Name: optimized analysis of in vivo and in vitro hepatic steatosis
Uploaded: 2017-03-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 58 s
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We appreciate Feifei Zhang for the helpful discussions. We are grateful to Jing Gao and Yixuan Sun for the technical assistance and to Zhengshuai Liu and Fengguang Ma for the animal studies.

Todos os protocolos experimentais com animais foram aprovados pelo comitê de cuidados com os animais e uso institucional do Instituto de Ciências da Nutrição, Instituto Xangai de Ciências Biológicas, da Academia Chinesa de Ciências (Xangai, China). 1. DIO Modelo rato <ol><li> alimentação HFHS <ol><li> Alimente a oito semanas de idade, do sexo masculino camundongos C57BL / 6 com um HFHS que contém 40 kcal% de gordura e 40 kcal% de sacarose. Abrigá-los em 12 h condições do ciclo escuro de luz. </li><li> Mantenha os ratos em estado dieta de alimentação HFHS de quatro a 16 semanas. Verifique semanalmente o peso corporal. </li></ol></li><li> Análise de composição corporal e análise de imagem pseudo-color <ol><li> Sujeitar os ratos para uma análise de composição corporal analisador. <ol><li> Fixar ratos conscientes, não anestesiados num tubo de plástico no. Medir a massa de gordura corporal, massa magra, e fluidos usando um sistema de RMN, conforme descrito anteriormente 2. </li></ol></li><li> Digitalizar todo o corpo de cada rato utilizando um sistema de ressonância magnética. <ol><li> Anestesiar os ratos com 1% Avertin através de injecção intraperitoneal (25 mL / g) e realizar a análise de imagens em tubos de vidro especializados. NOTA: O processo de imagiologia tem a duração de cerca de 0,5 h para cada rato. Quando a medição está concluída, retornar os ratos às suas gaiolas. </li></ol></li><li> Verificar todo o corpo dos ratos no dorsal, médio e camadas ventral; digitalizar o fígado na direcção vertical. Use um ímã 0,55 T e os seguintes parâmetros instrumentais: Espaço K = 192 x 256 mm, espessura de corte = 3 mm, TE = 14,8 ms, TR = 400 ms, FOVRead = 100 mm, FOVPhase = 100 mm, e o número de scans = 8. Digitalizar usando a mesma condição magnética para todos os grupos de camundongos. </li><li> Mapear a imagem em tons de cinza em uma imagem pseudo-cor de acordo com a intensidade do sinal 9. </li></ol></li><li> rato eutanásia <ol><li> esterilizar dissectiferramentas Ng, tais como pinça e tesouras. </li><li> Despeje isoflurano suficiente sobre uma toalha de papel e deixar que o isoflurano volatilizar em um frasco de vidro. Assegure-se que os ratos são sacrificados pelo isoflurano. </li><li> Corrigir os ratos numa mesa de operação. Spray de cada abdômen com 75% de etanol, fazer uma incisão na derme do apêndice xifóide usando uma tesoura, e desgaste da derme longitudinalmente através da linha média com as mãos para expor o peritônio. </li><li> Prender o processo xifóide com uma pinça e cortar o peritoneu da largura através do fundo das nervuras para expor as vísceras. </li><li> Recolha de sangue em tubos revestidos com EDTA por punção cardíaca. </li><li> Cortar o diafragma ao longo do fígado e remova cuidadosamente o fígado dos enterocoelia usando uma tesoura fina. Corte três pedaços de tecido de fígado para as