CRISPR/Cas9技術を用いた渡りバッタのホモ接合変異体の構築

この研究は、CRISPR/Cas9リボヌクレアーゼベースのホモ接合型ローカスト変異体の構築の体系的に最適化された手順と、イナゴ卵の凍結保存と蘇生のための詳細な方法を提供します。

渡りバッタである Locusta migratoriaは、人類に莫大な経済的損失をもたらした世界的なペストバッタの1つであるだけでなく、昆虫の変態の重要な研究モデルでもあります。CRISPR/Cas9システムは、特定のDNA遺伝子座を正確に特定し、標的部位内で切断し、二本鎖切断を効率的に導入して標的遺伝子ノックアウトを誘導したり、新しい遺伝子断片を特定の遺伝子座に組み込んだりすることができます。CRISPR/Cas9を介したゲノム編集は、イナゴの研究で遭遇する問題に対処するための強力なツールであり、バッタ防除のための有望な技術です。この研究は、移動性バッタにおけるCas9タンパク質とシングルガイドRNA(sgRNA)の複合体を使用したCRISPR/Cas9を介した遺伝子ノックアウトの系統的プロトコルを提供します。標的部位の選択とsgRNAの設計について詳細に説明し、その後、 in vitro 合成とsgRNAの検証を行います。その後の手順には、卵いかだの収集と日焼け卵の分離が含まれ、死亡率の低いマイクロインジェクションの成功、卵の培養、突然変異率の予備推定、イナゴの繁殖、および編集されたイナゴの個体群の安定性を確保するための突然変異体の検出、保存、および通過が含まれます。この方法は、渡りバッタや他の昆虫におけるCRISPR/Cas9ベースの遺伝子編集アプリケーションのリファレンスとして使用できます。

遺伝子編集技術を使用して、特定のゲノム遺伝子座に挿入または欠失を導入し^、目的1で標的遺伝子を人為的に改変することができます。過去数年間で、CRISPR / Cas9技術は急速に発展し、ライフサイエンスのさまざまな分野での適用範囲を拡大しています2,3,4,5,6。CRISPR / Cas9システムは1987年に発見され⁷、細菌や古細菌に広く見られます。さらなる研究は、ファージ⁸と戦うためにRNA誘導ヌクレアーゼCas9に依存する原核生物の適応免疫系であることを示しました。人工的に改変されたCRISPR/Cas9システムは、主に単一のガイドRNA(sgRNA)とCas9タンパク質の2つのコンポーネントで構成されています。sgRNAは、標的配列に相補的なCRISPR RNA(crRNA)と、比較的保存されている補助トランス活性化crRNA(tracrRNA)で構成されています。CRISPR/Cas9システムが活性化されると、sgRNAはCas9タンパク質とリボ核タンパク質(RNP)を形成し、RNA-DNA相互作用の塩基対を介してCas9を標的部位に誘導します。次に、二本鎖DNAはCas9タンパク質によって切断され、その結果、標的部位9,10,11,12のプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)の近くに二本鎖切断(DSB)が出現する。DSBによって引き起こされる損傷を軽減するために、細胞は包括的なDNA損傷応答を活性化して、ゲノム損傷を効率的に検出し、修復手順を開始します。細胞には、非相同末端結合(NHEJ)と相同性指向修復(HDR)の2つの異なる修復メカニズムがあります。NHEJは、DNA二本鎖切断を迅速に修復し、細胞のアポトーシスを防ぐことができる最も一般的な修復経路です。ただし、DSBの近くに挿入と欠失(インデル)の小さな断片が残るため、エラーが発生しやすく、通常は読み取りフレームがオープンになり、遺伝子ノックアウトにつながる可能性があります。対照的に、相同修復は非常にまれなイベントです。DSBのコンテキストに相同な配列を有する修復テンプレートが存在することを条件として、細胞は時折、近くのテンプレートに従ってゲノム切断を修復するであろう。HDRの結果、DSBは正確に修復されます。特に、テンプレート内の相同配列間に付加配列がある場合、それらはHDRを介してゲノムに組み込まれ、このようにして、特定の遺伝子挿入を実現することができた¹³。

