Construção de mutantes homozigotos de gafanhotos migratórios utilizando tecnologia CRISPR/Cas9

Este estudo fornece um procedimento sistematicamente otimizado de construção de mutantes homozigotos de gafanhotos baseado em ribonuclease CRISPR/Cas9, bem como um método detalhado para criopreservação e ressuscitação dos ovos de gafanhotos.

O gafanhoto migratório, Locusta migratoria, não é apenas um dos gafanhotos da peste mundial que causaram enormes perdas econômicas aos seres humanos, mas também um importante modelo de pesquisa para a metamorfose de insetos. O sistema CRISPR/Cas9 pode localizar com precisão em um locus de DNA específico e clivar dentro do local alvo, introduzindo eficientemente quebras de fita dupla para induzir knockout do gene alvo ou integrar novos fragmentos gênicos no locus específico. A edição do genoma mediada por CRISPR/Cas9 é uma ferramenta poderosa para abordar questões encontradas na pesquisa de gafanhotos, bem como uma tecnologia promissora para o controle de gafanhotos. Este estudo fornece um protocolo sistemático para knockout gênico mediado por CRISPR/Cas9 com o complexo da proteína Cas9 e RNAs guia único (sgRNAs) em gafanhotos migratórios. A seleção dos sítios alvo e o planejamento do sgRNA são descritos em detalhes, seguidos pela síntese in vitro e verificação dos sgRNAs. Os procedimentos subsequentes incluem coleta de jangada de ovos e separação de ovos curtidos para alcançar microinjeção bem-sucedida com baixa taxa de mortalidade, cultura de ovos, estimativa preliminar da taxa de mutação, criação de gafanhotos, bem como detecção, preservação e passagem dos mutantes para garantir a estabilidade populacional dos gafanhotos editados. Este método pode ser usado como referência para aplicações de edição genética baseadas em CRISPR/Cas9 em gafanhotos migratórios, bem como em outros insetos.

Tecnologias de edição de genes poderiam ser usadas para introduzir inserções ou deleções em um locus específico do genoma para modificar artificialmente o gene alvo na finalidade¹. Nos últimos anos, a tecnologia CRISPR/Cas9 desenvolveu-se rapidamente e tem um escopo crescente de aplicações em vários campos das ciências da vida 2,3,4,5,6. O sistema CRISPR/Cas9 foi descoberto em 1987⁷, e amplamente encontrado em bactérias e arqueias. Pesquisas posteriores indicaram que se tratava de um sistema imune adaptativo procariótico que depende da nuclease Cas9 guiada por RNA para lutar contra fagos⁸. O sistema CRISPR/Cas9 modificado artificialmente consiste principalmente de dois componentes, um RNA guia único (sgRNA) e a proteína Cas9. O sgRNA é composto por um RNA CRISPR (crRNA) complementar à sequência alvo e um crRNA auxiliar transativador (tracrRNA), que é relativamente conservado. Quando o sistema CRISPR/Cas9 é ativado, o sgRNA forma uma ribonucleoproteína (RNP) com a proteína Cas9 e guia Cas9 para seu local alvo através do pareamento de bases das interações RNA-DNA. Em seguida, o DNA de fita dupla pode ser clivado pela proteína Cas9 e, como resultado, a quebra de fita dupla (DSB) emerge perto do motivo adjacente do protoespaçador (PAM) do sítio alvo 9,10,11,12. Para mitigar os danos causados pelos DSBs, as células ativariam respostas abrangentes de danos ao DNA para detectar eficientemente os danos genômicos e iniciar o procedimento de reparo. Existem dois mecanismos distintos de reparo na célula: a junção final não homóloga (NHEJ) e o reparo dirigido por homologia (HDR). NHEJ é a via de reparo mais comum que pode reparar quebras de fita dupla de DNA rapidamente e previne a apoptose celular. No entanto, é propenso a erros por deixar pequenos fragmentos de inserções e deleções (indels) perto dos DSBs, o que geralmente resulta em uma mudança de quadro de leitura aberta e, portanto, pode levar ao nocaute genético. Em contraste, o reparo homólogo é um evento bastante raro. Com a condição de que haja um modelo de reparo com sequências homólogas ao contexto do DSB, as células ocasionalmente reparariam a quebra genômica de acordo com o modelo próximo. O resultado do HDR é que o DSB é precisamente reparado. Especialmente, se houvesse uma sequência adicional entre as sequências homólogas no template, elas seriam integradas ao genoma através do HDR e, dessa forma, as inserções gênicas específicas poderiam ser realizadas¹³.

