Construction de mutants homozygotes du criquet migrateur à l’aide de la technologie CRISPR/Cas9

Cette étude fournit une procédure systématiquement optimisée de construction à base de ribonucléase CRISPR/Cas9 de mutants homozygotes ainsi qu’une méthode détaillée de cryoconservation et de réanimation des œufs de criquets.

Le criquet migrateur, Locusta migratoria, est non seulement l’un des criquets pèlerins du monde qui a causé d’énormes pertes économiques aux êtres humains, mais aussi un modèle de recherche important pour la métamorphose des insectes. Le système CRISPR / Cas9 peut localiser avec précision un locus d’ADN spécifique et se fendre dans le site cible, introduisant efficacement des cassures double brin pour induire l’élimination du gène cible ou intégrer de nouveaux fragments de gènes dans le locus spécifique. L’édition du génome médiée par CRISPR/Cas9 est un outil puissant pour répondre aux questions rencontrées dans la recherche acridienne ainsi qu’une technologie prometteuse pour la lutte antiacridienne. Cette étude fournit un protocole systématique pour l’élimination du gène médiée par CRISPR/Cas9 avec le complexe de la protéine Cas9 et des ARN guides uniques (ARNsg) chez les criquets migrateurs. La sélection des sites cibles et la conception de l’ARNg sont décrites en détail, suivies de la synthèse in vitro et de la vérification des ARNg. Les procédures ultérieures comprennent la collecte des radeaux d’œufs et la séparation des œufs bronzés pour obtenir une micro-injection réussie avec un faible taux de mortalité, la culture d’œufs, l’estimation préliminaire du taux de mutation, la reproduction acridienne ainsi que la détection, la préservation et le passage des mutants pour assurer la stabilité de la population des criquets modifiés. Cette méthode peut être utilisée comme référence pour les applications d’édition de gènes basées sur CRISPR/Cas9 chez les criquets migrateurs ainsi que chez d’autres insectes.

Les technologies d’édition de gènes pourraient être utilisées pour introduire des insertions ou des délétions dans un locus génomique spécifique afin de modifier artificiellement le gène cible à dessein¹. Au cours des dernières années, la technologie CRISPR / Cas9 s’est développée rapidement et a un champ d’applications croissant dans divers domaines des sciences de la vie 2,3,4,5,6. Le système CRISPR / Cas9 a été découvert en 1987⁷ et largement trouvé chez les bactéries et les archées. D’autres recherches ont indiqué qu’il s’agissait d’un système immunitaire adaptatif procaryote qui dépend de la nucléase guidée par ARN Cas9 pour lutter contre les phages⁸. Le système CRISPR/Cas9 modifié artificiellement se compose principalement de deux composants, un seul ARN guide (ARNsg) et la protéine Cas9. Le sgRNA est constitué d’un ARN CRISPR (ARNcr) complémentaire à la séquence cible et d’un ARNcr transactivateur auxiliaire (ARNtrac), qui est relativement conservé. Lorsque le système CRISPR/Cas9 est activé, le sgRNA forme une ribonucléoprotéine (RNP) avec la protéine Cas9 et guide Cas9 vers son site cible via l’appariement de base des interactions ARN-ADN. Ensuite, l’ADN double brin peut être clivé par la protéine Cas9 et, par conséquent, la rupture double brin (DSB) émerge près du motif adjacent protospacer (PAM) du site cible 9,10,11,12. Pour atténuer les dommages causés par les DSB, les cellules activeraient des réponses complètes aux dommages à l’ADN pour détecter efficacement les dommages génomiques et lancer la procédure de réparation. Il existe deux mécanismes de réparation distincts dans la cellule : la jonction d’extrémité non homologue (NHEJ) et la réparation dirigée par homologie (HDR). NHEJ est la voie de réparation la plus courante qui peut réparer rapidement les cassures double brin de l’ADN et prévenir l’apoptose cellulaire. Cependant, il est sujet aux erreurs en laissant de petits fragments d’insertions et de délétions (indels) près des DSB, ce qui entraîne généralement un décalage de cadre de lecture ouvert et peut donc conduire à l’élimination des gènes. En revanche, la réparation homologue est un événement assez rare. À condition qu’il existe un modèle de réparation avec des séquences homologues au contexte du DSB, les cellules répareraient occasionnellement la rupture génomique selon le modèle voisin. Le résultat du HDR est que le DSB est réparé avec précision. En particulier, s’il y a une séquence supplémentaire entre les séquences homologues dans le modèle, elles seraient intégrées dans le génome par HDR, et de cette façon, les insertions de gènes spécifiques pourraient être réalisées¹³.

