي بار لمدة 0.2 دقيقة ، أي ما يعادل حوالي 100 nL.
  5. الحصول على بيانات MS باستخدام مطياف الكتلة (جدول المواد) باستخدام معلمات الاستحواذ التالية.
    1. للحصول على MS الكامل ، قم بتعيين وقت السكون عند 2.0 مللي ثانية لكل خطوة من وحدة 0.1 م / تز. في تجارب MS2 و MS3 مع المسح الأيوني المحسن للمنتج (EPI) ، اضبط سرعة المسح الضوئي على 4,000 Da / s ، مع الاقتباس اللوني Q0. قم بتعيين وقت تعبئة التراكب اللوني على أنه ديناميكي ودقة Q1 كوحدة. بالنسبة لتجارب MS3 ، قم بتعيين معامل الإثارة للتأكد من تحديد الذروة أحادية النظير فقط لسلائف مشحونة واحدة. اضبط أوقات الإثارة على 100 مللي ثانية.

5. تحليل الجليكان البيرميثيل بواسطة MALDI-TOF MS

  1. قم بإذابة البيرميثيل Asn-glycans في 10 ميكرولتر من 50٪ ميثانول / ماء (حجم / حجم).
  2. امزج 1 ميكرولتر من Asn-glycans المذاب مع 2 ميكرولتر من محلول حمض ثنائي هيدروكسي بنزويك 2،5 (10 مجم / مل في 50٪ أسيتونيتريل / ماء (حجم / حجم)).
  3. أضف 1 ميكرولتر من العينة المختلطة إلى صفيحة MALDI سعة 384 بئرا وانتظر حتى تجف العينة تماما.
  4. أدخل اللوحة في مطياف الكتلة MALDI-TOF المزود بليزر نيتروجين نابض (337 نانومتر). اضبط الجهد المتسارع على 20 كيلو فولت في الوضع الموجب.
  5. اضبط طاقة الليزر على مقياس تعسفي يبلغ 6,000 واحصل على البيانات في وضع العاكس الموجب من m / z 1,000 إلى 5,000.

النتائج

تم تطبيق الطريقة القائمة على مزيج من هضم البروناز E والبيرميثيل على تحليل N-glycan من مستخلصات البروتين الكلية ل C. jejuni 11168H. يوضح الشكل 1 مخططا انسيابيا للإجراء التجريبي. في الهضم النموذجي ، تم تعيين نسبة الإنزيم إلى البروتين السكري بين 1: 100 إلى 1:20. هنا ، تم...

Discussion

هناك خطوتان حاسمتان في البروتوكول لتنفيذ هذه الاستراتيجية العالمية لعلم السكر في الدم. الخطوة الأولى الحاسمة هي الانتهاء من هضم العادم. تعتمد هذه الطريقة بشدة على اكتمال هضم Pronase E. لذلك من الضروري استخدام وقت هضم طويل ونسبة عالية من الإنزيم إلى البروتين. عادة ، يقترح است...

Disclosures

لا يوجد تضارب في المصالح بين المؤلفين.

