Stratégie glycomique non spécifique basée sur la protéolyse pour les glycoprotéines bactériennes

Cette étude présente une méthode d’analyse glycomique des glycoprotéines par une combinaison de digestion de la pronase E, de perméthylation et d’analyse par spectrométrie de masse. Cette méthode est capable d’analyser tous les types de glycanes liés à l’N, y compris les N-glycanes bactériens.

La glycosylation des protéines est l’une des modifications post-traductionnelles les plus courantes et les plus complexes. De nombreuses techniques ont été développées pour caractériser les rôles spécifiques des glycanes, la relation entre leurs structures et leur impact sur les fonctions des protéines. Une méthode courante d’analyse des glycanes consiste à utiliser le clivage de l’exoglycosidase pour libérer des glycanes liés à l’azote à partir de glycoprotéines ou de glycopeptides à l’aide de la peptide-N-glycosidase F (PNGase F). Cependant, les liaisons glycanes-protéines chez les bactéries sont différentes et il n’y a pas d’enzyme disponible pour libérer des glycanes à partir des glycoprotéines bactériennes. De plus, des glycanes libres ont également été décrits dans des cellules de mammifères, des bactéries, des levures, des plantes et des poissons. Dans cet article, nous présentons une méthode qui permet de caractériser le système de glycosylation lié à l’azote chez Campylobacter jejuni en détectant les glycanes liés à l’asparagine (Asn) et les glycanes libres qui ne sont pas attachés à leurs protéines cibles. Dans cette méthode, les protéines totales de C. jejuni ont été digérées par la pronase E avec un rapport enzyme/protéine plus élevé (2:1−3:1) et un temps d’incubation plus long (48−72 h). Les asn-glycanes et les glycanes libres résultants ont ensuite été purifiés à l’aide de cartouches de carbone graphitique poreux, perméthylés, et analysés par spectrométrie de masse.

La glycosylation des protéines N-glycosylation est l’une des modifications post-traductionnelles les plus courantes et les plus complexes chez les eucaryotes¹. Les N-glycanes jouent un rôle essentiel dans le repliement des protéines et ont également un impact sur le tri des protéines dans le trafic biosynthétique². La spectrométrie de masse a été largement utilisée dans l’analyse des glycanes libérés par le clivage de l’exoglycosidase (glycomique). Les peptides déglycosylés restants (glycoprotéomique) ont été couramment utilisés pour identifier les séquences de peptides glycosylés chez les eucaryotes³. L’identification de glycanes liés à l’azote chez Campylobacter jejuni suggère que la N-glycosylation n’est pas limitée aux eucaryotes 4,5,6,7,8. Cependant, pour les bactéries, il y a un manque d’exoglycosidases ou d’endoglycosidases efficaces pour libérer des oligosaccharides pour l’analyse des glycanes.

Une approche alternative a été développée pour caractériser les sites de glycosylation et les structures glycanes dans les glycoprotéines, qui est basée sur l’utilisation de la protéolyse non spécifique pour digérer le squelette de la plupart des peptides et générer des pseudo-oligosaccharides qui ne contiennent que quelques acides aminés. Diverses enzymes non spécifiques ont été utilisées pour générer des pseudo-oligosaccharides et il a été constaté que la pronase E offrait la digestion la plus efficace et la plus reproductible⁹. Nous avons développé une stratégie glycomique basée sur la Pronase E pour analyser les N-glycanes^10,11 de C. jejuni. Les pseudo-oligosaccharides ont été analysés directement par spectrométrie de masse par électrophorèse capillaire (CE-MS) et/ou par spectrométrie de masse à temps de vol par désorption/ionisation laser assistée par matrice (MALDI-TOF MS) après perméthylation.

Ici, une méthode universelle est décrite pour l’analyse glycomique qui utilise la digestion et la perméthylation non spécifiques de la Pronase E pour étudier la glycosylation de l’agent pathogène de la muqueuse C. jejuni. Cette méthode est capable de caractériser les glycanes liés à l’azote exprimés à la fois par les systèmes eucaryotes et bactériens et est également utile pour identifier de nouveaux intermédiaires dans les voies de glycosylation liées à l’azote.

1. Culture de C. jejuni 11168H et extraction des protéines totales

REMARQUE : C. jejuni 11168H est un dérivé clonal hypermotile de NCTC 11168¹².

