Construcción de mutantes homocigotos de langostas migratorias utilizando tecnología CRISPR/Cas9

Este estudio proporciona un procedimiento sistemáticamente optimizado de la construcción basada en ribonucleasa CRISPR / Cas9 de mutantes de langosta homocigota, así como un método detallado para la criopreservación y reanimación de los huevos de langosta.

La langosta migratoria, Locusta migratoria, no solo es una de las langostas de peste mundial que causó enormes pérdidas económicas a los seres humanos, sino también un importante modelo de investigación para la metamorfosis de insectos. El sistema CRISPR / Cas9 puede localizar con precisión un locus de ADN específico y escindirlo dentro del sitio objetivo, introduciendo eficientemente roturas de doble cadena para inducir la eliminación del gen objetivo o integrar nuevos fragmentos de genes en el locus específico. La edición del genoma mediada por CRISPR/Cas9 es una herramienta poderosa para abordar las preguntas encontradas en la investigación de la langosta, así como una tecnología prometedora para el control de la langosta. Este estudio proporciona un protocolo sistemático para la eliminación de genes mediados por CRISPR / Cas9 con el complejo de proteína Cas9 y ARN guía única (sgRNA) en langostas migratorias. La selección de los sitios diana y el diseño del sgRNA se describen en detalle, seguidos de la síntesis in vitro y la verificación de los sgRNAs. Los procedimientos posteriores incluyen la recolección de balsas de huevos y la separación de huevos curtidos para lograr una microinyección exitosa con baja tasa de mortalidad, cultivo de huevos, estimación preliminar de la tasa de mutación, reproducción de langostas, así como detección, preservación y paso de los mutantes para garantizar la estabilidad de la población de las langostas editadas. Este método se puede utilizar como referencia para aplicaciones de edición de genes basadas en CRISPR / Cas9 en langostas migratorias, así como en otros insectos.

Las tecnologías de edición de genes podrían utilizarse para introducir inserciones o deleciones en un locus específico del genoma para modificar artificialmente el gen objetivo a propósito¹. En los últimos años, la tecnología CRISPR/Cas9 se ha desarrollado rápidamente y tiene un alcance creciente de aplicaciones en diversos campos de las ciencias de la vida 2,3,4,5,6. El sistema CRISPR/Cas9 fue descubierto en 1987⁷, y se encuentra ampliamente en bacterias y arqueas. Investigaciones posteriores indicaron que se trataba de un sistema inmune adaptativo procariota que depende de la nucleasa Cas9 guiada por ARN para luchar contra los fagos⁸. El sistema CRISPR/Cas9 modificado artificialmente consta principalmente de dos componentes, un único ARN guía (sgRNA) y la proteína Cas9. El sgRNA está formado por un ARN CRISPR (crRNA) complementario a la secuencia diana y un crRNA transactivador auxiliar (tracrRNA), que está relativamente conservado. Cuando se activa el sistema CRISPR/Cas9, el sgRNA forma una ribonucleoproteína (RNP) con la proteína Cas9 y guía a Cas9 a su sitio objetivo a través del emparejamiento de bases de las interacciones ARN-ADN. Luego, el ADN de doble cadena puede ser escindido por la proteína Cas9 y, como resultado, la ruptura de doble cadena (DSB) emerge cerca del motivo adyacente al protoespaciador (PAM) del sitio objetivo 9,10,11,12. Para mitigar el daño causado por los DSB, las células activarían respuestas integrales al daño del ADN para detectar eficientemente los daños genómicos e iniciar el procedimiento de reparación. Hay dos mecanismos de reparación distintos en la célula: unión de extremos no homólogos (NHEJ) y reparación dirigida por homología (HDR). NHEJ es la vía de reparación más común que puede reparar las roturas de doble cadena del ADN rápidamente y previene la apoptosis celular. Sin embargo, es propenso a errores debido a dejar pequeños fragmentos de inserciones y deleciones (indeles) cerca de los DSB, lo que generalmente resulta en un cambio de marco de lectura abierto y, por lo tanto, puede conducir a la eliminación de genes. En contraste, la reparación homóloga es un evento bastante raro. Con la condición de que haya una plantilla de reparación con secuencias homólogas al contexto del DSB, las células ocasionalmente repararían la ruptura genómica de acuerdo con la plantilla cercana. El resultado de HDR es que el DSB se repara con precisión. Especialmente, si hay una secuencia adicional entre las secuencias homólogas en la plantilla, se integrarían en el genoma a través de HDR, y de esta manera, las inserciones genéticas específicas podrían realizarse¹³.

Con la optimización y el desarrollo de las estructuras sgRNA y las variantes de la proteína Cas9, el sistema de edición genética basado en CRISPR / Cas9 también se ha aplicado con éxito en la investigación de insectos, incluidos, entre otros, Drosophila melanogaster, Aedes aegypti, Bombyx mori, Helicoverpa Armigera, Plutella xylostella y Locusta migratoria 14,15,16,17,18 ^,19. Hasta donde saben los autores, aunque las RNP que consisten en la proteína Cas9 y el sgRNA transcrito in vitro se han utilizado para la edición del genoma de la langosta^20,21,22, todavía falta un protocolo sistemático y detallado para la construcción mediada por ribonucleasa CRISPR / Cas9 de mutantes homocigotos de la langosta migratoria.

La langosta migratoria es una plaga agrícola importante que tiene una distribución mundial y representa amenazas sustanciales para la producción de alimentos, siendo especialmente dañina para las plantas gramíneas, como el trigo, el maíz, el arroz y el mijo²³. El análisis de la función génica basado en tecnologías de edición del genoma puede proporcionar nuevos objetivos y nuevas estrategias para el control de las langostas migratorias. Este estudio propone un método detallado para eliminar genes de langostas migratorias a través del sistema CRISPR / Cas9, incluida la selección de sitios objetivo y el diseño de sgRNAs, síntesis in vitro y verificación de los sgRNAs, microinyección y cultivo de óvulos, estimación de la tasa de mutación en la etapa embrionaria, detección de mutantes, así como paso y preservación de los mutantes. Este protocolo podría usarse como referencia basal para la manipulación de la gran mayoría de los genes de langostas y puede proporcionar referencias valiosas para la edición del genoma de otros insectos.

1. Selección del sitio objetivo y diseño de sgRNA

1. Recopilar tanta información de secuencia como sea posible para el gen de interés a través de la investigación bibliográfica y/o la búsqueda del ARNm o la secuencia de ADN codificante (CDS) del gen en la base de datos NCBI y langosta²⁴.
2. Compare la secuencia del gen interesado con su secuencia de ADN genómico para distinguir las regiones de exón e intronio.
3. Seleccione una región candidata para el diseño del sitio de destino en función del propósito de la investigación. Diseñe pares de cebadores para amplificar el fragmento de la región candidata y verificar su secuencia de tipo salvaje mediante el análisis de secuenciación del producto de PCR.
   NOTA: Existen diferentes estrategias para la selección de la región objetivo candidata. Por ejemplo, en la mayoría de las investigaciones sobre la función de genes / proteínas, use el fragmento de exón cerca de su codón de inicio como la región candidata para asegurarse de que toda la función de proteína / ARN se pierda después de la edición del genoma (es decir, eliminación de genes). Mientras que para el análisis de funciones de un dominio específico, seleccione la región candidata al principio (o ambos extremos) del dominio.
4. Utilice recursos en línea como E-CRISP Design²⁵ para buscar posibles sitios objetivo en la región objetivo candidata.
   1. Seleccione "Drosophila melanogaster BDGP6" (o cualquier otro insecto) en la lista desplegable de genomas de referencia y elija "La entrada es la secuencia FASTA" seguido de pegar la secuencia de la región objetivo en el cuadro de texto (en formato FASTA).
   2. Inicie la aplicación presionando "Iniciar búsqueda de sgRNA" con "medio" y "diseño único" para obtener los posibles sitios de destino. Seleccione 1-3 objetivos potenciales de los resultados en función de sus puntuaciones previstas y diseñe los sgRNAs correspondientes en consecuencia.
      NOTA: Hay muchas más plataformas en línea para el diseño CRISPR, como CRISPOR, CHOPCHOP, CRISPRdirect, ZiFiT, etc. (consulte la Tabla de materiales). Algunos de ellos tienen la función de verificación de especificidad para las especies cuyos datos de secuencia genómica están en sus bases de datos. Sin embargo, la secuencia genómica de las langostas no se ha encontrado en ningún sitio web en línea. Es mejor usar más de una herramienta en línea para el diseño CRISPR en langostas. De manera exhaustiva, considere los resultados de diferentes sitios web y seleccione el sgRNA de los resultados según el principio de mayor especificidad, mayor eficiencia y menor tasa de desajuste (Figura 1A, B).

2. Síntesis y verificación del sgRNA in vitro

1. Sintetice el sgRNA utilizando kits de síntesis de sgRNA de acuerdo con el manual del fabricante (Tabla de materiales). Este procedimiento generalmente incluye tres pasos: amplificación de la plantilla de ADN, transcripción in vitro y purificación de sgRNA²¹. Diluir el sgRNA sintetizado con agua libre de nucleasas a una concentración de almacenamiento de 300 ng/μL para su uso posterior.
2. Amplificar y purificar el fragmento del gen diana para que sirva como sustrato del ensayo de escisión in vitro del sistema CRISPR/Cas9. Realice estos pasos siguiendo las instrucciones del fabricante.
3. Diluir la proteína Cas9 comprada a 300 ng/μL con agua libre de nucleasas. Incubar 1 μL de sgRNA (300 ng/μL) y 1 μL de proteína Cas9 (300 ng/μL) con 200 ng de fragmento diana purificado en el tampón de escisión a 37 °C durante 1 h (10 μL de volumen total; ver Tabla 1). Estimar la eficiencia de la escisión de Cas9 inducida por sgRNA mediante electroforesis en gel de agarosa (Figura 1C). Seleccione los sgRNAs con alta actividad para la siguiente microinyección.
   NOTA: Los resultados de la electroforesis en gel de agarosa se pueden convertir en imágenes en escala de grises con software de procesamiento de imágenes y la eficiencia de la escisión se estima de acuerdo con la escala de grises de las bandas de tamaños especulados.

3. Microinyección y cultivo de los huevos

1. Prepare las agujas de inyección tirando de los capilares de vidrio con un extractor de micropipetas (Tabla de materiales). Establezca los parámetros de la siguiente manera: Calor a 588, Tirar a 90, Velocidad a 60 y Tiempo a 40. Moler la punta de la aguja de inyección con un micro molinillo (Tabla de materiales).
   NOTA: Las puntas ideales de las agujas son abiertas y de bordes afilados (Figura 2A). Se recomienda encarecidamente preparar agujas adicionales para los experimentos porque las agujas a veces se bloquean o se rompen accidentalmente durante las inyecciones.
2. Mezclar 1 μL de proteína Cas9 (300 ng/μL) con 1 μL del sgRNA verificado (300 ng/μL) para obtener los RNPs para inyección. Agregue 8 μL de agua estéril libre de RNasa para que el volumen final de la mezcla sea de 10 μL. Mezcle bien la solución y manténgala en hielo.
   NOTA: Las concentraciones finales de la proteína Cas9 y los sgRNAs se pueden optimizar de acuerdo con los resultados de edición. Evite la congelación y descongelación repetitiva de la solución de RNP preparada y se recomienda su uso inmediato.
3. Criar las langostas adultas macho y hembra juntas a 30 °C con un fotoperiodo 16 (claro):8 (oscuro) y suministrarles suficientes plántulas de trigo fresco como alimento. Observe estas langostas diariamente y coloque una maceta de oviposición (una maceta de plástico o una taza llena de arena estéril húmeda) en la jaula de cría para la oviposición una vez que las langostas se aparearon.
   NOTA: Por lo general, 100 parejas de langostas adultas criadas en una jaula de cría (40 cm x 40 cm x 40 cm) son suficientes para generar huevos para eliminar un solo gen. Cultive pares adicionales de langostas si se necesitan más huevos.
4. Recoja las vainas de huevo recién puestas de la olla de oviposición y espere unos 30 minutos para el bronceado del huevo. Aísle suavemente los huevos de las vainas de huevo en agua con un cepillo fino y lávelos con agua estéril tres veces. Mantenga los huevos en una placa de Petri y agregue agua estéril para mantenerlos húmedos.
   NOTA: El curtido de los huevos recién puestos puede mejorar significativamente la eficiencia mutante²¹.
5. Llene una aguja de inyección con la solución de RNP preparada y cárguela en el micromanipulador (Tabla de materiales).
   1. Ajuste los parámetros de microinyección de la siguiente manera: 300 hPa de la presión de inyección (pi), 0,5 s del tiempo de inyección (ti) y 25 hPa de la presión de compensación (pc).
   2. Presione el pedal para evaluar el volumen de la solución inyectada. Ajuste la presión de inyección y el tiempo de inyección para asegurarse de que el volumen de inyección sea de aproximadamente 50-100 nL.
      NOTA: Expulse el aire residual en la aguja para que la solución de inyección sea continua y controlable tanto como sea posible. La conexión de la aguja y el micromanipulador debe ser estrecha.
6. Coloque los huevos estériles regularmente en la almohadilla de inyección (Figura 2B, C) y coloque la almohadilla en la mesa de objetos del microscopio (Figura 3A). Ajuste el aumento del microscopio hasta que se observen los huevos. Ajuste la aguja de microinyección bajo el microscopio hasta que se pueda ver la punta de inyección y colóquela cerca del huevo que se inyectará.
7. Comience la inyección a una altura adecuada y un ángulo de 30-45 grados. Inserte la punta en el huevo cuidadosamente cerca de los micropyles del huevo (Figura 3B) y presione el pedal para realizar la inyección. Retraiga la aguja rápidamente y mueva la almohadilla de inyección para inyectar el siguiente óvulo.
   NOTA: Se debe observar una ligera expansión del huevo durante la microinyección. Una pequeña cantidad de fuga citoplasmática en el agujero de alfiler es aceptable. Reemplace la aguja de inyección por una nueva o ajuste el ángulo de inyección si la salida de líquido es demasiado.
8. Transfiera los huevos inyectados a una placa de cultivo (una placa de Petri con un trozo de papel de filtro húmedo) y colóquelos en una incubadora a 30 °C.
   NOTA: Pasarán unos 13-14 días hasta que las ninfas eclosionen de estos huevos inyectados (a condición de que la mutación del gen diana no afecte el desarrollo de los embriones) (Figura 3C). Inyecte al menos 100 huevos para asegurar una cantidad suficiente de eclosión y eclosión para eliminar un gen específico.

4. Estimación de la tasa de mutación y cribado de mutantes

1. Verifique el desarrollo de los óvulos inyectados todos los días después de la inyección. Transfiera los huevos inyectados a una nueva placa de cultivo cada 24 h en los primeros 5 días.
2. En el^6º día (o más tarde) después de la inyección, recoja y transfiera al azar 10 huevos a un tubo y muele adecuadamente los huevos con dos bolas de acero a 60 Hz durante 6 minutos usando un molinillo (consulte la Tabla de materiales). Resuspender los desechos con 1 ml de PBS. Transfiera 5 μL de la mezcla a 45 μL de NaOH a 50 mM y lílea a 95 °C durante 5 min. Añadir 5 μL de 1 M Tris-HCl (pH=8,0) en el sistema de lisis para terminar la reacción de lisis alcalina.
   NOTA: Los huevos se pueden seleccionar para la lisis alcalina en cualquier día después de la última transferencia y se pueden usar múltiples óvulos como una muestra dependiendo de su situación de desarrollo (por ejemplo, cinco embriones de 6 días se pueden usar como una muestra, y dos embriones de 10 días se pueden usar como una muestra). A veces, no es factible obtener el ADN genómico de los huevos utilizando el método de lisis alcalina. Los kits comerciales de extracción de ADN genómico se pueden utilizar como un método alternativo para aislar el ADN genómico de los óvulos.
3. Tome 1 μL del producto de lisis como plantilla de PCR para amplificar el fragmento del gen diana (Tabla 2 y Tabla 3) y envíe los productos de PCR para su secuenciación. Compare los resultados de la secuenciación con la secuencia de tipo salvaje para evaluar preliminarmente si el sistema CRISPR/Cas9 escindió el gen diana in vivo (Figura 4A). Permitir el resto de los óvulos para su posterior desarrollo a condición de que los indeles se detecten en la etapa embrionaria.
   NOTA: De esta manera, la tasa de mutación se puede estimar preliminarmente en la etapa embrionaria. Si no se encuentran indeles en este paso, prepare algunos nuevos sgRNAs para el gen diana y repita el protocolo knock-out del paso 2.1.
4. Transfiera las ninfas eclosionadas a una jaula de cría y críelas como se describe en el paso 3.3. Cuando las ninfas se desarrollaron a la quinta etapa de estadio, sepárelas con vasos de cultivo de plástico (1 ninfa / taza).
   NOTA: Por lo general, las ninfas tardan entre 25 y 35 días en desarrollarse hasta su quinto estadio y el fenotipo más obvio es que las yemas de las alas se extienden hasta el cuarto o quinto segmento abdominal. Además, se recomienda registrar los fenotipos de ninfas muertas para predecir la relación entre el gen objetivo y los fenotipos en futuras investigaciones.
5. Cortar aproximadamente 2 mm de longitud de las antenas con tijeras de disección y lisarlo utilizando el método de lisis alcalina (paso 4.2). Analice la secuencia del fragmento del gen objetivo de estas ninfas como se describió anteriormente (paso 4.3) para identificar los mutantes G₀ (Figura 4B).
   NOTA: Las antenas cortadas para la lisis pueden ser un poco más largas y moler o picar las antenas es útil para la lisis, aunque las antenas se pueden digerir directamente. Los individuos con múltiples picos cerca del sitio objetivo en el resultado de la secuenciación se identifican como mutantes positivos y se les permite el desarrollo y el apareamiento posteriores.

5. Establecimiento y paso de líneas mutantes

1. Realizar cruzamientos utilizando los mutantes G₀ y langostas de tipo salvaje (Figura 4B). Recoger los ooquistes e incubar estos ooquistes por separado a 30 °C. Use 3-6 óvulos desarrollados en cada ooquiste para detectar mutaciones como se describe en los pasos 4.2 y 4.3. Mantener los ooquistes con mutación positiva para el desarrollo posterior y abandonar los ooquistes con mutación negativa.
   NOTA: La estimación de la tasa de mutación en la etapa embrionaria puede acelerar en gran medida la detección de mutantes G₁ . Por lo general, 3-6 óvulos desarrollados se pueden mezclar como una muestra para el genotipado mediado por PCR como se describió anteriormente.
2. Criar las ninfas G₁ como se describe en el paso 4.4. Corte aproximadamente 2 mm de longitud de las antenas para realizar el genotipado basado en PCR como se describe en el paso 4.5 para detectar heterocigotos G₁ . Realice la clonación de TA de acuerdo con las instrucciones del fabricante (consulte la Tabla de materiales) para identificar sus mutaciones. Realizar in-cross utilizando heterocigotos_G1 con las mismas mutaciones para obtener ninfas_G2 .
   NOTA: La secuenciación de Sanger de los productos de PCR solo puede proporcionar información para descubrir los heterocigotos, pero no suficiente información para identificar las mutaciones exactas. Por lo tanto, la clonación de TA utilizando los productos de PCR es necesaria para identificar claramente las mutaciones y puede promover el establecimiento de líneas mutantes estables.
3. Cría a las ninfas G₂ hasta su quinto estadio. Utilice el genotipado basado en PCR descrito en el paso 5.2 para identificar los homocigotos y/o heterocigotos que son adecuados para futuras investigaciones y pases estables (Figura 4B).
   NOTA: Preste atención para evitar la mezcla de homocigotos y heterocigotos. Se recomienda realizar genotipado basado en PCR en cada generación para confirmar la homocigosidad y/o heterocigosidad de cada población. El número de langostas utilizadas para este control depende del tamaño de la población. Además, la población de langostas puede ampliarse mediante la estrategia de cruce.

6. Criopreservación y reanimación de óvulos

1. Lave los huevos a criopreservar con agua estéril e incubarlos en una placa de cultivo como se describe anteriormente (paso 3.8) durante 5-6 días. Reúna estos huevos en la placa de cultivo y cúbralos con fragmentos de papel de filtro. Envuelva todo el plato de cultivo con una película de parafina.
2. Mantener el plato a 25 °C durante 2 días seguidos de otros 2 días a una temperatura relativamente más baja (13-16 °C). A continuación, transfiera el plato a una nevera a 6 °C. Agregue agua cada 2 semanas para proporcionar un ambiente húmedo para los huevos (Figura 5A).
   NOTA: Se especula que los embriones están en la etapa de katatrepsis después de haber sido desarrollados durante 5-6 días a 30 ° C²⁶. El enfriamiento por gradiente es útil para la criopreservación de óvulos (Tabla 5).
3. Para resucitar los huevos criopreservados, saque la placa de Petri del refrigerador y manténgala a 25 °C durante 2 días. Coloque estos huevos en una incubadora a 30 °C hasta que las ninfas eclosionen (Figura 5B).
   NOTA: Es necesario poner los huevos criopreservados a 25 °C antes de transferirlos a una incubadora a 30 °C. Los embriones pueden ser criopreservados durante al menos cinco meses, aunque la tasa de eclosión y la tasa de eclosión pueden disminuir debido a la criopreservación (Tabla 5).

Este protocolo contiene los pasos detallados para generar mutantes homocigotos de las langostas migratorias con el RNP constituido por la proteína Cas9 y sgRNA sintetizado in vitro . Los siguientes son algunos resultados representativos de la eliminación del gen diana mediado por CRISPR/Cas9 en langostas, incluida la selección de dianas, la síntesis y verificación de sgRNA (Figura 1A), la recolección e inyección de óvulos, la detección y el paso de mutantes, la criopreserva...

Las langostas han sido una de las plagas más devastadoras para la agricultura desde la civilización de los seres humanos²³. La tecnología de edición del genoma basada en CRISPR/Cas9 es una herramienta poderosa para proporcionar un mejor conocimiento de los mecanismos biológicos en las langostas, así como una estrategia prometedora de control de plagas. Por lo tanto, es de gran beneficio desarrollar un método eficiente y fácil de usar para la construcción mediada por CRISPR / Cas9 de mutan...

Los autores declaran que no tienen conflictos de intereses.

Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (32070502, 31601697, 32072419 y la Fundación de Ciencias Postdoctorales de China (2020M672205).