Esta pesquisa tem como objetivo projetar e fornecer editores epigenômicos em células humanas. Fazemos isso fundindo efetores de cromatina com dCas9 para modulação gênica direcionada sem introduzir quebras tóxicas de DNA. Os desafios giram em torno da entrega eficiente de editores de epigenoma nas células e da garantia da especificidade precisa do alvo.
Além disso, alcançar a repressão gênica estável ou transitória continua difícil. Este protocolo evita quaisquer mecanismos de clivagem, reduzindo a toxicidade e a instabilidade genômica. Ele descreve dois métodos de entrega para modulação controlada da expressão gênica sem alterações permanentes na sequência de DNA.
Esses métodos podem ser aplicados para testar diferentes fusões com dCas9 e para estudar a biologia básica da cromatina. Os editores de epigenoma atuais podem ser usados para telas de todo o genoma e têm potencial para aplicações terapêuticas. Para começar, mantenha as células K-562 em um frasco com meio RPMI suplementado com 10% de FBS e penicilina estreptomicina glutamina.
No dia da nucleofecção, descongele o mRNA CRISPRoff em um tubo de microcentrífuga estéril sem RNAse e subtraia suavemente o tubo. Use dois microgramas de mRNA por 2,0 vezes 10 elevado a cinco células em cada poço de um tubo de tira de PCR colocado no gelo. Preparar a solução de nucleofecção de acordo com as instruções do fabricante e deixá-la aquecer até à temperatura ambiente durante 15 minutos antes da nucleofecção.
Colha e conte células K-562 usando um contador de células automatizado com coloração viva/morta de azul tripano. Para nucleofecção em uma cubeta de tira, alíquota aproximadamente duas vezes 10 elevado à potência de cinco células por amostra em um tubo de microcentrífuga estéril. Centrifugar as células a 500 G durante cinco minutos à temperatura ambiente.
Descarte o sobrenadante. Adicionar PBS à temperatura ambiente ao sedimento da célula e centrifugar novamente a 500 G durante cinco minutos. Descarte o sobrenadante.
Ressuspenda as células na quantidade apropriada de solução de nucleofectora. Adicione o volume calculado de solução celular a dois microgramas de solução CRISPRoff. Transfira a célula e a solução de mRNA para uma cubeta, garantindo que não se formem bolhas, pois isso pode comprometer a eficiência da nucleofecção.
Bata suavemente na nucleocuvette para assentar as células na parte inferior. Em seguida, nucleofecte as células usando o sistema 4D-Nucleofector com o código de pulso apropriado. O código de pulso pode precisar ser otimizado para diferentes tipos de células.
Consulte o fabricante se for necessária uma otimização adicional. Após a nucleofecção, adicione 80 microlitros de meio RPMI a cada poço usado da nucleocuvette. Transfira a suspensão celular para um poço de uma placa de 24 poços contendo 400 microlitros de meio RPMI pré-aquecido.
Carregue todos os arquivos padrão de citometria de fluxo, ou FSC, no FlowJo arrastando e soltando-os em uma nova planilha. Clique em todas as amostras para começar a fazer portões. Abra uma amostra de controle clicando duas vezes no arquivo correspondente.
Crie uma porta para células ativas em um gráfico FSC-A versus SSC-A usando a ferramenta de polígono. Uma guia de células ativas agora deve aparecer abaixo do nome da amostra na lista de todas as amostras. Clique com o botão direito do mouse neste portão e selecione copiar análise para agrupar para aplicar este portão a todas as amostras.
Clique duas vezes no portão de células vivas para selecionar apenas células vivas. Altere os eixos para FSC-H versus FSC-A. Desenhe um polígono para portar apenas células únicas.
Para bloquear as células que expressam guia, clique duas vezes no portão de célula única para selecionar apenas células individuais. Altere os eixos para FSC-A versus PE-CF594-A. Desenhe uma porta para células de expressão de guia usando a ferramenta de polígono.
Clique duas vezes no último portão de configuração, células individuais ou células de expressão guia. Se estiver realizando uma transfecção de plasmídeo em que o editor de epigenoma codifica uma proteína fluorescente azul, ou fusão BFP, crie uma porta para células positivas para BFP para amostras do segundo dia. Crie uma porta para a expressão do repórter plotando BB515-A em relação ao FSC-A para identificar e bloquear células GFP negativas.
Em seguida, aplique esta porta a todas as amostras. Depois de concluir a configuração do gating, clique no editor de tabelas no painel superior. Arraste populações para análise, como células BFP positivas e GFP negativas.
No painel do editor de tabelas, clique em criar tabela e copie os dados antes de colá-los em uma planilha para cálculos de normalização. Agora, subtraia o número de células repórter negativas, como GFP negativa, na amostra de controle de todas as outras amostras. Isso corrige o silenciamento de fundo do repórter.
Se estiver realizando uma transfecção, divida cada valor pela porcentagem de células positivas para BFP medidas no segundo dia para normalizar todos os valores para a porcentagem de células positivas para BFP e, em seguida, multiplique por 100. Isso produz o valor normalizado da eficiência de transfecção das células editadas. Plote os dados para criar gráficos de linha que representem as mudanças no curso de tempo de edição do epigenoma.
Para todos os experimentos de edição de epigenoma, recomenda-se um controle de guia sem direcionamento para confirmar que as alterações nos loci alvo resultam da edição do epigenoma, em vez de superexpressão ou ligação inespecífica do editor de epigenoma. É importante considerar o método de entrega do editor de epigenoma. A transfecção de DNA de plasmídeo ou nucleofecção de mRNA pode ser preferida devido ao contexto experimental.
A consideração do tipo de célula, cronograma experimental, leitura de entrega e eficácia de entrega pode afetar o método de entrega preferido. Células que expressam altos níveis de BFP dois dias após a transfecção indicam transfecção bem-sucedida com o editor de epigenoma. Tanto o CRISPRoff quanto o CRISPRi mostram o pico de silenciamento do gene no quinto dia após a transfecção.
Em experimentos de nucleofecção de mRNA, um forte silenciamento gênico é observado no terceiro dia pós-nucleofecção com CRISPRoff.