Avec l’optimisation et le développement des structures de l’ARNg et des variantes de la protéine Cas9, le système d’édition génétique basé sur CRISPR / Cas9 a également été appliqué avec succès dans la recherche sur les insectes, y compris, mais sans s’y limiter, Drosophila melanogaster, Aedes aegypti, Bombyx mori, Helicoverpa Armigera, Plutella xylostella et Locusta migratoria 14,15,16,17,18 ^,19. À la connaissance des auteurs, bien que des RNP constitués de la protéine Cas9 et d’ARNg transcrits in vitro aient été utilisés pour l’édition du génome du criquet^20,21,22, un protocole systématique et détaillé pour la construction médiée par la ribonucléase CRISPR / Cas9 de mutants homozygotes du criquet migrateur fait toujours défaut.

Le criquet migrateur est un ravageur agricole important qui a une distribution mondiale et constitue une menace importante pour la production alimentaire, étant particulièrement nocif pour les plantes graminées, telles que le blé, le maïs, le riz et le millet²³. L’analyse de la fonction des gènes basée sur les technologies d’édition du génome peut fournir de nouvelles cibles et de nouvelles stratégies pour la lutte contre les criquets migrateurs. Cette étude propose une méthode détaillée pour éliminer les gènes du criquet migrateur via le système CRISPR/Cas9, comprenant la sélection des sites cibles et la conception des ARNsg, la synthèse in vitro et la vérification des ARNg, la microinjection et la culture d’œufs, l’estimation du taux de mutation au stade embryonnaire, la détection des mutants ainsi que le passage et la préservation des mutants. Ce protocole pourrait être utilisé comme référence basale pour la manipulation de la grande majorité des gènes de criquets et peut fournir des références précieuses pour l’édition du génome d’autres insectes.

1. Sélection du site cible et conception de l’ARNg

1. Recueillir autant d’informations que possible sur les séquences du gène d’intérêt par la recherche documentaire et/ou la recherche de l’ARNm ou de la séquence d’ADN codant (CDS) du gène au NCBI et à la base de données sur les criquets²⁴.
2. Comparez la séquence du gène intéressé à sa séquence d’ADN génomique pour distinguer les régions de l’exon et de l’intron.
3. Sélectionnez une région candidate pour la conception du site cible en fonction de l’objectif de la recherche. Concevez des paires d’amorces pour amplifier le fragment de région candidate et vérifier sa séquence de type sauvage en séquençant l’analyse du produit PCR.
   NOTE: Il existe différentes stratégies pour la sélection de la région cible candidate. Par exemple, dans la plupart des recherches sur la fonction des gènes ou des protéines, utiliser le fragment d’exon près de son codon de départ comme région candidate pour s’assurer que toute la fonction de la protéine ou de l’ARN est perdue après l’édition du génome (c.-à-d. élimination du gène). Pour l’analyse fonctionnelle d’un domaine spécifique, sélectionnez la région candidate au début (ou aux deux extrémités) du domaine.
4. Utilisez des ressources en ligne telles que E-CRISP Design²⁵ pour rechercher des sites cibles potentiels dans la région cible candidate.
   1. Sélectionnez « Drosophila melanogaster BDGP6 » (ou tout autre insecte) dans la liste déroulante des génomes de référence et choisissez « L’entrée est la séquence FASTA » suivie de coller la séquence de la région cible dans la zone de texte (au format FASTA).
   2. Démarrez l’application en appuyant sur « Démarrer la recherche sgRNA » avec « medium » et « single design » pour obtenir les sites cibles possibles. Sélectionnez 1 à 3 cibles potentielles parmi les résultats en fonction de leurs scores prédits et concevez les sgRNA correspondants en conséquence.
      REMARQUE: Il existe de nombreuses autres plates-formes en ligne pour la conception CRISPR, telles que CRISPOR, CHOPCHOP, CRISPRdirect, ZiFiT, etc. (voir Tableau des matériaux). Certains d’entre eux ont la fonction de contrôle de spécificité pour les espèces dont les données de séquence génomique se trouvent dans leurs bases de données. Cependant, la séquence génomique des criquets n’a été trouvée sur aucun site Web en ligne. Il est préférable d’utiliser plus d’un outil en ligne pour la conception CRISPR chez les criquets. De manière exhaustive, examinez les résultats de différents sites Web et sélectionnez le sgRNA parmi les résultats sur le principe de la spécificité la plus élevée, de l’efficacité la plus élevée et du taux de discordance le plus faible (Figure 1A, B).

