Diese Forschung zielt darauf ab, epigenomische Editoren zu entwerfen und in menschliche Zellen zu bringen. Wir tun dies, indem wir Chromatineffektoren mit dCas9 fusionieren, um eine gezielte Genmodulation zu erreichen, ohne toxische DNA-Brüche einzuführen. Die Herausforderungen drehen sich um die effiziente Verabreichung von Epigenom-Editoren in Zellen und die Sicherstellung einer präzisen Zielspezifität.
Darüber hinaus ist es nach wie vor schwierig, eine stabile oder vorübergehende Genrepression zu erreichen. Dieses Protokoll vermeidet jegliche Spaltmechanismen und reduziert die Toxizität und genomische Instabilität. Es werden zwei Verabreichungsmethoden zur kontrollierten Genexpressionsmodulation ohne dauerhafte Veränderungen der DNA-Sequenz beschrieben.
Diese Methoden können angewendet werden, um verschiedene Fusionen mit dCas9 zu testen und grundlegende Chromatinbiologie zu untersuchen. Aktuelle Epigenom-Editoren können für genomweite Screenings verwendet werden und haben das Potenzial für therapeutische Anwendungen. Zu Beginn werden K-562-Zellen in einem Kolben mit RPMI-Medien aufbewahrt, die mit 10 % FBS und Penicillin-Streptomycin-Glutamin ergänzt sind.
Tauen Sie die CRISPRoff-mRNA am Tag der Nukleofektion in einem sterilen RNAse-freien Mikrozentrifugenröhrchen auf und wirbeln Sie das Röhrchen vorsichtig vor. Verwenden Sie zwei Mikrogramm mRNA pro 2,0 mal 10 hoch fünf Zellen in jeder Vertiefung eines PCR-Streifenröhrchens, das auf Eis gestellt wird. Bereiten Sie die Nukleofektionslösung gemäß den Anweisungen des Herstellers vor und lassen Sie sie vor der Nukleofektion 15 Minuten lang auf Raumtemperatur erwärmen.
Ernten und zählen Sie K-562-Zellen mit einem automatisierten Zellzähler mit Trypanblau-Lebend-/Totfärbung. Für die Nukleofektion in einer Streifenküvette aliquotiert man etwa zweimal 10 hoch fünf Zellen pro Probe in ein steriles Mikrozentrifugenröhrchen. Die Zellen werden bei 500 g fünf Minuten lang bei Raumtemperatur zentrifugiert.
Entsorgen Sie den Überstand. Geben Sie bei Raumtemperatur PBS in das Zellpellet und zentrifugieren Sie erneut bei 500 g für fünf Minuten. Entsorgen Sie den Überstand.
Resuspendieren Sie die Zellen in der entsprechenden Menge Nukleofektorlösung. Addieren Sie das berechnete Volumen der Zelllösung zu zwei Mikrogramm CRISPRoff-Lösung. Übertragen Sie die Zell- und mRNA-Lösung in eine Küvette und stellen Sie sicher, dass sich keine Blasen bilden, da dies die Nukleofektionseffizienz beeinträchtigen kann.
Klopfen Sie vorsichtig auf die Nukleocuvette, um die Zellen am Boden anzusiedeln. Anschließend werden die Zellen mit dem 4D-Nucleofector-System mit dem entsprechenden Pulscode nukleofektiert. Der Pulscode muss möglicherweise für verschiedene Zelltypen optimiert werden.
Wenden Sie sich an den Hersteller, wenn eine zusätzliche Optimierung erforderlich ist. Geben Sie nach der Nukleofektion 80 Mikroliter RPMI-Medium in jede verwendete Vertiefung der Nucleocuvette. Übertragen Sie die Zellsuspension in eine Vertiefung einer 24-Well-Platte mit 400 Mikrolitern vorgewärmtem RPMI-Medium.