seguintes medições de lipidos: a) 6 x 3 x 3 mm para a coloração de H &amp; E, b) 6 x 3 x 3 mm de Oil Red O coloração, e c) 20-40 mg de fígado de clorofórmio / extracção de metanol. </li></ol></li><li> Coloração H &amp; E <ol><li> Corrigir o fígado em 4% de acetato de formalina tamponada com fosfato a 4 ° C durante a noite e, em seguida, incorporá-lo em cera de parafina. </li><li> Cortar secções de parafina (5 uM) e montá-los em lâminas de vidro para coloração com H @ E, conforme anteriormente descrito 3, 10. </li></ol></li><li> Oil Red O coloração <ol><li> preparação Regent <ol><li> Preparar solução de trabalho Oil Red O com formalina a 10%, isopropanol a 60%, de hematoxilina, e gelatina de glicerol. Dissolve-se 0,5 g de Oil Red O pó com 100 ml de isopropanol e aquecê-lo em um banho de 60 ° C para produzir uma solução stock a 0,5%. </li><li> Dilui-se com água bidestilada (ddH2O), a uma proporção de 3: 2 (3 mL de uma solução de estoque e 2 ml de ddH2O). Filtra-se a solução de trabalho e deixar em repouso durante pelo menos 10 min à temperatura ambiente. </li></ol></li><li> Incorporar o fígado na temperatura ideal de corte composto (OCT) em apcaixa de encaixe lastic. Congelá-lo a -20 ° C durante 30 min. Corte-o em seções 8 mícrons em micrótomo de congelação, montar o tecido em um slide, e colocá-lo à temperatura ambiente durante 30 min. </li><li> Coloque uma toalha de papel no fundo de uma banheira de coloração e derramar uma pequena quantidade de formalina a 10% para molhar a toalha de papel. Coloque o slide na banheira de coloração e corrigir os cortes congelados em vapores de formaldeído por 5 min a 4 ° C. </li><li> Mergulhe a lâmina em 60% isopropanol na banheira de coloração por 3 s; repetir uma vez. </li><li> Adicionar algumas gotas de solução de trabalho de Oil Red O para o deslizamento para cobrir todos os tecidos e incubar durante 15 min. Proteger o tecido da luz à temperatura ambiente. </li><li> Lave o slide na nova isopropanol 60% na banheira de coloração por 3 s; repetir duas vezes. </li><li> Lave o slide através de água destilada duas vezes e remover a água em torno do tecido. Não se esqueça de secar o tecido. </li><li> Coloque o slide em hematoxilina durante 1 min e lavar cuidadosamente com água da torneira durante 5-10min. Lave o slide em água destilada duas vezes e manter o que em água destilada até que esteja pronto para colocar sobre a lamela. </li><li> Aquece-se a gelatina glicerol no micro-ondas e colocar várias gotas na parte superior do tecido. Delicadamente, coloque a lamela em cima e tomar cuidado para não formar bolhas. </li><li> Observe a mancha sob um microscópio e capturar imagens característicos usando 20X e 40X objectivos. </li></ol></li><li> Medição de lipidos do fígado <ol><li> Colocar o tecido de fígado dissecado em um novo tubo de centrífuga de plástico de 2 ml. Homogeneizar em 1 ml de PBS com um homogeneizador e transferir o lisado para um novo tubo de vidro de 15 ml. </li><li> Adicionar 5 mL de clorofórmio / metanol (2:, 1 v / v) de solução, de vórtice a mistura vigorosamente durante 1 min, e deixar em repouso durante 2 horas em gelo. </li><li> Centrifugar a 1.650 xg durante 10 min a 4 ° C; a mistura deve separar em 3 camadas: a camada superior de