sgRNA構造とCas9タンパク質変異体の最適化と開発により、CRISPR/Cas9ベースの遺伝子編集システムは、ショウジョウバエメラノガスター、ネッタイシマカ、ボンビクスモリ、ヘリカバーパアルミゲラ、プルテラキシロステラ、イナゴの渡り鳥などの昆虫の研究にもうまく適用されています14,15,16,17,18 ^、19。著者らの知る限り、Cas9タンパク質とin vitro転写sgRNAからなるRNPはイナゴゲノム編集に使用されています^が20,21,22、CRISPR/Cas9リボヌクレアーゼを介した移動性イナゴのホモ接合変異体の構築のための体系的かつ詳細なプロトコルはまだ不足しています。

渡りバッタは、世界的に分布し、食料生産に大きな脅威をもたらす重要な農業害虫であり、小麦、トウモロコシ、米、キビなどのイネ科植物に特に有害です²³。ゲノム編集技術に基づく遺伝子機能解析は、渡りバッタの新たな標的と新たな戦略を提供する可能性があります。本研究では、標的部位の選択とsgRNAの設計、sgRNAのin vitro合成と検証、卵のマイクロインジェクションと培養、胚期における突然変異率の推定、変異体の検出、変異体の継代と保存など、CRISPR/Cas9システムを介して渡りバッタ遺伝子をノックアウトするための詳細な方法を提案します。このプロトコルは、バッタ遺伝子の大部分を操作するための基礎参照として使用でき、他の昆虫のゲノム編集に貴重な参照を提供できます。

1. ターゲット部位の選択とsgRNAの設計

1. NCBIおよびイナゴデータベース²⁴で文献調査および/または遺伝子のmRNAまたはコーディングDNA配列(CDS)の検索を通じて、目的の遺伝子について可能な限り多くの配列情報を収集します。
2. 関心のある遺伝子の配列をそのゲノムDNA配列と比較して、エクソン領域とイントロン領域を区別します。
3. 研究目的に応じて、対象地設計の候補地域を選定します。プライマーペアを設計して候補領域フラグメントを増幅し、PCR産物のシーケンシング解析によってその野生型配列を検証します。
   注:候補ターゲットリージョンの選択にはさまざまな戦略があります。例えば、ほとんどの遺伝子/タンパク質機能研究では、ゲノム編集(すなわち、遺伝子ノックアウト)後にタンパク質/RNA機能全体が失われるように、開始コドンに近いエクソン断片を候補領域として使用します。特定のドメインの関数解析では、ドメインの先頭(または両端)の候補領域を選択します。
4. E-CRISP Design²⁵ などのオンラインリソースを使用して、ターゲット候補地域の潜在的なターゲットサイトを検索します。
   1. 参照ゲノムのドロップダウンリストで「ショウジョウバエメラノガスターBDGP6」(またはその他の昆虫)を選択し、「入力はFASTA配列」を選択し、ターゲット領域の配列をテキストボックス(FASTA形式)に貼り付けます。
   2. 「培地」と「単一デザイン」で「sgRNA検索を開始」を押してアプリケーションを起動し、可能なターゲット部位を取得します。予測スコアに基づいて結果から1〜3個の潜在的なターゲットを選択し、それに応じて対応するsgRNAを設計します。
      注:CRISPR設計には、CRISPOR、CHOPCHOP、CRISPRdirect、ZiFiTなど、他にも多くのオンラインプラットフォームがあります( 材料表を参照)。それらのいくつかは、ゲノム配列データがデータベースにある種の特異性チェックの機能を持っています。ただし、イナゴのゲノム配列はオンラインWebサイトでは見つかりませんでした。イナゴのCRISPR設計には、複数のオンラインツールを使用することをお勧めします。包括的に、さまざまなWebサイトからの結果を考慮し、最高の特異性、最高の効率、および最小のミスマッチ率の原則に基づいて、結果からsgRNAを選択します(図1A、B)。

