O protocolo de transfecção baseado em NanoDispenser desenvolvido para descrever neste vídeo representa o primeiro método de transfecção de alto rendimento, que permite que até mesmo iniciantes no campo sejam bem sucedidos. Isso é fácil na técnica de alta produtividade permite a transfecção de células com 384 condições independentes. A partir de agora, o método é de baixo custo devido ao nano volume de reagente necessário.
Para definir os melhores parâmetros de transfecção para todo o tipo de célula, sugerimos manter a concentração de DNA de origem constante, e usando quantidades variadas de DNA transfectado, reagente de transfecção e número de células. Para dispensar a suspensão celular de 40 microliter, monte um de 10 microliter no dispositivo manipulador líquido peristáltico e prepare um programa apropriado. Primeiro, ajuste o parâmetro da taxa de fluxo para baixo para dispensar as células com uma baixa velocidade para evitar promover danos potenciais às células por puro estresse e alto impacto na parte inferior dos poços.
Em seguida, ajuste a altura de dispensação para 11,43 milímetros. A altura deve ser alta o suficiente para diminuir o impacto celular na parte inferior dos poços durante o processo de dispensação, mas baixa o suficiente para evitar a retenção das gotículas na cabeça de distribuição. Em seguida, ajuste a altura clara da placa para 16 milímetros para permitir o deslocamento livre da cabeça de distribuição sobre a placa após dispensar cada linha.
Controle visualmente as configurações adequadas da altura da cabeça do manipulador de líquido peristáltico. Certifique-se de que não há gotas retidas nas pontas de distribuição durante a dispensação. Verifique também se a cabeça está alta o suficiente para permitir o deslocamento da cabeça após a dispensa de cada linha.
Para gerar picklists para conduzir a dispensação de ADE, uma macro de planilha amigável foi desenvolvida para gerenciar quantidades de DNA e misturar até quatro plasmídeos em um formato de placa de poço 384. Os volumes ideais são pré-preenchidos em algumas células da planilha, mas podem ser alterados. Nos campos cor-de-rosa, o reagente de transfecção, ou valor da mistura TR, é definido para 500 nanoliters.
O valor mínimo de volume nos poços de placa de origem é definido para quatro microliters, e o volume máximo nos poços de placa de origem para 11,25 microliters. Digite 100 nanogramas por microliter dna concentrações iniciais nos campos azuis correspondentes ao DNA subjacente. Em seguida, insira a quantidade de DNA desejada nos campos cinza e verde correspondente aos 384 poços da placa.
Digite os valores e nomes plasmídeos e certifique-se de que a mesma ortografia seja usada se o mesmo plasmídeo tiver que ser transfeinado em vários poços. Clique em gerar picklists para verificar os valores inseridos e, se solicitado, corrija as células cheias de laranja indicando erros ou volumes que não podem ser manipulados pelo NanoDispenser. Se nenhum for detectado, a macro gerará o guia de dispensação de poços 384, o arquivo picklist de DNA e o arquivo picklist TR a partir de dados coletados nas folhas correspondentes.
Imprima o modelo da folha da placa de origem para visualizar os poços a serem preenchidos antes de dispensar. Nomes plasmídeos e volumes mínimos de preenchimento são indicados. Os volumes da mistura de reagentes transfeccionados que serão preenchidos nos seguintes poços, são indicados como TR e destacados em verde.
Para preparar a placa de origem do DNA, diluir o plasmídeo de DNA armazenado para 100 nanogramas por microliter usando água destilada. Agora, calibrar a grade do poço 384 para as dimensões da placa. Abra o aplicativo 384 Well Pipetting Guide em um tablet.
Coloque o local de origem na grade na tela inferior. No menu de calibração superior esquerdo, clique em mais ou menos para melhorar ou reduzir o tamanho da grade e dos poços, a fim de ajustar os poços verdes aos quatro poços de canto da placa. Usando fita dupla face, monte o adaptador de placa impresso em 3D na tela para evitar movimentos da placa de origem durante a dispensação.