Com a otimização e o desenvolvimento das estruturas de sgRNA e variantes da proteína Cas9, o sistema de edição genética baseado em CRISPR/Cas9 também tem sido aplicado com sucesso em pesquisas de insetos, incluindo, mas não se limitando a, Drosophila melanogaster, Aedes aegypti, Bombyx mori, Helicoverpa Armigera, Plutella xylostella e Locusta migratoria 14,15,16,17,18 ^,19. Até onde sabemos, embora RNPs constituídas pela proteína Cas9 e sgRNA transcrito in vitro tenham sido utilizados para edição do genoma de gafanhotos^20,21,22, ainda não existe um protocolo sistemático e detalhado para a construção mediada por ribonucleases CRISPR/Cas9 de mutantes homozigotos do gafanhoto migratório.

O gafanhoto migratório é uma importante praga agrícola de distribuição global e ameaça substancial à produção de alimentos, sendo especialmente prejudicial às gramíneas, como trigo, milho, arroz e milheto²³. A análise da função gênica baseada em tecnologias de edição do genoma pode fornecer novos alvos e novas estratégias para o controle de gafanhotos migratórios. Este estudo propõe um método detalhado para nocautear genes de gafanhotos migratórios através do sistema CRISPR/Cas9, incluindo a seleção de sítios alvo e planejamento de sgRNAs, síntese e verificação in vitro dos sgRNAs, microinjeção e cultura de ovos, estimativa da taxa de mutação na fase embrionária, detecção de mutantes, bem como passagem e preservação dos mutantes. Este protocolo pode ser usado como uma referência basal para a manipulação da grande maioria dos genes de gafanhotos e pode fornecer referências valiosas para a edição do genoma de outros insetos.

1. Seleção do local alvo e projeto de sgRNA

1. Coletar o máximo possível de informações de sequência para o gene de interesse através de pesquisa bibliográfica e/ou busca do mRNA ou sequência de DNA codificante (CDS) do gene no banco de dados NCBI e gafanhotos²⁴.
2. Comparar a sequência do gene interessado com sua sequência de DNA genômico para distinguir as regiões do éxon e do íntron.
3. Selecione uma região candidata para o design do site de destino com base no objetivo da pesquisa. Projete pares de primers para amplificar o fragmento da região candidata e verificar sua sequência selvagem por meio da análise de sequenciamento do produto de PCR.
   NOTA: Existem diferentes estratégias para a seleção da região-alvo candidata. Por exemplo, na maioria das pesquisas de função gene/proteína, use o fragmento de éxon próximo ao seu códon inicial como a região candidata para garantir que toda a função proteína/RNA seja perdida após a edição do genoma (ou seja, nocaute do gene). Enquanto para a análise de função de um domínio específico, selecione a região candidata no início (ou ambas as extremidades) do domínio.
4. Use recursos on-line como o E-CRISP Design²⁵ para procurar potenciais sites-alvo na região de destino candidata.
   1. Selecione "Drosophila melanogaster BDGP6" (ou qualquer outro inseto) na lista suspensa de genomas de referência e escolha "Input is FASTA sequence" seguido de colar a sequência da região alvo na caixa de texto (no formato FASTA).
   2. Inicie o aplicativo pressionando "Start sgRNA search" com "medium" e "single design" para obter os possíveis sites de destino. Selecione 1-3 alvos potenciais a partir dos resultados com base em suas pontuações previstas e projete os sgRNAs correspondentes de acordo.
      NOTA: Existem muitas outras plataformas on-line para o design CRISPR, como CRISPOR, CHOPCHOP, CRISPRdirect, ZiFiT, e assim por diante (consulte a Tabela de Materiais). Alguns deles têm a função de verificar a especificidade das espécies cujos dados de sequência genômica estão em seus bancos de dados. No entanto, a sequência genômica dos gafanhotos não foi encontrada em nenhum site online. É melhor usar mais de uma ferramenta on-line para o projeto CRISPR em gafanhotos. De forma abrangente, considere os resultados de diferentes sites e selecione o sgRNA a partir dos resultados com base no princípio da maior especificidade, maior eficiência e menor taxa de incompatibilidade (Figura 1A,B).

