Strategia glicomica aspecifica basata sulla proteolisi per glicoproteine batteriche

Questo studio presenta un metodo per l'analisi glicomica delle glicoproteine mediante una combinazione di digestione della pronasi E, permetilazione e analisi di spettrometria di massa. Questo metodo è in grado di analizzare tutti i tipi di glicani N-legati, compresi gli N-glicani batterici.

La glicosilazione delle proteine è una delle modificazioni post-traduzionali più comuni e complesse. Molte tecniche sono state sviluppate per caratterizzare i ruoli specifici dei glicani, la relazione tra le loro strutture e il loro impatto sulle funzioni delle proteine. Un metodo comune per l'analisi dei glicani consiste nell'impiegare la scissione dell'esoglicosidasi per rilasciare glicani legati all'N da glicoproteine o glicopeptidi utilizzando il peptide-N-glicosidasi F (PNGasi F). Tuttavia, i legami glicano-proteina nei batteri sono diversi e non è disponibile alcun enzima per rilasciare glicani dalle glicoproteine batteriche. Inoltre, i glicani liberi sono stati descritti anche in cellule di mammiferi, batteri, lieviti, piante e pesci. In questo articolo, presentiamo un metodo in grado di caratterizzare il sistema di glicosilazione N-linked in Campylobacter jejuni rilevando glicani liberi e legati all'asparagina (Asn) che non sono attaccati alle loro proteine bersaglio. In questo metodo, le proteine totali di C. jejuni sono state digerite dalla pronasi E con un rapporto enzima/proteine più elevato (2:1-3:1) e un tempo di incubazione più lungo (48-72 ore). Gli Asn-glicani e i glicani liberi risultanti sono stati quindi purificati utilizzando cartucce di carbonio grafitico poroso, permetilati e analizzati mediante spettrometria di massa.

La N-glicosilazione delle proteine è una delle modificazioni post-traduzionali più comuni e complesse negli eucarioti¹. Gli N-glicani svolgono un ruolo essenziale nel ripiegamento delle proteine e hanno anche un impatto sulla selezione delle proteine nel traffico biosintetico². La spettrometria di massa è stata ampiamente utilizzata nell'analisi dei glicani rilasciati dalla scissione delle esoglicosidasi (glicomicsi). I restanti peptidi deglicosilati (glicoproteomica) sono stati comunemente usati per identificare le sequenze di peptidi glicosilati negli eucarioti³. L'identificazione di glicani legati all'N in Campylobacter jejuni ha suggerito che la N-glicosilazione non è limitata agli eucarioti 4,5,6,7,8. Tuttavia, per i batteri, vi è una mancanza di esoglicosidasi o endoglicosidasi efficaci per rilasciare oligosaccaridi per l'analisi dei glicani.

È stato sviluppato un approccio alternativo per caratterizzare i siti di glicosilazione e le strutture dei glicani nelle glicoproteine, che si basa sull'uso della proteolisi aspecifica per digerire la spina dorsale della maggior parte dei peptidi e generare pseudo-oligosaccaridi che contengono solo pochi amminoacidi. Vari enzimi non specifici sono stati utilizzati per generare pseudo-oligosaccaridi ed è stato riscontrato che la pronasi E offre la digestione più efficiente e riproducibile⁹. Abbiamo sviluppato una strategia di glicomica basata sulla Pronasi E per analizzare gli N-glicani^10,11 di C. jejuni. Gli pseudo-oligosaccaridi sono stati analizzati direttamente mediante spettrometria di massa per elettroforesi capillare (CE-MS) e/o mediante spettrometria di massa a tempo di volo con desorbimento/ionizzazione laser assistita da matrice (MALDI-TOF MS) dopo permetilazione.

Qui, viene descritto un metodo universale per l'analisi glicomica che utilizza la digestione e la permetilazione non specifica della pronasi E per studiare la glicosilazione dal patogeno della mucosa C. jejuni. Questo metodo è in grado di caratterizzare glicani legati all'azoto espressi sia dal sistema eucariotico che da quello batterico ed è anche utile nell'identificazione di nuovi intermedi nelle vie di glicosilazione legata all'azoto.

1. Coltura di C. jejuni 11168H ed estrazione delle proteine totali

NOTA: C. jejuni 11168H è un derivato clonale ipermobile di NCTC 11168¹².