metanol, o disco proteína meio, eo clorofórmio fundo e lipídios. </li><li> Tran<html> sfer a fase inferior para um tubo de vidro de novo usando uma pipeta de Pasteur de vidro; não há necessidade de obter cada gota da fração inferior. Definir o tubo de lado no gelo. </li><li> Adicionar 600 mL de 4 mM de MgCl2 e 1,5 ml de clorofórmio para a fracção do sobrenadante a esquerda no tubo anterior e vortex vigorosamente. Incubar em gelo durante 30 minutos e centrifugar a 1650 xg durante 10 min a 4 ° C. </li><li> Combine a fase de fundo com o tubo primeira fase inferior usando Pasteur pipeta. Descartar as camadas média e alta. </li><li> Evapora-se o clorofórmio sob atmosfera de azoto num banho de 37 ° C. Lavar os lados dos tubos de vidro cuidadosamente com 200 uL de 1% de Triton X-100 / clorofórmio (v / v). Evaporar sob atmosfera de azoto. Dissolve-se o lípido com 200 uL de ddH2O e vórtice bem para tornar a emulsão final. </li><li> Medir a triglicéridos totais (TG) e colesterol (TC) níveis usando um kit de triglicéridos ou de colesterol de acordo com o protocolo do fabricantexref &quot;&gt; 3. NOTA: Os valores são normalizados de lípidos aos das concentrações de proteína no homogenato inicial, tal como determinado por quantificação de proteínas 3. </li></ol></li></ol> 2. principal do mouse Hepatócito Modelo <ol><li> O isolamento de hepatócitos primários de rato <ol><li> Anestesiar cada rato com 6% de hidrato de cloral (10 mL / g por via intraperitoneal). </li><li> Isolar hepatócitos primários, como previamente descrito 10. Cresça as células em lamelas de vidro revestidas com colagénio de uma placa de 6 poços para Oil Red O coloração. Para extracção de lípidos, semear as células numa placa de cultura celular de 10 cm 10. </li></ol></li><li> Tratamento com células e Oil Red O coloração <ol><li> Substituir o meio com 2 ml de meio de privação e incubar a 37 ° C durante 24 h. Trate-o com glucose 30 mM e 100 nM de insulina. Incubar em que uma temperatura de 37 ° C incubadora de cultura durante 24 h. </li><li> Aspirar o meio. Adicionar 2 mL de PBS e agite cuidadosamente para lavar o material; repetir uma vez. </li><li> Fixar a lamela para o slide com um elástico. Expor as células aderentes à superfície do lado de fora. Realizar a coloração de Vermelho de Óleo O, conforme descrito acima (passo 1.5). NOTA: Os níveis basais de acumulação de lípidos são estimuladas com um elevado teor de glucose, mais tratamento com insulina após privação de soro. As gotas de lípidos são visualizadas por coloração com Oil Red O. </li></ol></li><li> Medição de lípidos <ol><li> Tratar os hepatócitos com alto teor de glucose e insulina no mesmo estado (passo 2.2.1). Adicionar 1 mL de PBS a cada placa de cultura celular de 10 cm. Raspar as células e colhem-los para novos tubos de vidro de 15 ml, a partir do qual se alíquotas de 100 ul são transferidos para tubos frescos de 1,5 ml para a quantificação de proteína. </li><li> Adicionar 4 ml de clorofórmio / metanol (2: 1, v / v) para os restantes 900 ul de células. Sonicate por aproximados 20 sinais sonoros e, em seguida, vortex vigorosamente para liberaro lípido nas células. Incubar a mistura em gelo durante 2 h. Realizar a extração de lipídios (passo 1.6). </li></ol></li></ol>