2. Síntese e verificação do sgRNA in vitro

1. Sintetizar o sgRNA utilizando kits de síntese de sgRNA de acordo com o manual do fabricante (Tabela de Materiais). Esse procedimento geralmente inclui três etapas: amplificação do molde de DNA, transcrição in vitro e purificação do sgRNA²¹. Diluir o sgRNA sintetizado com água livre de nucleases para uma concentração de armazenamento de 300 ng/μL para uso posterior.
2. Amplificar e purificar o fragmento do gene alvo para servir como substrato do ensaio de clivagem in vitro do sistema CRISPR/Cas9. Execute estas etapas seguindo as instruções do fabricante.
3. Diluir a proteína Cas9 adquirida a 300 ng/μL com água livre de nucleases. Incubar 1 μL de sgRNA (300 ng/μL) e 1 μL de proteína Cas9 (300 ng/μL) com 200 ng de fragmento alvo purificado no tampão de clivagem a 37 °C durante 1 h (10 μL de volume total; ver Tabela 1). Estimar a eficiência da clivagem de Cas9 induzida por sgRNA por eletroforese em gel de agarose (Figura 1C). Selecione os sgRNAs com alta atividade para a seguinte microinjeção.
   NOTA: Os resultados da eletroforese em gel de agarose podem ser convertidos em imagens em tons de cinza com software de processamento de imagens e a eficiência de clivagem é estimada de acordo com a escala de cinza das bandas de tamanhos especulados.

3. Microinjeção e cultura dos ovos

1. Prepare as agulhas de injeção puxando os capilares de vidro com um extrator de micropipeta (Tabela de Materiais). Defina os parâmetros da seguinte forma: Calor para 588, Puxar para 90, Velocidade para 60 e Tempo para 40. Triture a ponta da agulha de injeção com um micro moedor (Tabela de Materiais).
   OBS: As pontas ideais da agulha são abertas e pontiagudas (Figura 2A). É altamente recomendável preparar agulhas adicionais para os experimentos, porque as agulhas às vezes são bloqueadas ou quebradas acidentalmente durante as injeções.
2. Misturar 1 μL da proteína Cas9 (300 ng/μL) com 1 μL do sgRNA verificado (300 ng/μL) para obter as RNPs injetáveis. Adicione 8 μL de água estéril sem RNase para fazer o volume final da mistura para 10 μL. Misture bem a solução e mantenha-a no gelo.
   NOTA: As concentrações finais da proteína Cas9 e sgRNAs podem ser otimizadas de acordo com os resultados da edição. Evite o congelamento e descongelamento repetitivos da solução preparada de RNP e recomenda-se o uso imediato.
3. Criar os gafanhotos adultos machos e fêmeas juntos a 30 °C com fotoperíodo de 16 (claro):8 (escuro) e fornecer-lhes mudas de trigo fresco suficientes como alimento. Observe esses gafanhotos diariamente e coloque um vaso de oviposição (um vaso de plástico ou copo cheio de areia estéril molhada) na gaiola de criação para oviposição assim que os gafanhotos acasalarem.
   NOTA: Normalmente, 100 pares de gafanhotos adultos criados em uma gaiola de criação (40 cm x 40 cm x 40 cm) são suficientes para gerar ovos para nocautear um único gene. Cultive pares de gafanhotos adicionais se mais ovos forem necessários.
4. Recolha as vagens de ovos recém-colocadas do pote de oviposição e aguarde cerca de 30 minutos para o bronzeamento dos ovos. Isole suavemente os ovos das vagens de ovos em água usando uma escova fina e lave-os com água estéril três vezes. Mantenha os ovos em uma placa de Petri e adicione água estéril para mantê-los úmidos.
   NOTA: O curtimento dos ovos recém-postos pode melhorar significativamente a eficiência mutante²¹.
5. Encha uma agulha de injeção com a solução RNP preparada e carregue-a no micromanipulador (Tabela de Materiais).
   1. Defina os parâmetros de microinjeção da seguinte forma: 300 hPa da pressão de injeção (pi), 0,5 s do tempo de injeção (ti) e 25 hPa da pressão de compensação (pc).
   2. Pressione o pedal para avaliar o volume da solução injetada. Ajuste a pressão de injeção e o tempo de injeção para garantir que o volume de injeção seja de cerca de 50-100 nL.
      NOTA: Exaure o ar residual na agulha para tornar a solução de injeção contínua e controlável tanto quanto possível. A conexão da agulha e do micromanipulador precisa ser apertada.
6. Dispor os ovos estéreis regularmente sobre a almofada injetora (Figura 2B,C) e colocá-la sobre a mesa objeto do microscópio (Figura 3A). Ajustar a ampliação do microscópio até que os ovos sejam observados. Ajuste a agulha de microinjeção sob o microscópio até que a ponta de injeção possa ser vista e posicione-a perto do ovo a ser injetado.
7. Inicie a injeção a uma altura adequada e num ângulo de 30-45 graus. Insira a ponta no ovo cuidadosamente perto das micrópilas do ovo (Figura 3B) e pressione o pedal para realizar a injeção. Retraia a agulha rapidamente e mova a almofada de injeção para injeção do próximo ovo.
   NOTA: Deve observar-se uma ligeira expansão do ovo durante a microinjeção. Uma pequena quantidade de extravasamento citoplasmático no orifício é aceitável. Substitua a agulha de injeção por uma nova ou ajuste o ângulo de injeção se a saída de líquido for excessiva.
8. Transfira os ovos injetados para uma placa de cultura (uma placa de Petri com um pedaço de papel de filtro úmido) e coloque-os em uma incubadora a 30 °C.
   NOTA: Levará cerca de 13-14 dias até que as ninfas eclodam desses ovos injetados (com a condição de que a mutação do gene alvo não afete o desenvolvimento dos embriões) (Figura 3C). Injetar pelo menos 100 ovos para garantir uma quantidade suficiente de eclosão e eclosão para eliminar um gene específico.