2. インビトロでのsgRNAの合成と検証

1. sgRNA合成キットを使用して、製造元のマニュアル(材料表)に従ってsgRNAを合成します。この手順には通常、DNAテンプレート増幅、 インビトロ 転写、およびsgRNA精製の3つのステップが含まれます²¹。合成したsgRNAをヌクレアーゼフリー水で希釈して保存濃度300 ng/μLにし、さらに使用します。
2. CRISPR/Cas9システムの in vitro 切断アッセイの基質として機能する標的遺伝子断片を増幅および精製します。製造元の指示に従って、次の手順を実行します。
3. 購入したCas9タンパク質をヌクレアーゼフリー水で300 ng/μLに希釈します。1 μLのsgRNA(300 ng/μL)および1 μLのCas9タンパク質(300 ng/μL)を200 ngの精製ターゲットフラグメントとともに切断バッファー中で37°Cで1時間インキュベートします(総容量10 μL; 表1を参照)。アガロースゲル電気泳動によるsgRNA誘導Cas9切断の効率を推定する(図1C)。以下のマイクロインジェクションに対して活性の高いsgRNAを選択します。
   注:アガロースゲル電気泳動の結果は、画像処理ソフトウェアを使用してグレースケール画像に変換でき、切断効率は、推測されたサイズのバンドのグレースケールに従って推定されます。

3.卵のマイクロインジェクションと培養

1. マイクロピペットプラーでガラス毛細血管を引っ張って注射針を準備します(材料表)。パラメーターを次のように設定します:加熱を588に、プルを90に、速度を60に、時間を40に設定します。注射針の先端をマイクログラインダーで粉砕します(材料表)。
   注意: 理想的な針先は開いていて鋭利です(図2A)。注射中に針が詰まったり、誤って折れたりすることがあるため、実験用に追加の針を準備することを強くお勧めします。
2. 1 μLのCas9タンパク質(300 ng/μL)と1 μLの検証済みsgRNA(300 ng/μL)を混合して、注射用のRNPを取得します。8 μLのRNaseフリー滅菌水を加えて、混合物の最終容量を10 μLにします。 溶液を完全に混合し、氷の上に置いておきます。
   注:Cas9タンパク質とsgRNAの最終濃度は、編集結果に応じて最適化することができます。調製したRNP溶液の繰り返し凍結融解を避け、すぐに使用することをお勧めします。
3. オスとメスの成虫を30°Cで16(明):8(暗)の日長で飼育し、十分な新鮮なコムギの苗を餌として供給します。これらのイナゴを毎日観察し、産卵ポット(湿った滅菌砂で満たされたプラスチック製の植木鉢またはカップ)を飼育ケージに入れて、イナゴが交尾したら産卵します。
   注:通常、飼育ケージ(40 cm x 40 cm x 40 cm)で飼育された100ペアの成虫バッタは、単一の遺伝子をノックアウトするための卵を生成するのに十分です。より多くの卵が必要な場合は、追加のイナゴペアを培養します。
4. 産卵ポットから産みたての卵のさやを回収し、卵の日焼けを約30分間待ちます。細かいブラシを使用して卵のさやから卵を水中でそっと隔離し、滅菌水で3回洗います。卵をペトリ皿に入れ、滅菌水を加えて湿らせます。
   注:新しく産まれた卵の日焼けは、突然変異体の効率を大幅に改善することができます²¹。
5. 調製したRNP溶液を注射針に充填し、マイクロマニピュレーターにロードします(材料表)。
   1. マイクロインジェクションパラメータを、射出圧力(π)の300hPa、射出時間(ti)の0.5秒、補償圧力(pc)の25hPaに設定します。
   2. ペダルを押して、注入された溶液の量を評価します。射出圧力と射出時間を調整して、射出量が約50〜100nLになるようにします。
      注意: 注射液を可能な限り連続的かつ制御可能にするために、針内の残留空気を排出します。針とマイクロマニピュレーターの接続はしっかりとする必要があります。
6. 滅菌卵を注射パッドに定期的に配置し(図2B、C)、顕微鏡のオブジェクトテーブルにパッドを置きます(図3A)。卵が観察されるまで顕微鏡の倍率を調整します。注射の先端が見えるまで顕微鏡下でマイクロ注射針を調整し、注入する卵の近くに配置します。
7. 適切な高さと30〜45度の角度で注射を開始します。卵のマイクロパイルの近くで先端を卵に注意深く挿入し(図3B)、ペダルを押して注射を行います。針をすばやく引っ込め、次の卵を注射するために注射パッドを動かします。
   注:マイクロインジェクション中の卵のわずかな膨張が観察されるべきです。ピンホールでの少量の細胞質漏出は許容されます。注入針を新しいものと交換するか、液体の流出が多すぎる場合は射出角度を調整します。
8. 注入した卵を培養皿(湿ったろ紙を入れたシャーレ)に移し、30°Cのインキュベーターに入れます。
   注:これらの注入された卵からニンフが孵化するまでに約13〜14日かかります(標的遺伝子の突然変異が胚の発生に影響を与えないことを条件として)(図3C)。特定の遺伝子をノックアウトするのに十分な孵化と閉鎖量を確保するために、少なくとも100個の卵を注入します。