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Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes. Financiamento: Este trabalho foi apoiado por subsídios da National Science Foundation Natural da China (No. 81270930, 31471129 e 31671224) e os cem talentos Programa da Academia Chinesa de Ciências (2013OHTP04) para YL

Esteatose hepática é uma série de doenças do fígado progressivas que está associado com o síndrome metabólico, a obesidade, resistência à insulina, ou diabetes mellitus tipo 2 (DM2) 11. A marca da DHGNA é esteatose, a acumulação de lípidos nos hepatócitos. Aqui, um espectro de métodos é apresentada para caracterizar os fenótipos e parâmetros de esteatose hepática utilizando ratinhos DIO e hepatócitos primários de rato. Este procedimento pode ser útil para elucidar os mecani...

A obesidade é um problema de saúde crescente em países desenvolvidos e em desenvolvimento. Tem sido relatada como sendo uma das condições coexistentes frequentemente associadas com doença hepática não-alcoólica (EHNA), com uma prevalência que varia entre 30 e 100 por cento em pacientes NAFLD 1. Devido à forte correlação entre o fígado gordo e obesidade, obesos (DIO) modelos de rato induzida por dieta são amplamente usadas para estudar os mecanismos moleculares complexas associadas com o desenvolvimento de EHNA 2, 3, 4, 5, 6. A esteatose hepática é o primeiro estágio de DHGNA, e pode evoluir para esteato-hepatite não alcoólica (NASH), cirrose, e, finalmente, câncer de fígado 7. Portanto, o objetivo geral deste método é gerar modelos animais e celulares de condições com esteatose hepática e ao PROvide protocolos detalhados para a medição de lípidos eficiente e preciso. Estes modelos e medições são também úteis para a investigação de outros distúrbios metabólicos, tais como a resistência à insulina e diabetes tipo 2. Como a obesidade é identificado como sendo um dos principais factores de risco para EHNA, um alto teor de gordura, alta-sacarose dieta (HFHS) que imita a dieta de alta gordura de estilo ocidental é utilizado para induzir obesidade em ratos. Subsequentemente, o grau de esteatose hepática pode ser avaliada utilizando métodos diferentes. Primeiro, o peso corporal e análise de composição corporal com ressonância magnética nuclear (RMN) mostra a acumulação de lípidos durante a alimentação. A massa de gordura e massa magra pode ser quantificado de um modo não-invasivo e em tempo real. Além disso, a imagem por ressonância magnética (MRI) é usado para mostrar tanto a todo o organismo e a distribuição de gordura no fígado. O sinal de escala de cinzentos da análise de ressonância magnética pode ser convertido numa imagem de pseudo-cor legível, e a intensidade dea escala de cinza e cor é hemi-quantificáveis. Esta tecnologia proporciona vantagens únicas para a medição da acumulação de lípidos nos animais vivos. Segundo, a análise histológica do fígado é o método mais comummente utilizado para determinar a esteatose hepática. Hematoxilina e Eosina (H &amp; E) Coloração histológica fornece informações, tais como a morfologia dos hepatócitos e infiltração de macrófagos, enquanto Oil Red O coloração mostra o tamanho e a posição das gotículas lipídicas em hepatócitos. Em terceiro lugar, a análise do conteúdo de lípidos utilizando extracção com clorofórmio / metanol é uma medida precisa e quantitativa de lípidos hepática. Os níveis totais de triglicérides e colesterol pode ser medido com métodos bioquímicos. Mais importante, a análise de extracção lipídica e Oil Red O coloração pode também ser usado em geneticamente manipuladas ou tratadas farmaceuticamente hepatócitos. A vantagem do presente método é a sua utilização de várias abordagens optimizadas para gerar modelos de esteatose hepáticae caracterizar exaustivamente os fenótipos tanto in vivo como in vitro. Os modelos de ratos DIO pode recapitular a patologia e metabólicas fenótipos de doença hepática gordurosa humano. Outros parâmetros metabólicos em seres humanos pode ser replicado neste modelo bem 8. A geração do modelo de hepatócitos esteatótica em resposta ao alto teor de glucose e insulina é eficiente, útil, e supera a limitação do trabalho caro e demorado rato. Tomados em conjunto, estes métodos são suficientes e é essencial para o estudo da disfunção lípidos hepática e resistência à insulina durante a sobrecarga de nutrientes.

<table><tbody><tr><td>O.C.T compound</td><td>SAKURA</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Oil Red O</td><td>Sigma</td><td>O0625-25G</td><td></td></tr><tr><td>Infinity Triglycerides kit</td><td>Fisher&amp;nbsp;Scientific</td><td>TR22421</td><td></td></tr><tr><td>Infinity Cholesterol kit</td><td>Fisher&amp;nbsp;Scientific</td><td>TR13421</td><td></td></tr><tr><td>Collagen type I, Rat tail</td><td>Millipore</td><td>08-115</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (low glucose)</td><td>Invitrogen</td><td>11885-092</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin / Streptomycin</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Invitrogen</td><td>10099141</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>cellgro</td><td>R21-040-CVR</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>cellgro</td><td>20-021-CV</td><td></td></tr><tr><td>Insulin</td><td>TOCRIS Bioscience</td><td>3435</td><td>dissolve in PBS, 1 mM for stock</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma</td><td>G8270-100G</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Olympus</td><td>BX53</td><td></td></tr><tr><td>Peristaltic pump</td><td>Longerpump</td><td>BT100-2J</td><td></td></tr><tr><td>10 cm cell culture dish</td><td>Corning</td><td>420167</td><td></td></tr><tr><td>6-well-plate</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>BCA assay</td><td>Beyotime</td><td>P0010</td><td></td></tr><tr><td>Nuclear Magnetic Resonance</td><td>Niumag technology</td><td>MiniQMR23-060H-I</td><td></td></tr><tr><td>High fat high surcose diet (HFHS)</td><td>Research Diets</td><td>D12327</td><td></td></tr></tbody></table>