2. Synthèse et vérification de l’ARNg in vitro

1. Synthétiser l’ARNg à l’aide de kits de synthèse d’ARNg conformément au manuel du fabricant (Tableau des matériaux). Cette procédure comprend généralement trois étapes: amplification du modèle d’ADN, transcription in vitro et purification de l’ARNg²¹. Diluer l’ARNg synthétisé avec de l’eau sans nucléase jusqu’à une concentration de stockage de 300 ng/μL pour une utilisation ultérieure.
2. Amplifier et purifier le fragment de gène cible pour servir de substrat au test de clivage in vitro du système CRISPR/Cas9. Effectuez ces étapes en suivant les instructions du fabricant.
3. Diluer la protéine Cas9 achetée à 300 ng/μL avec de l’eau sans nucléase. Incuber 1 μL d’ARNg (300 ng/μL) et 1 μL de protéine Cas9 (300 ng/μL) avec 200 ng de fragment cible purifié dans le tampon de clivage à 37 °C pendant 1 h (10 μL de volume total; voir Tableau 1). Estimer l’efficacité du clivage Cas9 induit par l’ARNsg par électrophorèse sur gel d’agarose (Figure 1C). Sélectionnez les sgRNA à forte activité pour la micro-injection suivante.
   REMARQUE: Les résultats de l’électrophorèse sur gel d’agarose peuvent être convertis en images en niveaux de gris avec un logiciel de traitement d’image et l’efficacité du clivage est estimée en fonction des niveaux de gris des bandes de tailles spéculées.