4. Estimativa da taxa de mutação e triagem de mutantes

1. Verifique o desenvolvimento dos ovos injetados todos os dias após a injeção. Transfira os ovos injetados para uma nova placa de cultura a cada 24 h nos primeiros 5 dias.
2. No^6º dia (ou mais tarde) após a injeção, colher e transferir aleatoriamente 10 ovos para um tubo e triturar adequadamente os ovos com duas esferas de aço a 60 Hz por 6 min usando um moedor (ver Tabela de Materiais). Ressuspender os detritos com 1 mL de PBS. Transferir 5 μL da mistura para 45 μL de NaOH 50 mM e lisar a 95 °C durante 5 min. Adicionar 5 μL de Tris-HCl 1 M (pH=8,0) no sistema de lise para terminar a reação de lise alcalina.
   NOTA: Os ovos podem ser selecionados para lise alcalina em qualquer dia após a última transferência e vários ovos podem ser usados como uma amostra, dependendo de sua situação de desenvolvimento (por exemplo, cinco embriões de 6 dias podem ser usados como uma amostra, e dois embriões de 10 dias podem ser usados como uma amostra). Às vezes, não é viável obter o DNA genômico dos ovos usando o método de lise alcalina. Kits comerciais de extração de DNA genômico podem ser usados como um método alternativo para isolar o DNA genômico dos ovos.
3. Tome 1 μL do produto da lise como molde de PCR para amplificar o fragmento do gene alvo (Tabela 2 e Tabela 3) e envie os produtos de PCR para sequenciamento. Comparar os resultados do sequenciamento com a sequência selvagem para avaliar preliminarmente se o sistema CRISPR/Cas9 clivou o gene alvo in vivo (Figura 4A). Permitir o resto dos ovos para o desenvolvimento subsequente na condição de que indels são detectados na fase embrionária.
   NOTA: Desta forma, a taxa de mutação pode ser preliminarmente estimada na fase embrionária. Se nenhum indels for encontrado nesta etapa, prepare alguns novos sgRNAs para o gene alvo e repita o protocolo de nocaute da etapa 2.1.
4. Transferir as ninfas eclodidas para uma gaiola de criação e cultivá-las conforme descrito na etapa 3.3. Quando as ninfas evoluírem para o estágio de quinto ínstar, separe-as com copos plásticos de cultura (1 ninfa/xícara).
   NOTA: Geralmente leva cerca de 25-35 dias para que as ninfas se desenvolvam até seu quinto ínstar e o fenótipo mais óbvio é que os brotos alares se estendem até o quarto ou quinto segmentos abdominais. Além disso, recomenda-se registrar os fenótipos de ninfas mortas para predizer a relação entre o gene alvo e os fenótipos em pesquisas futuras.
5. Cortar cerca de 2 mm de comprimento das antenas com uma tesoura dissecante e lisá-la utilizando o método de lise alcalina (passo 4.2). Analisar a sequência de fragmentos gênicos alvo dessas ninfas conforme descrito acima (passo 4.3) para identificar os mutantes G₀ (Figura 4B).
   NOTA: O corte das antenas para lise pode ser um pouco mais longo e moer ou picar as antenas é útil para lise, embora as antenas possam ser digeridas diretamente. Indivíduos com múltiplos picos próximos ao local alvo no resultado do sequenciamento são identificados como mutantes positivos e permitem o desenvolvimento e acasalamento subsequentes.