optimized analysis of in vivo and in vitro hepatic steatosis

Establishing a system of procedures to qualitatively and quantitatively characterize in vivo and in vitro hepatic steatosis is important for metabolic study in the liver. Here, numerous assays are described to comprehensively measure the phenotype and parameters of hepatic steatosis in mouse and hepatocyte models. 
Combining the physiological, histological, and biochemical methods, this system can be used to assess the progress of hepatic steatosis. In vivo, the measurements of body weight and nuclear magnetic resonance (NMR) provide a general understanding of mice in a non-invasive manner. Hematoxylin and Eosin (H&amp;E) and Oil Red O staining determine the histological morphology and lipid deposition of liver tissue under nutrient overload conditions, such as high-fat diet feeding. Next, the total lipid contents are isolated by chloroform/methanol extraction, which are followed by a biochemical analysis for triglyceride and cholesterol. Moreover, mouse primary hepatocytes are treated with high glucose plus insulin to stimulate lipid accumulation, an efficient in vitro model to mimic diet-induced hyperglycemia and hyperinsulinemia in vivo. Then, the lipid deposition is measured by Oil Red O staining and chloroform/methanol extraction. Oil Red O staining determines intuitive hepatic steatotic phenotypes, while the lipid extraction analysis determines the parameters that can be analyzed statistically. The present protocols are of interest to scientists in the fields of fatty liver diseases, insulin resistance, and type 2 diabetes.

Como mostrado na Figura 1A, o peso do corpo do rato foi aumentada para 45 ± 1,2 g depois de 16 semanas de alimentação HFHS, que é aproximadamente 1,5 vezes maior do que o grupo de dieta de comida de alimentação. A análise de RMN da composição corporal que mostra a massa de gordura e massa magra de ratos são indicados (Figura 1B). As distribuições de gordura do corpo inteiro e do fígado foram determinados por ressonância magnética e imagens...

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Optimized Analysis of In Vivo and In Vitro Hepatic Steatosis

Here, optimized methods to generate in vivo and in vitro models of hepatic steatosis and to analyze the steatotic phenotypes and related physiological parameters are described.

Análise otimizada de<em&gt; In Vivo</em&gt; e<em&gt; In Vitro</em&gt; A esteatose hepática

Establishing a system of procedures to qualitatively and quantitatively characterize in vivo and in vitro hepatic steatosis is important for metabolic ...

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Medicine

Optimized Analysis of In Vivo and In Vitro Hepatic Steatosis

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Visualization and Analysis of Blood Flow and Oxygen Consumption in Hepatic Microcirculation: Application to an Acute Hepatitis Model

There is a considerable discrepancy between oxygen supply and demand in the liver because hepatic oxygen consumption is relatively high but about 70% of the hepatic blood supply is poorly oxygenated portal vein blood derived from the gastrointestinal tract and spleen. Oxygen is delivered to hepatocytes by blood flowing from a terminal branch of the portal vein to a central venule via sinusoids, and this makes an oxygen gradient in hepatic lobules. The oxygen gradient is an important physical parameter that involves the expression of enzymes upstream and downstream in hepatic microcirculation, but the lack of techniques for measuring oxygen consumption in the hepatic microcirculation has delayed the elucidation of mechanisms relating to oxygen metabolism in liver. We therefore used FITC-labeled erythrocytes to visualize the hepatic microcirculation and used laser-assisted phosphorimetry to measure the partial pressure of oxygen in the microvessels there. Noncontact and continuous optical measurement can quantify blood flow velocities, vessel diameters, and oxygen gradients related to oxygen consumption in the liver. In an acute hepatitis model we made by administering acetaminophen to mice we observed increased oxygen pressure in both portal and central venules but a decreased oxygen gradient in the sinusoids, indicating that hepatocyte necrosis in the pericentral zone could shift the oxygen pressure up and affect enzyme expression in the periportal zone. In conclusion, our optical methods for measuring hepatic hemodynamics and oxygen consumption can reveal mechanisms related to hepatic disease.

An optical system was developed to visualize hepatic microcirculation with FITC-labeled erythrocytes and to measure the partial pressure of oxygen in the microvessels with laser-assisted phosphorimetry. This method can be used to investigate physiological and pathological mechanisms by analyzing microvascular structure, diameter, blood flow velocity, and oxygen tension.

Visualização e análise do fluxo sangüíneo e consumo de oxigênio na microcirculação hepática: aplicação para um modelo Hepatite Aguda

There is a considerable discrepancy between oxygen supply and demand in the liver because hepatic oxygen consumption is relatively high but about 70% of ...

Medicina

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. Here, we describe a general protocol for cell labeling, imaging, and image processing. The technique is applicable to various cell types and animal models, although here we focus on a typical mouse model for tracking murine immune cells. The most important issues for cell labeling are described, as these are relevant to all models. Similarly, key imaging parameters are listed, although the details will vary depending on the MRI system and the individual setup. Finally, we include an image processing protocol for quantification. Variations for this, and other parts of the protocol, are assessed in the Discussion section. Based on the detailed procedure described here, the user will need to adapt the protocol for each specific cell type, cell label, animal model, and imaging setup. Note that the protocol can also be adapted for human use, as long as clinical restrictions are met.

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

We describe a general protocol for in vivo cell tracking using MRI in a mouse model with ex vivo labeled cells. A typical protocol for cell labeling, image acquisition processing and quantification is included.

In vivo 19 F MRI para Rastreamento celular

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. ...

Measurement of Fatty Acid &#946;-Oxidation in a Suspension of Freshly Isolated Mouse Hepatocytes

Fatty acid &#946;-oxidation is a key metabolic pathway to meet the energy demands of the liver and provide substrates and cofactors for additional processes, such as ketogenesis and gluconeogenesis, which are essential to maintain whole-body glucose homeostasis and support extra-hepatic organ function in the fasted state. Fatty acid &#946;-oxidation occurs within the mitochondria and peroxisomes and is regulated through multiple mechanisms, including the uptake and activation of fatty acids, enzyme expression levels, and availability of cofactors such as coenzyme A and NAD+. In assays that measure fatty acid &#946;-oxidation in liver homogenates, cell lysis and the common addition of supraphysiological levels of cofactors mask the effects of these regulatory mechanisms. Furthermore, the integrity of the organelles in the homogenates is hard to control and can vary significantly between preparations. The measurement of fatty acid &#946;-oxidation in intact primary hepatocytes overcomes the above pitfalls. This protocol describes a method for the measurement of fatty acid &#946;-oxidation in a suspension of freshly isolated primary mouse hepatocytes incubated with 14C-labeled palmitic acid. By avoiding hours to days of culture, this method has the advantage of better preserving the protein expression levels and metabolic pathway activity of the original liver, including the activation of fatty acid &#946;-oxidation observed in hepatocytes isolated from fasted mice compared to fed mice.

Fatty acid &#946;-oxidation is an essential metabolic pathway responsible for generating energy in many different cell types, including hepatocytes. Here, we describe a method to measure fatty acid &#946;-oxidation in freshly isolated primary hepatocytes using 14C-labeled palmitic acid.

Medição do ácido graxo β-oxidação em uma suspensão de hepatócitos de rato recém-isolados

Fatty acid &#946;-oxidation is a key metabolic pathway to meet the energy demands of the liver and provide substrates and cofactors for additional ...

Bioquímica

Avaliação da esteatose hepática com reconstrução de gotículas lipídicas de fluorescência 3D

Analysis of Fluorescent-Stained Lipid Droplets with 3D Reconstruction for Hepatic Steatosis Assessment

Lipid droplets (LDs) are specialized organelles that mediate lipid storage and play a very important role in suppressing lipotoxicity and preventing dysfunction caused by free fatty acids (FAs). The liver, given its critical role in the body's fat metabolism, is persistently threatened by the intracellular accumulation of LDs in the form of both microvesicular and macrovesicular hepatic steatosis. The histologic characterization of LDs is typically based on lipid-soluble diazo dyes, such as Oil Red O (ORO) staining, but a number of disadvantages consistently hamper the use of this analysis with liver specimens. More recently, lipophilic fluorophores 493/503 have become popular for visualizing and locating LDs due to their rapid uptake and accumulation into the neutral lipid droplet core. Even though most applications are well-described in cell cultures, there is less evidence demonstrating the reliable use of lipophilic fluorophore probes as an LD imaging tool in tissue samples. Herein, we propose an optimized boron dipyrromethene (BODIPY) 493/503-based protocol for the evaluation of LDs in liver specimens from an animal model of high-fat diet (HFD)-induced hepatic steatosis. This protocol covers liver sample preparation, tissue sectioning, BODIPY 493/503 staining, image acquisition, and data analysis. We demonstrate an increased number, intensity, area ratio, and diameter of hepatic LDs upon HFD feeding. Using orthogonal projections and 3D reconstructions, it was possible to observe the full content of neutral lipids in the LD core, which appeared as nearly spherical droplets. Moreover, with the fluorophore BODIPY 493/503, we were able to distinguish microvesicles (1 &#181;m &lt; d &#8804; 3 &#181;m), intermediate vesicles (3 &#181;m &lt; d &#8804; 9 &#181;m), and macrovesicles (d &gt; 9 &#181;m), allowing the successful discrimination of microvesicular and macrovesicular steatosis. Overall, this BODIPY 493/503 fluorescence-based protocol is a reliable and simple tool for hepatic LD characterization and may represent a complementary approach to the classical histological protocols.