1. Commencer la culture cellulaire en réhydratant la pastille cellulaire (environ 0,15 g, NCTC) avec environ 5 mL de milieu de culture Mueller-Hinton. Utilisez plusieurs gouttes du tube de bouillon primaire pour inoculer une plaque de gélose Mueller-Hinton. Incuber à 37 °C pendant 18 h sous une atmosphère microaérophile, soit 5 % O₂, 10 % CO₂ et 85 % N₂.
2. Récoltez les pelouses bactériennes avec 1 mL de bouillon d’infusion Cerveau-Cœur (BHI). Diluer la récolte pour atteindre environ 1 x 10⁵ f.f.u./mL avec du bouillon BHI. Cultiver des cellules pendant 18 h avec agitation (100 tr/min) dans une atmosphère microaérophile à 37 °C.
3. Refroidissez les cellules en les posant sur de la glace pendant 10 min et récoltez les cellules par centrifugation (4 500 x g à 4 °C). Jetez le surnageant et lavez les cellules 2x dans 3 L de Tris-HCl 0,1 M glacé (pH 7,8).
4. Remettre en suspension des cellules (10, 8-10,¹¹cellules C. jejuni) dans 8 mL de Tris-HCl 0,1 M glacé (pH 7,8) et lyser par sonication (Table des matériaux). Effectuez la sonication comme suit : 4 s d’impulsion, 1 s d’arrêt, 1 min à chaque fois et trois fois au total. 
5. Centrifuger à 9 500 x g pendant 45 min à 4 °C et transférer le surnageant dans un autre tube. Dialyser les protéines du surnageant 2x contre 0,1 M Tris-HCl (pH 7,5) à 4 °C pendant 3 h.
6. Déterminer les concentrations en protéines à l’aide d’un dosage protéique¹³ disponible dans le commerce (doit se situer dans une plage de 4 à 6 μg/μL).
7. Dissoudre 1 mg de protéines dans 1 mL de tampon Tris-HCl 0,1 M (pH 7,5) et ajouter 2,5 mg de Pronase E à la solution. Incuber à 37 °C pendant 48 h, puis faire bouillir la solution à 100 °C pendant 5 min pour désactiver l’enzyme.
8. Conservez la solution de digestion des protéines à -80 °C pour une utilisation ultérieure.

2. Purification à l’aide de carbone graphitique poreux (PGC)

1. Activez les cartouches PGC (100 mg, 5 mL) en ajoutant 1 mL d’acétonitrile à 80 % (v/v) contenant 0,1 % d’acide trifluoacétique (TFA) et répétez l’opération 2 fois.
2. Lavez la cartouche PGC avec 1 mL d’eau 3 fois.
3. Chargez la digestion de la pronase E à partir de 1 mg de protéines sur PGC (le volume dépend de la concentration en protéines).
4. Lavez la cartouche 3 fois avec 1 ml d’eau à chaque fois pour éliminer les sels.
5. Éluer les Asn-glycanes avec 1 mL d’ACN à 25 % dans l’AGT à 0,1 %, suivi de 1 mL d’ACN à 50 % dans l’AGA à 0,1 %.
6. Mettez en commun les deux fractions et séchez les échantillons avec le concentrateur sous vide réfrigéré (Table des matériaux) pour un traitement ultérieur.
   REMARQUE : Utilisez des solvants de qualité MS pour la purification de l’Asn-glycane.

3. Perméthylation des Asn-glycanes

1. Solubiliser des Asn-glycanes séchés avec 100 μL de diméthylsulfoxyde (DMSO) dans un tube de 1,5 mL.
2. Préparez la suspension de DMSO-NaOH en mélangeant deux pastilles de NaOH avec 2 mL de DMSO. Ajouter à l’échantillon 200 μL de suspension de DMSO-NaOH et 100 μL d’iodure de méthyle.
3. Fermez hermétiquement le tube et remuez à 3 000 tr/min pendant 10 min à température ambiante avec un mélangeur vortex.
4. Éteignez la perméthylation en ajoutant 1 mL d’eau.
5. Ajouter 1 mL de chloroforme et agiter pendant 1 min pour extraire les Asn-glycanes perméthylés.
6. Centrifugeuse à 9 000 x g pendant 3 min. Éliminer le surnageant et conserver la phase chloroforme inférieure avec des Asn-glycanes perméthylés.
7. Laver la couche organique en ajoutant 1 mL d’eau avec vortex pendant 1 min. Centrifuger à 9 000 x g pendant 3 min et retirer le surnageant. Répétez l’opération 2 fois.
8. Placez la phase organique dans une hotte et laissez-la sécher avec un jet d’azote à température ambiante.
9. Conservez les Asn-glycanes perméthylés à -80 °C pour l’analyse par spectrométrie de masse.