3. Micro-injection et culture des œufs

1. Préparez les aiguilles d’injection en tirant les capillaires en verre avec un extracteur de micropipette (Table of Materials). Définissez les paramètres comme suit : Heat à 588, Pull à 90, Velocity à 60 et Time à 40. Broyer la pointe de l’aiguille d’injection avec une micro-meuleuse (Table des matériaux).
   REMARQUE : Les extrémités idéales des aiguilles sont ouvertes et à arêtes vives (figure 2A). Il est fortement recommandé de préparer des aiguilles supplémentaires pour les expériences car les aiguilles sont parfois bloquées ou accidentellement cassées pendant les injections.
2. Mélanger 1 μL de protéine Cas9 (300 ng/μL) avec 1 μL de l’ARNg vérifié (300 ng/μL) ensemble pour obtenir les RNP pour injection. Ajouter 8 μL d’eau stérile sans RNase pour porter le volume final du mélange à 10 μL. Bien mélanger la solution et la garder sur la glace.
   REMARQUE: Les concentrations finales de la protéine Cas9 et des ARNg peuvent être optimisées en fonction des résultats de l’édition. Évitez la congélation et la décongélation répétitives de la solution de RNP préparée et une utilisation immédiate est recommandée.
3. Élever les criquets adultes mâles et femelles ensemble à 30 °C avec une photopériode de 16 (clair):8 (foncé) et leur fournir suffisamment de plants de blé frais comme nourriture. Observez ces criquets tous les jours et placez un pot de ponte (un pot de fleurs en plastique ou une tasse remplie de sable stérile humide) dans la cage d’élevage pour la ponte une fois que les criquets se sont accouplés.
   NOTE: Habituellement, 100 couples de criquets adultes élevés dans une cage d’élevage (40 cm x 40 cm x 40 cm) suffisent pour générer des œufs pour éliminer un seul gène. Cultiver des paires de criquets supplémentaires si plus d’œufs sont nécessaires.
4. Ramassez les gousses fraîchement pondues dans le pot de ponte et attendez environ 30 minutes pour le tannage des œufs. Isolez délicatement les œufs des gousses dans de l’eau à l’aide d’une brosse fine et lavez-les trois fois à l’eau stérile. Gardez les œufs dans une boîte de Petri et ajoutez de l’eau stérile pour les garder humides.
   NOTE: Le tannage des œufs nouvellement pondus peut améliorer considérablement l’efficacité mutante²¹.
5. Remplissez une aiguille d’injection avec la solution de RNP préparée et chargez-la sur le micromanipulateur (Tableau des matériaux).
   1. Réglez les paramètres de micro-injection comme suit : 300 hPa de pression d’injection (pi), 0,5 s du temps d’injection (ti) et 25 hPa de la pression de compensation (pc).
   2. Appuyez sur la pédale pour évaluer le volume de la solution injectée. Ajustez la pression et le temps d’injection pour vous assurer que le volume d’injection est d’environ 50-100 nL.
      REMARQUE: Évacuez l’air résiduel dans l’aiguille pour rendre la solution d’injection continue et contrôlable autant que possible. La connexion de l’aiguille et du micromanipulateur doit être serrée.
6. Disposer régulièrement les œufs stériles sur le tampon d’injection (Figure 2B,C) et placer le tampon sur la table à objets du microscope (Figure 3A). Ajustez le grossissement du microscope jusqu’à ce que les œufs soient observés. Ajustez l’aiguille de micro-injection au microscope jusqu’à ce que l’embout d’injection puisse être vu et placez-le près de l’œuf à injecter.
7. Commencez l’injection à une hauteur appropriée et à un angle de 30-45 degrés. Insérez soigneusement l’embout dans l’œuf près des micropyles de l’œuf (Figure 3B) et appuyez sur la pédale pour effectuer l’injection. Rétractez rapidement l’aiguille et déplacez le tampon d’injection pour l’injection de l’œuf suivant.
   REMARQUE: Une légère expansion de l’œuf pendant la micro-injection doit être observée. Une petite quantité de fuite cytoplasmique au sténopé est acceptable. Remplacez l’aiguille d’injection par une nouvelle ou ajustez l’angle d’injection si l’écoulement du liquide est trop important.
8. Transférer les œufs injectés dans une boîte de culture (une boîte de Petri avec un morceau de papier filtre humide) et les placer dans un incubateur à 30 °C.
   NOTE: Il faudra environ 13-14 jours pour que les nymphes éclosent de ces œufs injectés (à condition que la mutation du gène cible n’affecte pas le développement des embryons) (Figure 3C). Injectez au moins 100 œufs pour assurer une quantité suffisante d’éclosion et d’éclosion pour éliminer un gène spécifique.