Acknowledgements

يشكر المؤلفون كينيث تشان وديفيد جيه ماكنالي وهارالد نوثافت وكريستين إم زيمانسكي وجان روبرت بريسون وإليونورا ألتمان على المساعدة والمناقشات المفيدة.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
2,5-dihydroxybenzoic acid (DHB),Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)149357
2-PropanolFisher Scientific( Ottawa, Ontario,Canada)AA22906K7
4000 Q-TrapAB Sciex (Concord, Canada)Mass spectrometer
4800 MALDI-TOF/TOFApplied Biosystems (Foster City, CA)Mass spectrometer
acetonitrile (ACN)Fisher Scientific( Ottawa, Ontario,Canada)A996-4
Brain Heart Infusion (BHI) brothSigma-Aldrich (St. Louis, MO)5121
C18 Sep-Pak cartridgesWaters (Milford, MA).WAT036945
chloroformSigma-Aldrich (St. Louis, MO)CX1054
DifcoFisher Science (Ottawa, Ontario,Canada)DF0037-17-8Fisher Science
dimethyl sulfoxide (DMSO)Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)276855
Eppendorf tubeDiamed (Missisauga, Ontario,Canada)SPE155-N
glacial acetic acidSigma-Aldrich (St. Louis, MO)A6283
methanolFisher Scientific, Ottawa, Ontario,Canada)A544-4
methyl iodideSigma-Aldrich (St. Louis, MO)289566
PGC cartridgeThermo Scientific(Waltham,MA)60106-303Porous graphitic carbon
Pronase ESigma-Aldrich (St. Louis, MO)7433-2
Protein Assay KitBio-rad (Mississauga, Ontario, Canada)5000001
Refrigerated vacuum concentratorThermo Scientific(Waltham,MA)SRF110P2-230
sodium hydroxideSigma-Aldrich (St. Louis, MO)367176
Sonicator Ultrasonic ProcessorMandel Scientific (Guelph, Ontario,Canada)XL 2020
Trifluoacetic acid (TFA)Fisher Scientific( Ottawa, Ontario,Canada)A11650
Tris-HClSigma-Aldrich (St. Louis, MO)T3253

References

  1. Dwek, R. A. Glycobiology: more functions for oligosaccharides. Science. 269 (5228), 1234-1235 (1995).
  2. Scheiffele, P., Peränen, J., Simons, K. N-glycans as apical sorting signals in epithelial cells. Nature. 378 (6552), 96-98 (1995).
  3. Hofmann, J., Hahm, H. S., Seeberger, P. H., Pagel, K. Identification of carbohydrate anomers using ion mobility-mass spectrometry. Nature. 526 (7572), 241-244 (2015).
  4. Kowarik, M., et al. N-linked glycosylation of folded proteins by the bacterial oligosaccharyltransferase. Science. 314 (5802), 1148-1150 (2006).
  5. Young, N., et al. Structure of the N-linked glycan present on multiple glycoproteins in the Gram-negative bacterium, Campylobacter jejuni. Journal of Biological Chemistry. 277 (45), 42530-42539 (2002).
  6. Wacker, M., et al. N-linked glycosylation in Campylobacter jejuni and its functional transfer into E. coli. Science. 298 (5599), 1790-1793 (2002).
  7. Szymanski, C. M., Wren, B. W. Protein glycosylation in bacterial mucosal pathogens. Nature Review Microbiology. 3, 225-237 (2005).
  8. Linton, D., et al. Functional analysis of the Campylobacter jejuni N-linked protein glycosylation pathway. Molecular Microbiology. 55 (6), 1695-1703 (2005).
  9. Nwosu, C. C., et al. Simultaneous and Extensive Site-specific N- and O-Glycosylation Analysis in Protein Mixtures. Analytical Chemistry. 85, 956-963 (2013).
  10. Liu, X., et al. Mass spectrometry-based glycomics strategy for exploring N-linked glycosylation in eukaryotes and bacteria. Analytical Chemistry. 78 (17), 6081-6087 (2006).
  11. Nothaft, H., Liu, X., McNally, D. J., Li, J., Szymanski, C. M. Study of free oligosaccharides derived from the bacterial N-glycosylation pathway. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (35), 15019-15024 (2009).
  12. Macdonald, S. E., et al. Draft genome sequence of Campylobacter jejuni 11168H. Genome Announcements. 5 (5), e01556 (2017).
  13. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
  14. Liu, X., Chan, K., Chu, I. K., Li, J. Microwave-assisted nonspecific proteolytic digestion and controlled methylation for glycomics applications. Carbohydrate Research. 343 (17), 2870-2877 (2008).
  15. Liu, X., et al. 34;One-pot" methylation in glycomics application: Esterification of sialic acids and permanent charge construction. Analytical Chemistry. 79 (10), 3894-3900 (2007).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

N PNGase F E

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved