Построение гомозиготных мутантов мигрирующей саранчи с использованием технологии CRISPR/Cas9

В этом исследовании представлена систематически оптимизированная процедура построения гомозиготных мутантов саранчи на основе рибонуклеазы CRISPR/Cas9, а также подробный метод криоконсервации и реанимации яиц саранчи.

Мигрирующая саранча, Locusta migratoria, является не только одной из мировых чумных саранч, которая нанесла огромные экономические потери людям, но и важной исследовательской моделью метаморфоза насекомых. Система CRISPR/Cas9 может точно определять местоположение в определенном локусе ДНК и расщеплять в пределах целевого участка, эффективно вводя двухцепочечные разрывы, чтобы индуцировать нокаут гена-мишени или интегрировать новые фрагменты генов в конкретный локус. Редактирование генома, опосредованное CRISPR/Cas9, является мощным инструментом для решения вопросов, возникающих в исследованиях саранчи, а также многообещающей технологией борьбы с саранчой. В этом исследовании представлен систематический протокол нокаута генов, опосредованного CRISPR/Cas9, с комплексом белка Cas9 и одиночных направляющих РНК (сгРНК) у мигрирующей саранчи. Подробно описан выбор сайтов-мишеней и дизайн сгРНК с последующим синтезом in vitro и верификацией сгРНК. Последующие процедуры включают сбор яйцеклеток и разделение дубленых яиц для достижения успешной микроинъекции с низким уровнем смертности, культивирование яиц, предварительную оценку частоты мутаций, размножение саранчи, а также обнаружение, сохранение и прохождение мутантов для обеспечения стабильности популяции отредактированной саранчи. Этот метод может быть использован в качестве эталона для приложений редактирования генов на основе CRISPR/Cas9 у мигрирующей саранчи, а также у других насекомых.

Технологии редактирования генов могут быть использованы для введения вставок или делеций в определенный локус генома для искусственной модификации гена-мишени с целью¹. В последние годы технология CRISPR/Cas9 быстро развивалась и имеет растущую сферу применения в различных областях наук о жизни 2,3,4,5,6. Система CRISPR/Cas9 была открыта еще в 1987 7 году и широко распространена у бактерий и архей. Дальнейшие исследования показали, что это была прокариотическая адаптивная иммунная система, которая зависит от нуклеазы Cas9, управляемой РНК, для борьбы с фагами⁸. Искусственно модифицированная система CRISPR/Cas9 в основном состоит из двух компонентов: одной направляющей РНК (сгРНК) и белка Cas9. СгРНК состоит из CRISPR РНК (крРНК), комплементарной целевой последовательности, и вспомогательной трансактивирующей крРНК (тракрРНК), которая относительно консервативна. Когда активируется система CRISPR/Cas9, сгРНК образует рибонуклеопротеин (РНП) с белком Cas9 и направляет Cas9 к целевому участку посредством спаривания оснований РНК-ДНК-взаимодействий. Затем двухцепочечная ДНК может быть расщеплена белком Cas9, и в результате двухцепочечный разрыв (DSB) возникает рядом с соседним мотивом протоспейсера (PAM) целевого сайта 9,10,11,12. Чтобы смягчить ущерб, вызванный DSB, клетки активируют комплексные реакции на повреждение ДНК, чтобы эффективно обнаруживать повреждения генома и инициировать процедуру репарации. В клетке существует два различных механизма репарации: негомологичное соединение концов (NHEJ) и гомологически направленная репарация (HDR). NHEJ является наиболее распространенным путем репарации, который может быстро восстанавливать двухцепочечные разрывы ДНК и предотвращает апоптоз клеток. Тем не менее, он подвержен ошибкам из-за того, что оставляет небольшие фрагменты вставок и делеций (инделов) рядом с DSB, что обычно приводит к сдвигу открытой рамки считывания и, таким образом, может привести к нокауту гена. Напротив, гомологичное восстановление является довольно редким событием. При условии, что существует шаблон репарации с последовательностями, гомологичными контексту DSB, клетки иногда восстанавливают геномный разрыв в соответствии с соседним шаблоном. Результатом HDR является то, что DSB точно ремонтируется. В частности, если между гомологичными последовательностями в матрице есть дополнительная последовательность, они будут интегрированы в геном через HDR, и, таким образом, могут быть реализованы специфические вставки генов¹³.

С оптимизацией и развитием структур sgRNA и вариантов белка Cas9 система генетического редактирования на основе CRISPR/Cas9 также успешно применяется в исследованиях насекомых, включая, помимо прочего, Drosophila melanogaster, Aedes aegypti, Bombyx mori, Helicoverpa Armigera, Plutella xylostella и Locusta migratoria 14,15,16,17,18 ^,19. Насколько известно авторам, хотя РНП, состоящие из белка Cas9 и транскрибируемой sgRNA in vitro, использовались для редактирования генома саранчи^20,21,22, систематический и подробный протокол для опосредованного рибонуклеазой CRISPR/Cas9 строительства гомозиготных мутантов мигрирующей саранчи все еще отсутствует.

Мигрирующая саранча является важным сельскохозяйственным вредителем, который имеет глобальное распространение и представляет существенную угрозу для производства продуктов питания, будучи особенно вредным для злаковых растений, таких как пшеница, кукуруза, рис и просо²³. Анализ функций генов, основанный на технологиях редактирования генома, может обеспечить новые цели и новые стратегии борьбы с мигрирующей саранчой. В этом исследовании предлагается подробный метод нокаутирования мигрирующих генов саранчи с помощью системы CRISPR/Cas9, включая выбор целевых участков и дизайн сгРНК, синтез in vitro и верификацию сгРНК, микроинъекцию и культурирование яйцеклеток, оценку частоты мутаций на эмбриональной стадии, обнаружение мутантов, а также прохождение и сохранение мутантов. Этот протокол может быть использован в качестве базального эталона для манипулирования подавляющим большинством генов саранчи и может предоставить ценные ссылки для редактирования генома других насекомых.

1. Выбор целевого сайта и дизайн sgRNA

1. Соберите как можно больше информации о последовательности интересующего гена с помощью литературных исследований и/или поиска мРНК или кодирующей последовательности ДНК (CDS) гена в NCBI и базе данных саранчи²⁴.
2. Сравните последовательность интересующего гена с его геномной последовательностью ДНК, чтобы различить экзонную и интронную области.
3. Выберите регион-кандидат для разработки целевого сайта в зависимости от цели исследования. Разработайте пары праймеров для амплификации фрагмента области-кандидата и проверки его последовательности дикого типа путем анализа секвенирования продукта ПЦР.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Существуют различные стратегии выбора целевого региона-кандидата. Например, в большинстве исследований функции гена/белка используйте фрагмент экзона, близкий к его начальному кодону, в качестве области-кандидата, чтобы гарантировать, что вся функция белка/РНК будет потеряна после редактирования генома (т.е. нокаута гена). В то время как для анализа функций определенного домена выберите область-кандидат в начале (или обоих концах) домена.
4. Используйте онлайн-ресурсы, такие как E-CRISP^{Design 25} , для поиска потенциальных целевых сайтов в целевом регионе-кандидате.
   1. Выберите «Drosophila melanogaster BDGP6» (или любое другое насекомое) в выпадающем списке эталонных геномов и выберите «Входными данными является последовательность FASTA», а затем вставьте последовательность целевой области в текстовое поле (в формате FASTA).
   2. Запустите приложение, нажав «Начать поиск sgRNA» со «средним» и «единым дизайном», чтобы получить возможные целевые сайты. Выберите 1-3 потенциальные мишени из результатов на основе их прогнозируемых оценок и соответствующим образом разработайте соответствующие сгРНК.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Существует множество других онлайн-платформ для разработки CRISPR, таких как CRISPOR, CHOPCHOP, CRISPRdirect, ZiFiT и так далее (см. Таблицу материалов). Некоторые из них имеют функцию проверки специфичности видов, данные геномных последовательностей которых находятся в их базах данных. Однако геномная последовательность саранчи не была найдена ни на одном онлайн-сайте. Лучше использовать более одного онлайн-инструмента для CRISPR-дизайна у саранчи. Всесторонне рассмотрите результаты с разных веб-сайтов и выберите sgRNA из результатов по принципу наибольшей специфичности, наибольшей эффективности и наименьшей частоты несоответствия (рис. 1A, B).

2. Синтез и верификация сгРНК in vitro

1. Синтезируйте сгРНК с помощью наборов для синтеза сгРНК в соответствии с руководством производителя (Таблица материалов). Эта процедура обычно включает три этапа: амплификацию матрицы ДНК, транскрипцию in vitro и очистку sgRNA²¹. Разбавьте синтезированную сгРНК водой, не содержащей нуклеаз, до концентрации хранения 300 нг/мкл для дальнейшего использования.
2. Амплифицировать и очищать фрагмент гена-мишени, чтобы он служил субстратом для анализа расщепления in vitro системы CRISPR/Cas9. Выполните эти действия, следуя инструкциям производителя.
3. Разбавьте купленный белок Cas9 до 300 нг/мкл безнуклеазной водой. Инкубируют 1 мкл сгРНК (300 нг/мкл) и 1 мкл белка Cas9 (300 нг/мкл) с 200 нг очищенного фрагмента-мишени в буфере для расщепления при 37 °C в течение 1 ч (10 мкл общего объема; см. Таблицу 1). Оцените эффективность индуцированного сгРНК расщепления Cas9 методом электрофореза в агарозном геле (рис. 1C). Выберите сгРНК с высокой активностью для следующей микроинъекции.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Результаты электрофореза в агарозном геле могут быть преобразованы в изображения в оттенках серого с помощью программного обеспечения для обработки изображений, а эффективность спайности оценивается в соответствии с оттенками серого полос предполагаемых размеров.

3. Микроинъекция и культивирование яйцеклеток

1. Подготовьте инъекционные иглы, вытягивая стеклянные капилляры с помощью съемника микропипеток (Таблица материалов). Установите параметры следующим образом: Нагрев на 588, Тяга на 90, Скорость на 60 и Время на 40. Отшлифуйте кончик инъекционной иглы с помощью микрошлифовальной машины (Таблица материалов).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Идеальные кончики игл должны быть открытыми и с острыми краями (рис. 2A). Настоятельно рекомендуется подготовить дополнительные иглы для экспериментов, потому что иглы иногда блокируются или случайно ломаются во время инъекций.
2. Смешайте 1 мкл белка Cas9 (300 нг/мкл) с 1 мкл проверенной сгРНК (300 нг/мкл) вместе, чтобы получить RNP для инъекции. Добавьте 8 мкл стерильной воды без РНКазы, чтобы конечный объем смеси составил 10 мкл. Тщательно перемешайте раствор и держите его на льду.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Конечные концентрации белка Cas9 и сгРНК могут быть оптимизированы в соответствии с результатами редактирования. Избегайте повторного замораживания и оттаивания приготовленного раствора RNP и рекомендуется немедленное использование.
3. Выращивайте самцов и самок взрослой саранчи вместе при температуре 30 ° C с фотопериодом 16 (светлый):8 (темный) и поставьте им достаточное количество свежих проростков пшеницы в качестве пищи. Ежедневно наблюдайте за этой саранчой и поставьте горшок для яйцекладки (пластиковый цветочный горшок или чашку, наполненную влажным стерильным песком) в клетку для выращивания для яйцекладки после спаривания саранчи.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно 100 пар взрослой саранчи, выращенных в клетке для выращивания (40 см х 40 см х 40 см), достаточно для получения яиц для выбивания одного гена. Культивируйте дополнительные пары саранчи, если требуется больше яиц.
4. Соберите свежеотложенные яичные стручки из горшка для яйцекладки и подождите около 30 минут, пока яйца не подгорят. Аккуратно изолируйте яйца от стручков в воде с помощью тонкой щетки и трижды промойте их стерильной водой. Храните яйца в чашке Петри и добавьте стерильную воду, чтобы они оставались влажными.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Дубление недавно отложенных яиц может значительно повысить эффективность мутантов²¹.
5. Наполните инъекционную иглу приготовленным раствором РНП и загрузите его в микроманипулятор (Таблица материалов).
   1. Установите параметры микровпрыска следующим образом: 300 гПа давления впрыска (pi), 0,5 с времени впрыска (ti) и 25 гПа компенсационного давления (pc).
   2. Нажмите на педаль, чтобы оценить объем вводимого раствора. Отрегулируйте давление впрыска и время впрыска, чтобы объем впрыска составлял около 50-100 нл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выпустите остаточный воздух из иглы, чтобы сделать раствор для инъекций непрерывным и максимально контролируемым. Соединение иглы и микроманипулятора должно быть плотным.
6. Регулярно размещайте стерильные яйца на инъекционной подушечке (рис. 2B, C) и поместите прокладку на предметный стол микроскопа (рис. 3A). Регулируйте увеличение микроскопа до тех пор, пока яйца не будут наблюдаться. Отрегулируйте иглу для микроинъекций под микроскопом до тех пор, пока не станет виден наконечник инъекции, и расположите его рядом с вводимой яйцеклеткой.
7. Начинайте инъекцию на подходящей высоте и под углом 30-45 градусов. Осторожно вставьте наконечник в яйцо рядом с микропилами яйца (рис. 3B) и нажмите педаль, чтобы выполнить инъекцию. Быстро втяните иглу и переместите инъекционную подушечку для инъекции следующего яйца.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Следует наблюдать небольшое расширение яйцеклетки во время микроинъекции. Допустима небольшая цитоплазматическая утечка в точечном отверстии. Замените инъекционную иглу на новую или отрегулируйте угол впрыска, если отток жидкости слишком велик.
8. Перенесите введенные яйца в культуральную чашку (чашку Петри с куском влажной фильтровальной бумаги) и поместите их в инкубатор при температуре 30 ° C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Потребуется около 13-14 дней, прежде чем нимфы вылупятся из этих инъецированных яиц (при условии, что мутация гена-мишени не влияет на развитие эмбрионов) (рис. 3C). Введите не менее 100 яиц, чтобы обеспечить достаточное количество вылупления и экклозии для выбивания определенного гена.

4. Оценка частоты мутаций и скрининг мутантов

1. Проверяйте развитие введенных яйцеклеток каждый день после инъекции. Переносите введенные яйца в новую культуральную чашку каждые 24 часа в течение первых 5 дней.
2. На^6-й день (или позже) после инъекции случайным образом соберите и перенесите 10 яиц в пробирку и адекватно измельчите яйца двумя стальными шариками с частотой 60 Гц в течение 6 мин с помощью кофемолки (см. Таблицу материалов). Ресуспендируйте обломки с 1 мл PBS. Переведите 5 мкл смеси в 45 мкл 50 мМ NaOH и лизируйте при 95 °C в течение 5 мин. Добавьте 5 мкл 1 М трис-HCl (рН = 8,0) в систему лизиса, чтобы прекратить щелочную реакцию лизиса.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Яйца могут быть отобраны для щелочного лизиса в любой день после последнего переноса, и несколько яйцеклеток могут быть использованы в качестве одного образца в зависимости от их ситуации развития (например, пять 6-дневных эмбрионов могут быть использованы в качестве одного образца, а два 10-дневных эмбриона могут быть использованы в качестве одного образца). Иногда невозможно получить геномную ДНК яйцеклеток с помощью метода щелочного лизиса. Коммерческие наборы для выделения геномной ДНК могут быть использованы в качестве альтернативного метода выделения геномной ДНК из яйцеклеток.
3. Возьмите 1 мкл продукта лизиса в качестве шаблона ПЦР для амплификации фрагмента гена-мишени (Таблица 2 и Таблица 3) и отправьте продукты ПЦР на секвенирование. Сравните результаты секвенирования с последовательностью дикого типа, чтобы предварительно оценить, расщепляет ли система CRISPR/Cas9 ген-мишень in vivo (рис. 4A). Допускают остальные яйцеклетки для последующего развития при условии, что инделы будут обнаружены на эмбриональной стадии.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Таким образом, скорость мутации может быть предварительно оценена на стадии эмбриона. Если на этом этапе не обнаружено никаких инделов, подготовьте несколько новых сгРНК для гена-мишени и повторите протокол нокаута, начиная с шага 2.1.
4. Перенесите вылупившихся нимф в клетку для выращивания и культивируйте их, как описано в шаге 3.3. Когда нимфы разовьются до пятой возрастной стадии, разделите их пластиковыми культуральными стаканчиками (1 нимфа / чашка).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно нимфам требуется около 25-35 дней, чтобы развиться до пятого возраста, и наиболее очевидным фенотипом является то, что зачатки крыльев простираются до четвертого или пятого сегментов брюшка. Кроме того, рекомендуется записывать фенотипы погибших нимф для прогнозирования взаимосвязи между геном-мишенью и фенотипами в дальнейших исследованиях.
5. Отрежьте ножницами рассекающие усики длиной около 2 мм и лизируйте их методом щелочного лизиса (шаг 4.2). Проанализируйте последовательность фрагментов генов-мишеней этих нимф, как описано выше (шаг 4.3), чтобы идентифицировать мутанты G₀ (рис. 4B).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Усики, вырезанные для лизиса, могут быть немного длиннее, и измельчение или измельчение усиков полезно для лизиса, хотя усики могут быть непосредственно переварены. Особи с несколькими пиками вблизи целевого участка в результате секвенирования идентифицируются как положительные мутанты и допускаются к последующему развитию и спариванию.