Se necessário, mova a grade calibrada usando as setas de rotação e para cima, para baixo, para a direita, para a esquerda para ajustar a grade à posição da placa. Uma vez que a grade e os tamanhos dos poços estejam devidamente calibrados e localizados, marque a caixa de calibração de bloqueio. Clique no arquivo e abra o Guia 384-Wells-Pipetting.
arquivo csv. Siga as instruções de tela para dispensar manualmente o volume indicado de plasmídeo na concentração especificada no poço branco destacado que corresponde ao destino adequado da placa esperada. Use menos ou mais setas para voltar ou mais no processo de distribuição de DNA.
Pare de dispensar ao atingir a primeira solução de reagente de transfecção para carregar. Uma vez que as dispensas de DNA estejam terminadas, remova a placa de origem do adaptador. Se várias placas de origem forem preenchidas, coloque uma nova placa de origem no adaptador e siga as instruções de dispensação.
Centrifugar as placas de origem preenchidas com DNA para garantir o nivelamento líquido adequado e remover bolhas que levem à imprecisão nas transferências de base ADE. Agora, execute uma pesquisa para controlar os volumes manualmente dispensados. No PC NanoDispenser, execute o programa NanoDispenser.
Vá para a guia de diagnóstico, marque a caixa de saída da placa de origem, carregue a placa de origem no suporte da placa e marque para entrar na placa. Quando solicitado, selecione 384LDV_AQ_B2 para definir o NanoDispenser no modo de dispensação de buffer aquoso e pressione OK. Selecione o levantamento no menu diversos. E clique no lançamento.
Selecione os poços pré-preenchidos para analisar e clique no botão go. Verifique se os volumes medidos correspondem aos esperados e certifique-se de que nenhum poço tenha sido carregado com volumes de mais de 12 microliters. Prime a tubulação com meio livre de soro preenchendo um novo vaso estéril com 10 mililitros de meio de soro pré-aquecido livre e submergindo o organizador do tubo nele.
Pressione o botão prime do manipulador de líquido peristáltico por cerca de 10 segundos. Certifique-se de que a ponta não está entupida inspecionando visualmente o fluxo da cabeça de distribuição. Coloque uma placa de cultura 384 estéril no porta-placas de manipulador de líquido peristáltico e remova sua tampa.
Execute o programa pré-calibrado para dispensar um microliter em cada poço da placa 384. O tempo de dispensação é de aproximadamente oito segundos. Em seguida, substitua a tampa da placa 384.
Para configurar a dispensação de DNA orientada pelo ADE, execute o software picklist. Defina os 384 poços originários de 384LDV. Defina o dispositivo para o modo de distribuição de buffer aquoso, selecionando 384LDV_AQ_B2.
E os tipos de placas de destino para Greiner_384PS_781096. Throughput de transferência otimizado un-tick. Selecione a guia de lista de escolhas.
Clique na importação. E selecione o arquivo DNA_Picklist_CSV. Em seguida, clique em jogar e salve o protocolo.
Clique em simular para realizar uma simulação das dispensas do programa para garantir que a lista de escolhas corresponda ao design experimental esperado. Clique no botão executar e inicie o programa de dispensação. Quando solicitado, insira a placa de origem solicitada.
E então a placa de destino no NanoDispenser. Para configurar a dispensação do reagente transfecção, trabalhe em um armário de biossegurança para diluir reagente de transfecção lipopoliplex em meio livre de soro para uma concentração final de um x e vórtice do tubo. Dispense imediatamente a mistura TR de acordo com a placa de origem predefinida digna pela macro e usando a aplicação da guia de pipetação de poços pré-calibrada 384.
Após a dispensação de TR, realize uma pesquisa para controlar os volumes carregados de TR como feito antes para o DNA carregado. Selecione a mistura de reação de transfecção pré-preenchido poços para analisar. E clique no botão go.