Erstellen Sie mit dem Werkzeug Polygon ein Tor für lebende Zellen in einem Diagramm FSC-A vs. SSC-A. In der Liste aller Beispiele sollte nun unter dem Namen der Stichprobe eine Registerkarte mit aktiven Zellen angezeigt werden. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf dieses Gate und wählen Sie Analyse in Gruppe kopieren, um dieses Gate auf alle Proben anzuwenden.
Doppelklicken Sie auf das Gate für lebende Zellen, um nur lebende Zellen auszuwählen. Ändern Sie die Achsen in FSC-H und nicht in FSC-A. Zeichnen Sie ein Polygon, das nur für einzelne Zellen markiert werden soll.
Um ein Gate für Hilfslinien zu erstellen, die Zellen ausdrücken, doppelklicken Sie auf das Einzelzellen-Gate, um nur einzelne Zellen auszuwählen. Ändern Sie die Achsen in FSC-A statt PE-CF594-A. Zeichnen Sie mit dem Polygonwerkzeug ein Tor zum Ausdrücken von Zellen.
Doppelklicken Sie auf das letzte Setup-Gate, entweder einzelne Zellen oder Hilfslinien-ausdrückende Zellen. Wenn Sie eine Plasmidtransfektion durchführen, bei der der Epigenom-Editor für ein blau fluoreszierendes Protein kodiert, oder für eine BFP-Fusion, erstellen Sie ein Gate für BFP-positive Zellen für Proben am zweiten Tag. Erstellen Sie ein Gate für die Reporterexpression, indem Sie BB515-A gegen FSC-A plotten, um GFP-negative Zellen zu identifizieren und zu gaten.
Wenden Sie dann dieses Gate auf alle Samples an. Nachdem Sie die Gating-Einrichtung abgeschlossen haben, klicken Sie im oberen Bereich auf den Tabelleneditor. Drag-Populationen für die Analyse, z. B. BFP-positive und GFP-negative Zellen.
Klicken Sie im Tabelleneditor-Bereich auf Tabelle erstellen und kopieren Sie die Daten, bevor Sie sie für Normalisierungsberechnungen in eine Tabelle einfügen. Subtrahieren Sie nun die Anzahl der negativen Reporterzellen, wie z. B. GFP-negativ, in der Kontrollstichprobe von allen anderen Proben. Dadurch wird die Hintergrundstummschaltung des Reporters korrigiert.
Wenn Sie eine Transfektion durchführen, dividieren Sie jeden Wert durch den Prozentsatz der BFP-positiven Zellen, der am zweiten Tag gemessen wurde, um alle Werte auf den Prozentsatz der BFP-positiven Zellen zu normalisieren, und multiplizieren Sie ihn dann mit 100. Dies ergibt den normierten Wert der Transfektionseffizienz der editierten Zellen. Plotten Sie die Daten, um Liniendiagramme zu erstellen, die Änderungen im gesamten Zeitverlauf der Epigenombearbeitung darstellen.
Für alle Epigenom-Editing-Experimente wird eine Non-Targeting-Guide-Kontrolle empfohlen, um zu bestätigen, dass Veränderungen an den Zielloci eher auf Epigenom-Editing als auf Überexpression oder unspezifische Bindung des Epigenom-Editors zurückzuführen sind. Es ist wichtig, die Verabreichungsmethode des Epigenom-Editors zu berücksichtigen. Die Plasmid-DNA-Transfektion oder die mRNA-Nukleofektion kann unter Berücksichtigung des experimentellen Kontextes bevorzugt werden.
Die Berücksichtigung des Zelltyps, des experimentellen Zeitplans, der Verabreichungsrate und der Verabreichungswirksamkeit kann sich auf die bevorzugte Verabreichungsmethode auswirken. Zellen, die zwei Tage nach der Transfektion hohe BFP-Spiegel exprimieren, weisen auf eine erfolgreiche Transfektion mit dem Epigenom-Editor hin. Sowohl CRISPRoff als auch CRISPRi zeigen ein Peak-Silencing des Gens am fünften Tag nach der Transfektion.
In mRNA-Nukleofektionsexperimenten wird ein starkes Gen-Silencing am dritten Tag nach der Nukleofektion mit CRISPRoff beobachtet.