1. Avviare la coltura cellulare reidratando il pellet cellulare (circa 0,15 g, NCTC) con circa 5 mL di terreno di coltura Mueller-Hinton. Utilizzare diverse gocce della provetta del brodo primario per inoculare una piastra di agar Mueller-Hinton. Incubare a 37 °C per 18 ore in atmosfera microaerofila, cioè 5% O₂, 10% CO₂ e 85% N₂.
2. Raccogli i prati batterici con 1 ml di brodo Brain Heart Infusion (BHI). Diluire il raccolto fino a raggiungere circa 1 x 10⁵ c.f.u./mL con brodo BHI. Coltivare le cellule per 18 ore con agitazione (100 giri/min) in atmosfera microaerofila a 37 °C.
3. Raffreddare le cellule mettendo le piastre sul ghiaccio per 10 minuti e raccogliere le cellule mediante centrifugazione (4.500 x g a 4 °C). Scartare il surnatante e lavare le cellule 2 volte in 3 L di Tris-HCl 0,1 M ghiacciato (pH 7,8).
4. Risospendere le cellule (10,^8-10,¹¹ cellule di C. jejuni) in 8 mL di Tris-HCl 0,1 M ghiacciato (pH 7,8) e lisarle mediante sonicazione (Tabella dei materiali). Eseguire la sonicazione come segue: impulso di 4 s, 1 s spento, 1 minuto ogni volta e tre volte in totale. 
5. Centrifugare a 9.500 x g per 45 minuti a 4 °C e trasferire il surnatante in un'altra provetta. Dializzare le proteine nel surnatante 2 volte contro 0,1 M di Tris-HCl (pH 7,5) a 4 °C per 3 ore.
6. Determinare le concentrazioni proteiche con un Protein Assay¹³ disponibile in commercio (dovrebbe essere compreso tra 4 e 6 μg/μL).
7. Sciogliere 1 mg di proteine in 1 mL di tampone Tris-HCl 0,1 M (pH 7,5) e aggiungere 2,5 mg di Pronasi E alla soluzione. Incubare a 37 °C per 48 ore, quindi far bollire la soluzione a 100 °C per 5 minuti per disattivare l'enzima.
8. Conservare la soluzione di digestato proteico a -80 °C per un ulteriore utilizzo.

2. Purificazione con carbonio grafitico poroso (PGC)

1. Attivare le cartucce PGC (100 mg, 5 mL) aggiungendo 1 mL di acetonitrile (ACN) all'80% (v/v) contenente lo 0,1% di acido trifluoacetico (TFA) e ripetere 2 volte.
2. Lavare la cartuccia PGC con 1 mL di acqua 3 volte.
3. Caricare la digestione della pronasi E da 1 mg di proteine su PGC (il volume dipende dalla concentrazione proteica).
4. Lavare la cartuccia 3 volte con 1 ml di acqua ogni volta per rimuovere i sali.
5. Eluire Asn-glicani con 1 mL di ACN al 25% in TFA allo 0,1%, seguito da 1 mL di ACN al 50% in TFA allo 0,1%.
6. Raggruppare entrambe le frazioni ed essiccare i campioni con il concentratore sottovuoto refrigerato (Tabella dei materiali) per un'ulteriore elaborazione.
   NOTA: Utilizzare solventi di grado MS per la purificazione dell'Asn-glicano.

3. Permetilazione di Asn-glicani

1. Solubilizzare gli Asn-glicani essiccati con 100 μL di dimetilsolfossido (DMSO) in una provetta da 1,5 mL.
2. Preparare l'impasto di DMSO-NaOH mescolando due pellet di NaOH con 2 mL di DMSO. Aggiungere al campione 200 μl di impasto di DMSO-NaOH e 100 μl di ioduro di metile.
3. Tappare bene la provetta e mescolare a 3.000 giri/min per 10 minuti a temperatura ambiente con un miscelatore a vortice.
4. Spegnere la permetilazione aggiungendo 1 mL di acqua.
5. Aggiungere 1 mL di cloroformio e agitare per 1 minuto per estrarre gli Asn-glicani permetilati.
6. Centrifugare a 9.000 x g per 3 min. Rimuovere il surnatante e mantenere la fase inferiore del cloroformio con Asn-glicani permetilati.
7. Lavare lo strato organico aggiungendo 1 mL di acqua con vortex per 1 min. Centrifugare a 9.000 x g per 3 minuti e rimuovere il surnatante. Ripeti 2 volte.
8. Porre la fase organica in una cappa aspirante e lasciarla asciugare con un getto di azoto a temperatura ambiente.
9. Conservare i glicani Asn permetilati a -80 °C per l'analisi spettrometrica di massa.