4. 変異率推定と変異体のスクリーニング

1. 注射後毎日注射卵の発育を確認してください。注入した卵を最初の5日間は24時間ごとに新しい培養皿に移します。
2. 注射後^6日目( またはそれ以降)に、10個の卵をランダムに摘み取ってチューブに移し、グラインダーを使用して60 Hzで6分間2つの鋼球で卵を適切に粉砕します( 材料の表を参照)。破片を1 mLのPBSで再懸濁します。5 μLの混合物を45 μLの50 mM NaOHに移し、95°Cで5分間溶解します。5 μLの1 M Tris-HCl(pH=8.0)を溶解システムに加え、アルカリ溶解反応を終了します。
   注:最後の移植後の任意の日にアルカリ溶解のために卵を選ぶことができ、発生状況に応じて複数の卵を1つのサンプルとして使用できます(たとえば、5つの6日齢の胚を1つのサンプルとして使用し、2つの10日齢の胚を1つのサンプルとして使用できます)。アルカリ溶解法を使用して卵のゲノムDNAを取得することが不可能な場合があります。市販のゲノムDNA抽出キットは、卵からゲノムDNAを単離するための代替方法として使用できます。
3. 1 μLの溶解産物をPCRテンプレートとして取り、標的遺伝子断片を増幅し(表2 および 表3)、PCR産物をシーケンシングに送ります。シーケンシング結果を野生型配列と比較して、CRISPR/Cas9システムが in vivoで 標的遺伝子を切断したかどうかを事前に評価します(図4A)。インデルが胚期に検出されることを条件に、その後の発達のために残りの卵を許可します。
   注:このようにして、胚段階で突然変異率を事前に推定することができます。このステップでインデルが見つからない場合は、ターゲット遺伝子用の新しいsgRNAをいくつか準備し、ステップ2.1のノックアウトプロトコルを繰り返します。
4. 孵化したニンフを飼育ケージに移し、ステップ3.3の説明に従って培養します。ニンフが5齢期に発達したら、プラスチック製の培養カップ(1ニンフ/カップ)でそれらを分離します。
   注:ニンフが5齢に発達するのに通常約25〜35日かかり、最も明白な表現型は、翼芽が4番目または5番目の腹部に伸びることです。さらに、さらなる研究において、標的遺伝子と表現型との関係を予測するために、死んだニンフの表現型を記録することが推奨される。
5. 触角の長さ約2mmを解剖ハサミで切り取り、アルカリ溶解法を用いて溶解する(ステップ4.2)。上記のようにこれらのニンフの標的遺伝子断片配列を解析し(ステップ4.3)、_G0 変異体を同定する(図4B)。
   注:溶解のためにカットされたアンテナは少し長くなる可能性があり、アンテナを直接消化することができますが、アンテナを粉砕またはミンチすることは溶解に役立ちます。シーケンシング結果で標的部位の近くに複数のピークを持つ個体は、陽性変異体として識別され、その後の発生と交配が可能になります。

