מחקר זה נועד לתכנן ולהעביר עורכים אפיגנומיים לתאים אנושיים. אנו עושים זאת על ידי מיזוג אפקטורים של כרומטין ל-dCas9 לאפנון גנים ממוקד מבלי להכניס שבירות DNA רעילות. האתגרים סובבים סביב אספקה יעילה של עורכי אפיגנום לתאים והבטחת ספציפיות מטרה מדויקת.
בנוסף, השגת דיכוי גנים יציב או חולף נותרה קשה. פרוטוקול זה מונע כל מנגנוני הדבקה, ומפחית רעילות וחוסר יציבות גנומית. הוא מתאר שתי שיטות אספקה לאפנון ביטוי גנים מבוקר ללא שינויים קבועים ברצף ה-DNA.
ניתן ליישם שיטות אלה לבדיקת איחויים שונים ל-dCas9 ולחקר ביולוגיה בסיסית של כרומטין. עורכי אפיגנום נוכחיים יכולים לשמש למסכים ברחבי הגנום ויש להם פוטנציאל ליישומים טיפוליים. בתור התחלה, שמרו על תאי K-562 בבקבוק עם אמצעי RPMI בתוספת 10% FBS ופניצילין סטרפטומיצין גלוטמין.
ביום הגרעין יש להפשיר את ה-mRNA של CRISPRoff בצינור מיקרו-צנטריפוגה סטרילי נטול RNAse ולמערבל בעדינות את הצינור. השתמש בשני מיקרוגרם של mRNA לכל 2.0 כפול 10 בחזקת חמישה תאים בכל באר של צינור רצועת PCR המונח על קרח. הכן את תמיסת הנוקלאופקטציה על פי הוראות היצרן ואפשר לה להתחמם לטמפרטורת החדר למשך 15 דקות לפני הגרעין.
קצור וספור תאי K-562 באמצעות מונה תאים אוטומטי עם צביעה חיה/מתה כחולה טריפאן. עבור נוקלאופקציה בקוביית רצועה, יש לשים בערך פעמיים כפול 10 בחזקת חמישה תאים לדגימה לתוך צינור מיקרו-צנטריפוגה סטרילי. צנטריפוגה של התאים בטמפרטורה של 500 גרם למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.
השליכו את הסופרנטנט. הוסף PBS בטמפרטורת החדר לכדור התא ולצנטריפוגה שוב ב -500 גרם למשך חמש דקות. השליכו את הסופרנטנט.
השעו מחדש את התאים בכמות המתאימה של תמיסת נוקלאופקטור. הוסף את הנפח המחושב של תמיסת התא לשני מיקרוגרם של תמיסת CRISPRoff. העבירו את תמיסת התא וה-mRNA לקובטה, וודאו שלא ייווצרו בועות, מכיוון שהדבר עלול לפגוע ביעילות הנוקאופציה.
הקש בעדינות על הנוקלאוקובט כדי ליישב את התאים בתחתית. לאחר מכן, גרעין את התאים באמצעות מערכת 4D-Nucleofector עם קוד הדופק המתאים. ייתכן שיהיה צורך לבצע אופטימיזציה של קוד הדופק עבור סוגי תאים שונים.
התייעץ עם היצרן אם יש צורך באופטימיזציה נוספת. לאחר נוקלאופקציה, הוסף 80 מיקרוליטר של מדיית RPMI לכל באר משומשת של הנוקלאוקובטה. העבירו את מתלה התא לבאר של צלחת 24 בארות המכילה 400 מיקרוליטר של מדיית RPMI מחוממת מראש.
טען את כל קבצי Flow Cytometry סטנדרטיים, או FSC, לתוך FlowJo על ידי גרירה ושחרור שלהם לגליון עבודה חדש. לחץ על כל הדוגמאות כדי להתחיל ליצור שערים. פתח דוגמת פקד על-ידי לחיצה כפולה על הקובץ המתאים.
צור שער לתאים חיים בתרשים FSC-A לעומת SSC-A באמצעות כלי המצולע. כרטיסיית תאים חיים אמורה להופיע כעת מתחת לשם המדגם ברשימת כל הדגימות. לחץ לחיצה ימנית על שער זה ובחר ניתוח העתק לקבוצה כדי להחיל שער זה על כל הדגימות.
לחץ פעמיים על שער התאים החיים כדי לבחור רק תאים חיים. שנה את הצירים ל-FSC-H לעומת FSC-A. צייר מצולע לשער עבור תאים בודדים בלבד.
כדי לשער למדריך המבטא תאים, לחץ פעמיים על שער התא הבודד כדי לבחור תאים בודדים בלבד. שנה את הצירים ל-FSC-A לעומת PE-CF594-A. צייר שער לביטוי מדריך תאים באמצעות הכלי מצולע.
לחץ פעמיים על שער ההתקנה האחרון, תאים בודדים או תאים מבטאים מדריך. אם מבצעים טרנספקציה של פלסמיד שבה עורך האפיגנום מקודד לחלבון פלואורסצנטי כחול, או היתוך BFP, צור שער לתאים חיוביים של BFP עבור דגימות היום השני. צור שער לביטוי מדווח על ידי התוויית BB515-A כנגד FSC-A כדי לזהות ולשער עבור תאים שליליים של GFP.
לאחר מכן, החל שער זה על כל הדגימות. לאחר השלמת הגדרת השער, לחץ על עורך הטבלאות בחלונית העליונה. גרור אוכלוסיות לניתוח, כגון תאים חיוביים ל- BFP ותאים שליליים ל- GFP.
בחלונית עורך הטבלאות, לחץ על צור טבלה והעתק את הנתונים לפני הדבקתם בגיליון אלקטרוני לצורך חישובי נורמליזציה. כעת, הפחיתו את מספר התאים השליליים המדווחים, כגון GFP שלילי, בדגימת הבקרה מכל הדגימות האחרות. זה מתקן את השתקת הרקע של הכתב.
אם מבצעים טרנספקציה, חלקו כל ערך באחוז התאים החיוביים של BFP שנמדדו ביום השני כדי לנרמל את כל הערכים לאחוז התאים החיוביים של BFP, ולאחר מכן הכפל ב-100. זה מניב את הערך המנורמל של יעילות הטרנספקציה של התאים הערוכים התווה את הנתונים כדי ליצור גרפים קוויים המייצגים שינויים לאורך מהלך הזמן של עריכת האפיגנום.
עבור כל ניסויי עריכת האפיגנום, מומלץ להשתמש בבקרת מדריך שאינה ממוקדת כדי לאשר ששינויים במיקומי היעד נובעים מעריכת אפיגנום ולא מביטוי יתר או קשירה לא ספציפית של עורך האפיגנום. חשוב לקחת בחשבון את שיטת המסירה של עורך האפיגנום. ניתן להעדיף טרנספקציה של DNA פלסמיד או נוקלאופקציה של mRNA בהתחשב בהקשר הניסיוני.
התחשבות בסוג התא, ציר הזמן של הניסוי, קריאת המסירה ויעילות המסירה עשויה להשפיע על שיטת האספקה המועדפת. תאים המבטאים רמות גבוהות של BFP ביומיים לאחר הטרנספקציה מצביעים על טרנספקציה מוצלחת עם עורך האפיגנום. גם CRISPRoff וגם CRISPRi מראים השתקת שיא של הגן ביום החמישי לאחר הטרנספקציה.
בניסויי נוקלאופקציה של mRNA, השתקת גנים חזקה נצפית ביום השלישי לאחר נוקלאופקציה עם CRISPRoff.