4. Estimation du taux de mutation et criblage des mutants

1. Vérifiez le développement des ovules injectés tous les jours après l’injection. Transférer les œufs injectés dans une nouvelle boîte de culture toutes les 24 heures au cours des 5 premiers jours.
2. Le 6^e jour (ou plus tard) après l’injection, cueillir et transférer au hasard 10 œufs dans un tube et broyer adéquatement les œufs avec deux billes d’acier à 60 Hz pendant 6 minutes à l’aide d’un broyeur (voir le tableau des matériaux). Remettez les débris en suspension avec 1 mL de PBS. Transvaser 5 μL du mélange dans 45 μL de NaOH 50 mM et lyser à 95 °C pendant 5 min. Ajouter 5 μL de 1 M Tris-HCl (pH = 8,0) dans le système de lyse pour mettre fin à la réaction de lyse alcaline.
   REMARQUE : Les ovules peuvent être prélevés pour la lyse alcaline n’importe quel jour après le dernier transfert et plusieurs ovules peuvent être utilisés comme un seul échantillon selon leur situation de développement (p. ex., cinq embryons âgés de 6 jours peuvent être utilisés comme un échantillon, et deux embryons de 10 jours peuvent être utilisés comme un échantillon). Parfois, il n’est pas possible d’obtenir l’ADN génomique des œufs en utilisant la méthode de lyse alcaline. Les kits commerciaux d’extraction d’ADN génomique peuvent être utilisés comme méthode alternative pour isoler l’ADN génomique des œufs.
3. Prendre 1 μL du produit de lyse comme modèle de PCR pour amplifier le fragment de gène cible (Tableau 2 et Tableau 3) et envoyer les produits PCR pour séquençage. Comparer les résultats du séquençage avec la séquence de type sauvage pour évaluer de manière préliminaire si le système CRISPR/Cas9 a clivé le gène cible in vivo (Figure 4A). Laisser le reste des œufs pour un développement ultérieur à condition que les indels soient détectés au stade embryonnaire.
   NOTE: De cette façon, le taux de mutation peut être estimé provisoirement au stade embryonnaire. Si aucun indel n’est trouvé à cette étape, préparez de nouveaux sgRNA pour le gène cible et répétez le protocole knock-out de l’étape 2.1.
4. Transférer les nymphes écloses dans une cage d’élevage et les cultiver comme décrit à l’étape 3.3. Lorsque les nymphes se sont développées au stade du cinquième stade, séparez-les avec des coupes de culture en plastique (1 nymphe / tasse).
   NOTE: Il faut généralement environ 25 à 35 jours pour que les nymphes se développent jusqu’à leur cinquième stade et le phénotype le plus évident est que les bourgeons alaires s’étendent jusqu’aux quatrième ou cinquième segments abdominaux. De plus, il est recommandé d’enregistrer les phénotypes des nymphes mortes pour prédire la relation entre le gène cible et les phénotypes dans des recherches ultérieures.
5. Couper environ 2 mm de longueur des antennes avec des ciseaux à dissection et lyser en utilisant la méthode de lyse alcaline (étape 4.2). Analyser la séquence de fragments de gènes cibles de ces nymphes comme décrit ci-dessus (étape 4.3) pour identifier les mutants G₀ (Figure 4B).
   REMARQUE: Les antennes coupées pour la lyse peuvent être un peu plus longues et le meulage ou le hachage des antennes est utile pour la lyse, bien que les antennes puissent être directement digérées. Les individus présentant plusieurs pics près du site cible dans le résultat du séquençage sont identifiés comme des mutants positifs et autorisés pour le développement ultérieur et l’accouplement.