5. Estabelecimento e passagem de linhagens mutantes

1. Realizar cruzamento utilizando os mutantes G₀ e gafanhotos selvagens (Figura 4B). Recolher os oocistos e incubá-los separadamente a 30 °C. Use 3-6 ovos desenvolvidos em cada oocisto para detectar mutações conforme descrito nas etapas 4.2 e 4.3. Mantenha oocistos mutação-positivos para o desenvolvimento subsequente e abandone os oocistos mutação-negativos.
   NOTA: A estimativa da taxa de mutação na fase embrionária pode acelerar muito a triagem de mutantes_G1 . Geralmente, 3-6 ovos desenvolvidos podem ser misturados como uma amostra para genotipagem mediada por PCR, como descrito acima.
2. Recuar as ninfas G₁ conforme descrito no passo 4.4. Cortar cerca de 2 mm de comprimento das antenas para realizar a genotipagem baseada em PCR, conforme descrito na etapa 4.5 para detectar heterozigotos G₁ . Realizar a clonagem de AT de acordo com as instruções do fabricante (ver Tabela de Materiais) para identificar suas mutações. Realizar o cruzamento utilizando heterozigotos G₁ com as mesmas mutações para obtenção de ninfas G₂ .
   NOTA: O sequenciamento de Sanger dos produtos de PCR só pode fornecer informações para descobrir os heterozigotos, mas não informações suficientes para identificar as mutações exatas. Assim, a clonagem de TA usando os produtos da PCR é necessária para identificar claramente as mutações e pode promover o estabelecimento de linhagens mutantes estáveis.
3. Recue as ninfas G₂ até o quinto ínstar. Use a genotipagem baseada em PCR descrita na etapa 5.2 para identificar os homozigotos e/ou heterozigotos que são adequados para pesquisas futuras e passagem estável (Figura 4B).
   OBS: Preste atenção para evitar a mistura de homozigotos e heterozigotos. Recomenda-se a realização de genotipagem baseada em PCR em cada geração para confirmar a homozigosidade e/ou heterozigosidade de cada população. O número de gafanhotos utilizados para esta verificação depende do tamanho da população. Além disso, a população de gafanhotos pode ser expandida pela estratégia in-cross.

6. Criopreservação e ressuscitação de ovos

1. Lavar os ovos a serem criopreservados com água estéril e incubá-los em uma placa de cultura conforme descrito acima (passo 3.8) por 5-6 dias. Junte esses ovos no prato de cultura e cubra-os com fragmentos de papel de filtro. Embrulhe todo o prato de cultura com um filme de parafina.
2. Mantenha o prato a 25 °C por 2 dias seguidos por mais 2 dias a uma temperatura relativamente mais baixa (13-16 °C). Em seguida, transfira o prato para uma geladeira a 6 °C. Adicione água a cada 2 semanas para proporcionar um ambiente úmido para os ovos (Figura 5A).
   NOTA: Especula-se que os embriões estejam na fase katatrepsis após serem desenvolvidos por 5-6 dias a 30 °C²⁶. O resfriamento do gradiente é útil para a criopreservação dos ovos (Tabela 5).
3. Para ressuscitar os ovos criopreservados, retire a placa de Petri da geladeira e mantenha-a a 25 °C por 2 dias. Colocar esses ovos em incubadora a 30 °C até que as ninfas eclodam (Figura 5B).
   NOTA: É necessário colocar os ovos criopreservados a 25 °C antes de transferi-los para uma incubadora a 30 °C. Os embriões podem ser criopreservados por pelo menos cinco meses, embora a taxa de eclosão e a taxa de eclosão possam diminuir devido à criopreservação (Tabela 5).

Este protocolo contém as etapas detalhadas para geração de mutantes homozigotos dos gafanhotos migratórios com a RNP constituída pela proteína Cas9 e sgRNA sintetizado in vitro . A seguir estão alguns resultados representativos do knockout do gene alvo mediado por CRISPR/Cas9 em gafanhotos, incluindo seleção de alvo, síntese e verificação de sgRNA (Figura 1A), coleta e injeção de ovos, triagem e passagem de mutantes, criopreserva e ressuscitação dos ovos homozigotos....

Os gafanhotos estão entre as pragas mais devastadoras para a agricultura desde a civilização dos seres humanos²³. A tecnologia de edição do genoma baseada em CRISPR/Cas9 é uma ferramenta poderosa para fornecer um melhor conhecimento dos mecanismos biológicos em gafanhotos, bem como uma estratégia promissora de controle de pragas. Assim, é de grande benefício desenvolver um método eficiente e fácil de usar de construção de mutantes homozigotos de gafanhotos mediada por CRISPR/Cas9. Em...

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Este trabalho foi apoiado pela National Natural Science Foundation of China (32070502, 31601697, 32072419 e pela China Postdoctoral Science Foundation (2020M672205).