Verifique se os volumes medidos correspondem aos esperados. E garantir que nenhum poço tenha sido carregado com volumes de mais de 12 microliters. Agora realize uma redefinição da lista de coleta de DNA no software picklist.
Verifique se os parâmetros do dispositivo ainda estão definidos como buffers aquosos. Digite os tipos corretos de placas de origem e destino. Na guia lista de escolhas, clique em redefinir para limpar a lista de amostras.
Em seguida, clique em importar e escolha o TR_Picklist. Arquivo CSV. Clique em play.
Salve o protocolo se solicitado e realize uma simulação das dispensações da mistura de reagentes de transfecção do programa para garantir o design adequado clicando no botão simular. Como feito anteriormente, depois de clicar no botão executar e iniciar o programa de dispensação coloque a placa de origem e, em seguida, a placa de destino no NanoDipsenser como solicitado. Para dispensar as células, encha um novo vaso estéril com a suspensão celular preparada e mexa-a para evitar sedimentação levando à imprecisão e densidade celular.
Insira o organizador do tubo na solução. Em seguida, pressione o botão primo até que a suspensão da célula comece a sair da cabeça de distribuição. Certifique-se de que a ponta não está entupida inspecionando visualmente o fluxo da cabeça de distribuição durante a descarga e certifique-se de que cada tubo esteja carregado com suspensão celular.
Agora, carregue o DNA e tr encheu 384 placa de destino bem no porta-placas de líquido peristáltico e remova sua tampa. Execute o programa pré-calibrado para dispensar 40 microliters da suspensão celular na placa completa 384. O tempo de dispensação é de cerca de 45 segundos.
Por fim, substitua a tampa da placa 384. A transfecção de células HeLa usando reagente lipopoliplex foi bem sucedida. As quantidades de DNA que variavam de cinco a 30 nanogramas mostraram a mesma eficiência e até 90% de transfecção celular em um volume diluído de microliteres.
Em contrapartida, os valores mais elevados resultaram em uma redução abrupta no percentual de células transfeinadas. Vários volumes diluídos que variavam de 15 nanoliteiros a quatro microlitres foram testados e um microliter foi identificado como a melhor condição. Para aumentar ainda mais o rendimento deste protocolo, dois métodos eficientes de armazenamento de DNA foram testados, ou seja, o armazenamento seco da placa ou do armazenamento congelado.
Ambos os métodos de armazenamento não levaram a resultados significativamente diferentes da solução de DNA recém-dispensada armazenada por até sete dias. Como a transfecção plasmática geralmente emprega pelo menos dois plasmídeos diferentes, a capacidade de multiplexagem de DNA deste protocolo foi examinada usando as melhores condições identificadas. A proteína fluorescente vermelha tdTomato anteriormente utilizada expressando plasmídeo foi modificada para expressar mVenus uma proteína fluorescente amarela brilhante e ambos foram então usados em tentativas de cotransfecção.
Análise de células fluorescentes vermelhas ou verdes mostrou que a eficiência da transfecção era de cerca de 80% No entanto, quase 100% das células vermelhas também foram cotransfectadas com o mVenus expressando plasmídeo como pode ser visto na análise de imagem baseada em software representativo. Uma vez que os DNAs tenham sido dispensados na placa de origem. Realize uma pesquisa para garantir que os volumes esperados tenham sido carregados e não excedam 12 microliters.
Ao dispensar o reagente de transfecção na placa de origem, tente evitar bolhas, pois a centrifugação de subplacas resultará em uma perda completa da eficácia da transfecção. Este método pode ser aplicado a experimentos biológicos, crimes e transfecção e é adequado para a maioria que pode ser realizado em um formato de placa 384 bem. Uma transfecção à prova completa abre caminho para novas aplicações, como a base de plasmídeos conhecidas por abordagens não-triagem de gesso mais nítidas que permitem o monitoramento do afeto intermitente atualmente incapaz de ser classificado em estratégias ruins.