5. 変異株の確立と継代

1. G0変異体と野生型バッタを用いて交雑育種を行う(図4B)。オーシストを収集し、これらのオーシストを30°Cで別々にインキュベートします。 各オーシストに3〜6個の発育卵を使用して、手順4.2および4.3で説明されているように突然変異を検出します。その後の開発のために突然変異陽性オーシストを保持し、突然変異陰性オーシストを放棄する。
   注:胚期での突然変異率の推定は、G₁ 変異体のスクリーニングを大幅に加速することができます。通常、3〜6個の発育卵は、上記のようにPCR媒介ジェノタイピングのための1つのサンプルとして混合することができる。
2. 手順4.4の説明に従って、G₁ ニンフを後方にします。_G1 ヘテロ接合体を検出するためのステップ4.5に記載されるようにPCRベースのジェノタイピングを実行するために、アンテナの長さ約2mmを切り取る。製造元の指示に従ってTAクローニングを実行し( 材料表を参照)、それらの変異を特定します。同じ変異を有する_G1 ヘテロ接合体を用いてインクロスを行い、_G2 ニンフを得る。
   注:PCR産物のサンガーシーケンシングは、ヘテロ接合体を見つけるための情報しか提供できず、正確な変異を特定するための十分な情報を提供しません。したがって、PCR産物を用いたTAクローニングは、変異を明確に同定し、安定な変異株の樹立を促進するために必要である。
3. G₂ ニンフを5齢まで後押しします。ステップ5.2で説明されているPCRベースのジェノタイピングを使用して、さらなる研究と安定した継代に適したホモ接合体および/またはヘテロ接合体を特定します(図4B)。
   注:ホモ接合体とヘテロ接合体の混合を避けるように注意してください。各集団のホモ接合性および/またはヘテロ接合性を確認するために、すべての世代でPCRベースのジェノタイピングを実行することをお勧めします。このチェックに使用されるイナゴの数は、個体群のサイズによって異なります。さらに、イナゴの個体数は、インクロス戦略によって拡大することができます。

6.卵の凍結保存と蘇生

1. 凍結保存する卵を滅菌水で洗浄し、上記の培養皿で5〜6日間インキュベートします(ステップ3.8)。これらの卵を培養皿に集め、ろ紙の破片で覆います。培養皿全体をパラフィンフィルムで包みます。
2. 皿を25°Cで2日間保ち、その後さらに2日間比較的低い温度(13〜16°C)で保ちます。その後、皿を6°Cの冷蔵庫に移します。卵に湿った環境を提供するために、2週間ごとに水を追加します(図5A)。
   注:胚は、30°Cで5〜6日間発生した後、カタトレプシス段階にあると推測されています²⁶。勾配冷却は卵の凍結保存に役立ちます(表5)。
3. 凍結保存された卵を蘇生させるには、冷蔵庫からシャーレを取り出し、25°Cで2日間保管します。これらの卵をニンフが孵化するまで30°Cのインキュベーターに入れます(図5B)。
   注:凍結保存された卵を25°Cに入れてから、30°Cのインキュベーターに移す必要があります。胚は少なくとも5ヶ月間凍結保存することができますが、凍結保存のために孵化率と閉鎖率が低下する可能性があります(表5)。

このプロトコルには、Cas9タンパク質と in vitro で合成されたsgRNAからなるRNPを持つ移動性イナゴのホモ接合変異体を生成するための詳細な手順が含まれています。以下は、標的選択、sgRNA合成と検証(図1A)、採卵と注射、変異体スクリーニングと継代、凍結保存、ホモ接合卵の蘇生など、イナゴにおけるCRISPR/Cas9を介した標的遺伝子ノックアウトの代表的な結果です?...

イナゴは、人間の文明以来、農業にとって最も壊滅的な害虫の1つです²³。CRISPR/Cas9ベースのゲノム編集技術は、バッタの生物学的メカニズムに関するより良い知識と有望な害虫駆除戦略を提供するための強力なツールです。したがって、ホモ接合型ローカスト変異体のCRISPR/Cas9を介した構築の効率的で使いやすい方法を開発することは大きな利益です。いくつかの素晴らしい...

著者は、利益相反がないことを宣言します。

この研究は、中国国家自然科学財団(32070502、31601697、32072419および中国ポスドク科学基金会(2020M672205)の支援を受けました。