5. Создание и прохождение мутантных линий

1. Проведите скрещивание с использованием мутантов G₀ и дикой саранчи (рис. 4B). Соберите ооцисты и инкубируйте эти ооцисты отдельно при 30 ° C. Используйте 3-6 развитых яйцеклеток в каждой ооцисте для обнаружения мутаций, как описано в шагах 4.2 и 4.3. Сохраняйте мутационно-положительные ооцисты для последующего развития и откажитесь от мутационно-отрицательных ооцист.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Оценка частоты мутаций на эмбриональной стадии может значительно ускорить скрининг мутантов G₁ . Обычно 3-6 развившихся яйцеклеток можно смешать в один образец для ПЦР-опосредованного генотипирования, как описано выше.
2. Поднимите нимфы G₁ , как описано в шаге 4.4. Отрежьте около 2 мм длины усиков для выполнения генотипирования на основе ПЦР, как описано на шаге 4.5 для обнаружения гетерозигот G₁ . Выполняйте TA-клонирование в соответствии с инструкциями производителя (см. Таблицу материалов) для выявления их мутаций. Выполните скрещивание с использованием гетерозигот G₁ с одинаковыми мутациями для получения нимф G₂ .
   ПРИМЕЧАНИЕ: Секвенирование продуктов ПЦР по Сэнгеру может предоставить информацию только для обнаружения гетерозигот, но недостаточно информации для идентификации точных мутаций. Таким образом, клонирование ТА с использованием продуктов ПЦР необходимо для четкой идентификации мутаций и может способствовать созданию стабильных мутантных линий.
3. Поднимите нимф G₂ до их пятого возраста. Используйте генотипирование на основе ПЦР, описанное на шаге 5.2, для идентификации гомозигот и/или гетерозигот, которые подходят для дальнейших исследований и стабильного пассажа (рис. 4B).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Обратите внимание, чтобы избежать смешивания гомозигот и гетерозигот. Рекомендуется проводить генотипирование на основе ПЦР в каждом поколении для подтверждения гомозиготности и/или гетерозиготности каждой популяции. Количество саранчи, используемой для этой проверки, зависит от численности популяции. Кроме того, популяция саранчи может быть расширена с помощью стратегии in-cross.

6. Криоконсервация и реанимация яйцеклеток

1. Яйца, подлежащие криоконсервированию, вымойте стерильной водой и инкубируйте их в посуде для культивирования, как описано выше (шаг 3.8), в течение 5-6 дней. Соберите эти яйца вместе в посуду для культуры и накройте их фрагментами фильтровальной бумаги. Оберните всю культуральную посуду парафиновой пленкой.
2. Храните блюдо при температуре 25 ° C в течение 2 дней, а затем еще 2 дня при относительно более низкой температуре (13-16 ° C). Затем переложите блюдо в холодильник с температурой 6 °C. Добавляйте в него воду каждые 2 недели, чтобы обеспечить влажную среду для яиц (рис. 5А).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Предполагается, что эмбрионы находятся на стадии кататрепсиса после развития в течение 5-6 дней при 30 ° C²⁶. Градиентное охлаждение полезно для криоконсервации яиц (табл. 5).
3. Для реанимации криоконсервированных яиц достаньте чашку Петри из холодильника и выдержите ее при температуре 25 °C в течение 2 дней. Поместите эти яйца в инкубатор с температурой 30 °C до тех пор, пока нимфы не вылупятся (рис. 5B).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Перед переносом в инкубатор с температурой 30 °C необходимо поместить криоконсервированные яйца при температуре 25 °C. Эмбрионы могут быть криоконсервированы в течение как минимум пяти месяцев, хотя скорость вылупления и скорость экклозии могут снижаться из-за криоконсервации (таблица 5).

Этот протокол содержит подробные этапы получения гомозиготных мутантов мигрирующей саранчи с РНП, состоящим из белка Cas9 и синтезированной in vitro сгРНК. Ниже приведены некоторые репрезентативные результаты нокаута гена-мишени, опосредованного CRISPR/Cas9, у саранчи, включая отбор мишен?...

Саранча была одним из самых разрушительных вредителей для сельского хозяйства со времен цивилизации людей²³. Технология редактирования генома на основе CRISPR/Cas9 является мощным инструментом для обеспечения лучшего знания биологических механизмов саранчи, а также многообе?...

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (32070502, 31601697, 32072419 и Китайским фондом постдокторантуры (2020M672205).