4. Spectrométrie de masse à ionisation électronébulaire (ESI-MS) et analyse ESI-MS/MS

1. Dissoudre des Asn-glycanes perméthylés dans 20 μL de 2-propanol à 50 % dans de l’eau (v/v).
2. Effectuer l’analyse CE-ESI-MS à l’aide d’un capillaire en silice fondue nue de 90 cm avec un débit de gaine de 50 % de 2-propanol dans de l’eau à 1 μL/min.
   REMARQUE : Le CE-MS est un système qui combine l’électrophorèse capillaire (EC) et une spectrométrie de masse. CE sépare les ions en fonction de leur mobilité ionique. Dans ce protocole, le système CE est utilisé pour introduire un volume infime d’échantillons et effectuer le dessalage en ligne.
3. Réglez la tension ESI à 5 kV en mode positif.
4. Chargez des échantillons d’Asn-glycane perméthylés à 500 mbar pendant 0,2 min, ce qui correspond à environ 100 nL.
5. Acquérir des données MS à l’aide d’un spectromètre de masse (Table des matériaux) en utilisant les paramètres d’acquisition suivants.
   1. Pour une MS complète, réglez le temps de séjour à 2,0 ms par pas de 0,1 m/z unité. Dans les expériences MS² et MS³ avec balayage ionique produit amélioré (EPI), réglez la vitesse de balayage sur 4 000 Da/s, avec piégeage Q0. Définissez le temps de remplissage du recouvrement sur Dynamique et la résolution de Q1 sur Unité. Pour les expériences MS³ , réglez le coefficient d’excitation pour vous assurer que seul le pic monoisotopique d’un seul précurseur chargé est sélectionné. Réglez les temps d’excitation à 100 ms.

5. Analyse des glycanes perméthylés par MALDI-TOF MS

1. Dissoudre les Asn-glycanes perméthylés dans 10 μL de méthanol/eau à 50 % (v/v).
2. Mélanger 1 μL d’Asn-glycanes dissous avec 2 μL de solution d’acide 2,5-dihydroxybenzoïque (10 mg/mL dans 50 % d’acétonitrile/eau (v/v)).
3. Ajouter 1 μL d’échantillon mélangé dans une plaque MALDI à 384 puits et attendre que l’échantillon soit complètement sec.
4. Insérer la plaque dans le spectromètre de masse MALDI-TOF équipé d’un laser à azote pulsé (337 nm). Réglez la tension d’accélération à 20 kV en mode positif.
5. Réglez la puissance laser sur une échelle arbitraire de 6 000 et acquérez des données en mode réflectron positif de m/z 1 000 à 5 000.

La méthode basée sur la combinaison de la digestion de la pronase E et de la perméthylation a été appliquée à l’analyse des N-glycanes à partir d’extraits de protéines totales de C. jejuni 11168H. La figure 1 montre un organigramme de la procédure expérimentale. Dans la digestion typique, le rapport enzyme/glycoprotéine était fixé entre 1:100 et 1:20. Ici, le rapport entre la pronase E et les protéines a été augmenté à 2:1-3:1...

Le protocole de mise en œuvre de cette stratégie glycomique universelle comporte deux étapes critiques. La première étape critique est l’achèvement de la digestion des gaz d’échappement. Cette méthode dépend fortement de l’achèvement de la digestion de la Pronase E. Il est donc essentiel d’utiliser un temps de digestion long et un rapport enzyme/protéines élevé. En règle générale, il est suggéré d’utiliser un rapport de 2:1-3:1 pour la pronase E/protéine, et ...

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts.

Les auteurs remercient Kenneth Chan, David J. McNally, Harald Nothaft, Christine M. Szymanski, Jean-Robert Brisson et Eleonora Altman pour leur aide et leurs discussions utiles.