Esta investigación tiene como objetivo diseñar y entregar editores epigenómicos en células humanas. Hacemos esto fusionando efectores de cromatina con dCas9 para la modulación génica dirigida sin introducir roturas tóxicas en el ADN. Los desafíos giran en torno a la entrega eficiente de editores de epigenoma en las células y garantizar una especificidad precisa del objetivo.
Además, sigue siendo difícil lograr una represión génica estable o transitoria. Este protocolo evita cualquier mecanismo de escisión, reduciendo la toxicidad y la inestabilidad genómica. Describe dos métodos de administración para la modulación controlada de la expresión génica sin alteraciones permanentes de la secuencia de ADN.
Estos métodos se pueden aplicar para probar diferentes fusiones con dCas9 y para estudiar la biología básica de la cromatina. Los editores de epigenomas actuales se pueden utilizar para cribados de todo el genoma y tienen el potencial de aplicaciones terapéuticas. Para empezar, mantenga las células K-562 en un matraz con medios RPMI suplementados con FBS al 10% y penicilina estreptomicina glutamina.
El día de la nucleofección, descongele el ARNm de CRISPRoff en un tubo de microcentrífuga estéril sin ARNasa y haga un vórtice suave del tubo. Use dos microgramos de ARNm por 2.0 veces 10 a la potencia de cinco células en cada pocillo de un tubo de tira de PCR colocado en hielo. Prepare la solución de nucleofección de acuerdo con las instrucciones del fabricante y deje que se caliente a temperatura ambiente durante 15 minutos antes de la nucleofectuación.
Coseche y cuente las células K-562 utilizando un contador de células automatizado con tinción viva/muerta con azul de tripán. Para la nucleofección en una cubeta de tiras, alícuota aproximadamente dos veces 10 elevado a la potencia de cinco células por muestra en un tubo de microcentrífuga estéril. Centrifugar las células a 500 G durante cinco minutos a temperatura ambiente.
Deseche el sobrenadante. Añada PBS a temperatura ambiente al pellet de la célula y vuelva a centrifugar a 500 G durante cinco minutos. Deseche el sobrenadante.
Vuelva a suspender las células en la cantidad adecuada de solución nucleofectora. Agregue el volumen calculado de solución celular a dos microgramos de solución CRISPRoff. Transfiera la célula y la solución de ARNm a una cubeta, asegurándose de que no se formen burbujas, ya que esto puede comprometer la eficiencia de la nucleofección.
Golpee suavemente el Nucleocuvette para asentar las células en la parte inferior. A continuación, nucleofecte las células utilizando el sistema 4D-Nucleofector con el código de pulso adecuado. Es posible que sea necesario optimizar el código de pulso para diferentes tipos de celdas.
Consulte con el fabricante si se necesita una optimización adicional. Después de la nucleofección, agregue 80 microlitros de medio RPMI a cada pocillo utilizado de la Nucleocuvette. Transfiera la suspensión de la celda a un pocillo de una placa de 24 pocillos que contenga 400 microlitros de medios RPMI precalentados.
Cargue todos los archivos de citometría de flujo, estándar o FSC, en FlowJo arrastrándolos y soltándolos en una nueva hoja de trabajo. Haga clic en todas las muestras para comenzar a hacer puertas. Abra una muestra de control haciendo doble clic en el archivo correspondiente.
Cree una puerta para celdas vivas en un gráfico FSC-A frente a SSC-A utilizando la herramienta polígono. Ahora debería aparecer una pestaña de células vivas debajo del nombre de la muestra en la lista de todas las muestras. Haga clic con el botón derecho en esta puerta y seleccione copiar análisis en grupo para aplicar esta puerta a todas las muestras.
Haga doble clic en la puerta de células vivas para seleccionar solo células vivas. Cambie los ejes a FSC-H frente a FSC-A. Dibuje un polígono para la puerta solo para celdas individuales.
Para activar las celdas que expresan la guía, haga doble clic en la puerta de una sola celda para seleccionar solo celdas individuales. Cambie los ejes a FSC-A frente a PE-CF594-A. Dibuje una puerta para las celdas que expresan la guía con la herramienta Polígono.
Haga doble clic en la última puerta de configuración, ya sea celdas individuales o celdas que expresan guía. Si realiza una transfección de plásmidos en la que el editor del epigenoma codifica una proteína fluorescente azul, o fusión de BFP, cree una puerta para las células positivas para BFP para las muestras del segundo día. Cree una puerta para la expresión reportera trazando BB515-A contra FSC-A para identificar y controlar las células negativas GFP.
A continuación, aplique esta puerta a todas las muestras. Después de completar la configuración de la compuerta, haga clic en editor de tablas en el panel superior. Arrastre las poblaciones para el análisis, como las células BFP positivas y las células GFP negativas.
En el panel del editor de tablas, haga clic en crear tabla y copie los datos antes de pegarlos en una hoja de cálculo para los cálculos de normalización. Ahora, reste el número de celdas reporteras negativas, como GFP negativas, en la muestra de control de todas las demás muestras. Esto corrige el silenciamiento de fondo del reportero.
Si realiza una transfección, divida cada valor por el porcentaje de células positivas para BFP medido el segundo día para normalizar todos los valores al porcentaje de células positivas para BFP y, a continuación, multiplíquelo por 100. Esto produce el valor normalizado de la eficiencia de transfección de las celdas editadas. Traza los datos para crear gráficos de líneas que representen los cambios a lo largo del curso del tiempo de edición del epigenoma.
Para todos los experimentos de edición del epigenoma, se recomienda un control guía no dirigido para confirmar que los cambios en los loci objetivo son el resultado de la edición del epigenoma en lugar de la sobreexpresión o la unión inespecífica del editor del epigenoma. Es importante tener en cuenta el método de entrega del editor de epigenoma. Dado el contexto experimental, se puede preferir la transfección de ADN plasmídico o la nucleofección de ARNm.
La consideración del tipo de célula, el cronograma experimental, la lectura de la entrega y la eficacia de la administración pueden afectar el método de administración preferido. Las células que expresan altos niveles de BFP dos días después de la transfección indican una transfección exitosa con el editor del epigenoma. Tanto CRISPRoff como CRISPRi muestran un silenciamiento máximo del gen en el quinto día después de la transfección.
En los experimentos de nucleofección de ARNm, se observa un fuerte silenciamiento génico al tercer día después de la nucleofección con CRISPRoff.