5. Etablissement et passage de lignées mutantes

1. Effectuer des croisements à l’aide des mutants G₀ et des criquets de type sauvage (Figure 4B). Prélever les oocystes et les incuber séparément à 30 °C. Utilisez 3 à 6 œufs développés dans chaque oocyste pour détecter les mutations décrites aux étapes 4.2 et 4.3. Conservez les oocystes positifs pour le développement ultérieur et abandonnez les oocystes mutation-négative.
   REMARQUE : L’estimation du taux de mutation au stade embryonnaire peut grandement accélérer le dépistage des mutants G₁ . Habituellement, 3 à 6 œufs développés peuvent être mélangés en un seul échantillon pour le génotypage médié par PCR comme décrit ci-dessus.
2. Élever les nymphes G₁ comme décrit à l’étape 4.4. Couper environ 2 mm de longueur des antennes pour effectuer le génotypage basé sur la PCR comme décrit à l’étape 4.5 pour détecter les hétérozygotes G₁ . Effectuer le clonage TA conformément aux instructions du fabricant (voir le tableau des matériaux) pour identifier leurs mutations. Réaliser des in-cross en utilisant des hétérozygotes G₁ présentant les mêmes mutations pour obtenir des nymphes_G2 .
   NOTE: Le séquençage de Sanger des produits PCR ne peut fournir que des informations pour découvrir les hétérozygotes, mais pas assez d’informations pour identifier les mutations exactes. Ainsi, le clonage TA à l’aide des produits PCR est nécessaire pour identifier clairement les mutations et peut favoriser l’établissement de lignées mutantes stables.
3. Reculez les nymphes G₂ jusqu’à leur cinquième étoile. Utiliser le génotypage basé sur la PCR décrit à l’étape 5.2 pour identifier les homozygotes et/ou hétérozygotes qui conviennent à des recherches plus approfondies et à une passagère stable (Figure 4B).
   REMARQUE: Faites attention à éviter de mélanger les homozygotes et les hétérozygotes. Il est recommandé d’effectuer un génotypage basé sur la PCR à chaque génération pour confirmer l’homozygotie et/ou l’hétérozygotie de chaque population. Le nombre de criquets utilisés pour ce contrôle dépend de la taille de la population. De plus, la population de criquets peut être élargie par la stratégie in-cross.

6. Cryoconservation et réanimation des ovules

1. Lavez les œufs à cryoconserver avec de l’eau stérile et incuberez-les dans une boîte de culture comme décrit ci-dessus (étape 3.8) pendant 5-6 jours. Rassemblez ces œufs dans le plat de culture et recouvrez-les de fragments de papier filtre. Enveloppez tout le plat de culture avec un film de paraffine.
2. Gardez le plat à 25 °C pendant 2 jours, suivis de 2 autres jours à une température relativement plus basse (13-16 °C). Ensuite, transférer le plat dans un réfrigérateur à 6 °C. Ajoutez-y de l’eau toutes les 2 semaines pour fournir un environnement humide aux œufs (figure 5A).
   NOTE: Les embryons sont supposés être au stade de katatrepsis après avoir été développés pendant 5-6 jours à 30 °^{C 26}. Le refroidissement par gradient est utile pour la cryoconservation des œufs (tableau 5).
3. Pour ressusciter les œufs cryoconservés, sortez la boîte de Petri du réfrigérateur et conservez-la à 25 °C pendant 2 jours. Placer ces œufs dans un incubateur à 30 °C jusqu’à l’éclosion des nymphes (Figure 5B).
   NOTE: Il est nécessaire de mettre les œufs cryoconservés à 25 ° C avant de les transférer dans un incubateur à 30 ° C. Les embryons peuvent être cryoconservés pendant au moins cinq mois, bien que le taux d’éclosion et le taux d’éclosion puissent diminuer en raison de la cryoconservation (tableau 5).

Ce protocole contient les étapes détaillées pour générer des mutants homozygotes des criquets migrateurs avec le RNP constitué de la protéine Cas9 et de l’ARNg synthétisé in vitro . Voici quelques résultats représentatifs de l’élimination du gène cible médiée par CRISPR/Cas9 chez les criquets, y compris la sélection de la cible, la synthèse et la vérification de l’ARNg (Figure 1A), la collecte et l’injection d’ovules, le dépistage et le passage des mutan...

Les criquets ont été parmi les ravageurs les plus dévastateurs pour l’agriculture depuis la civilisation des êtres humains²³. La technologie d’édition du génome basée sur CRISPR/Cas9 est un outil puissant pour fournir une meilleure connaissance des mécanismes biologiques chez les criquets ainsi qu’une stratégie prometteuse de lutte antiparasitaire. Ainsi, il est très utile de développer une méthode efficace et facile à utiliser de construction médiée par CRISPR / Cas9 de mutan...

Les auteurs déclarent n’avoir aucun conflit d’intérêts.

Ce travail a été soutenu par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (32070502, 31601697, 32072419 et la Fondation chinoise des sciences postdoctorales (2020M672205).