4. Spettrometria di massa a ionizzazione elettrospray (ESI-MS) e analisi ESI-MS/MS

1. Sciogliere gli Asn-glicani permetilati in 20 μL di 50% di 2-propanolo in acqua (v/v).
2. Eseguire l'analisi CE-ESI-MS utilizzando un capillare di 90 cm di silice fusa nuda con un flusso della guaina del 50% di 2-propanolo in acqua a 1 μL/min.
   NOTA: CE-MS è un sistema che combina l'elettroforesi capillare (CE) e la spettrometria di massa. CE separa gli ioni in base alla loro mobilità ionica. In questo protocollo, il sistema CE viene utilizzato per introdurre un volume minimo di campioni ed eseguire la desalinizzazione in linea.
3. Impostare la tensione ESI a 5 kV in modalità positiva.
4. Caricare i campioni di Asn-glicano permetilato a 500 mbar per 0,2 minuti, corrispondenti a circa 100 nL.
5. Acquisizione di dati MS utilizzando uno spettrometro di massa (Tabella dei materiali) utilizzando i seguenti parametri di acquisizione.
   1. Per MS completo, impostare il tempo di permanenza a 2,0 ms per passo di 0,1 m/z unità. Negli esperimenti MS² e MS³ con scansione ionica avanzata del prodotto (EPI), impostare la velocità di scansione a 4.000 Da/s, con intrappolamento Q0. Impostate il tempo di riempimento dell'abbondanza su Dinamico e la risoluzione di Q1 su Unità. Per gli esperimenti MS³ , impostare il coefficiente di eccitazione per assicurarsi che sia selezionato solo il picco monoisotopico per un singolo precursore carico. Impostare i tempi di eccitazione a 100 ms.

5. Analisi dei glicani permetilati mediante MALDI-TOF MS

1. Sciogliere gli Asn-glicani permetilati in 10 μl di metanolo/acqua al 50% (v/v).
2. Miscelare 1 μl di Asn-glicani disciolti con 2 μl di soluzione di acido 2,5-diidrossibenzoico [10 mg/mL in acetonitrile/acqua (v/v)] al 50%.
3. Aggiungere 1 μL di campione miscelato a una piastra MALDI a 384 pozzetti e attendere che il campione sia completamente asciutto.
4. Inserire la piastra nello spettrometro di massa MALDI-TOF dotato di un laser ad azoto pulsato (337 nm). Impostare la tensione di accelerazione a 20 kV in modalità positiva.
5. Imposta la potenza del laser su una scala arbitraria di 6.000 e acquisisci dati in modalità riflettore positivo da m/z 1.000 a 5.000.

Il metodo basato sulla combinazione di digestione e permetilazione della pronasi E è stato applicato all'analisi degli N-glicani da estratti proteici totali di C. jejuni 11168H. La Figura 1 mostra un diagramma di flusso della procedura sperimentale. Nella digestione tipica, il rapporto tra enzima e glicoproteina è stato impostato tra 1:100 e 1:20. Qui, il rapporto tra pronasi E e proteine è stato aumentato a 2:1-3:1 e una digestione più lunga è...

Ci sono due passaggi critici nel protocollo per l'attuazione di questa strategia di glicomica universale. Il primo passo critico è il completamento della digestione dei gas di scarico. Questo metodo dipende fortemente dal completamento della digestione della pronasi E. È quindi essenziale utilizzare un lungo tempo di digestione e un elevato rapporto enzimi/proteine. In genere, si suggerisce di utilizzare un rapporto di 2:1-3:1 per la pronasi E/proteina e un tempo di incubazione di 48 o...

Gli autori non hanno conflitti di interesse.

Gli autori ringraziano Kenneth Chan, David J. McNally, Harald Nothaft, Christine M. Szymanski, Jean-Robert Brisson ed Eleonora Altman per l'assistenza e le utili discussioni.