Autor em destaque: Análise de gotículas lipídicas coradas com fluorescência com reconstrução 3D para avaliação da esteatose hepática  

Herein, we demonstrate an optimized BODIPY 493/503 fluorescence-based protocol for lipid droplet characterization in liver tissue. Through the use of orthogonal projections and 3D reconstructions, the fluorophore allows for successful discrimination between microvesicular and macrovesicular steatosis and may represent a complementary approach to the classical histological protocols for hepatic steatosis assessment.

Análise de Gotículas Lipídicas Coradas por Fluorescência com Reconstrução 3D para Avaliação da Esteatose Hepática

Lipid droplets (LDs) are specialized organelles that mediate lipid storage and play a very important role in suppressing lipotoxicity and preventing ...

Inducing and Characterizing Vesicular Steatosis in Differentiated HepaRG Cells

Hepatic steatosis represents a metabolic dysfunction that results from an accumulation of triglyceride-containing lipid droplets in hepatocytes. Excessive fat accumulation leads to non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD), &#160;which is potentially reversible and may evolve into non-alcoholic steatohepatitis (NASH) and eventually cirrhosis and hepatocellular carcinoma (HCC). The molecular mechanisms linking lipid accumulation in hepatocytes with the progression to NASH, irreversible liver damage, fibrosis, cirrhosis, and even HCC still remains unclear. To this end, several in vitro and in vivo models have been developed to elucidate the pathological processes that cause NAFLD. In the present study, we describe a cellular model for the induction of liver vesicular steatosis that consists of DMSO-differentiated human hepatic HepaRG cells treated with the fatty acid salt sodium oleate. Indeed, sodium oleate-treated HepaRG cells accumulate lipid droplets in the cytoplasm and show typical features of steatosis. This in vitro human model represents a valuable alternative to in vivo mice models as well as to the primary human hepatocytes. We also present a comparison of several methods for the quantification and evaluation of fat accumulation in HepaRG cells, including Oil Red O staining, cytofluorimetric Bodipy measurement, metabolic gene expression analysis by qPCR, and coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) microscopy. CARS imaging combines the chemical specificity of Raman spectroscopy, a chemical analysis technique well-known in materials science applications, with the benefits of high-speed, high-resolution non-linear optical microscopies to allow precise quantification of lipid accumulation and lipid droplet dynamics. The establishment of an efficient in vitro model for the induction of vesicular steatosis, alongside an accurate method for the quantification and characterization of lipid accumulation, could lead to the development of early stage diagnosis of NAFLD via the identification of molecular markers, and to the generation of new treatment strategies.

In this study, we describe a detailed protocol for inducing liver vesicular steatosis in differentiated HepaRG cells with the fatty acid salt sodium oleate and employ methods for detection and quantification of lipid accumulation, including coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) microscopy, cytofluorimetric analysis, Oil red O staining, and qPCR.&#160;

Induzir e caracterizar a esteatose vesicular em células HepaRG diferenciadas

Hepatic steatosis represents a metabolic dysfunction that results from an accumulation of triglyceride-containing lipid droplets in hepatocytes. Excessive ...

Determination of Fatty Acid Oxidation and Lipogenesis in Mouse Primary Hepatocytes

Lipid metabolism in liver is complex. In addition to importing and exporting lipid via lipoproteins, hepatocytes can oxidize lipid via fatty acid oxidation, or alternatively, synthesize new lipid via de novo lipogenesis. The net sum of these pathways is dictated by a number of factors, which in certain disease states leads to fatty liver disease. Excess hepatic lipid accumulation is associated with whole body insulin resistance and coronary heart disease. Tools to study lipid metabolism in hepatocytes are useful to understand the role of hepatic lipid metabolism in certain metabolic disorders.
In the liver, hepatocytes regulate the breakdown and synthesis of fatty acids via &#946;-fatty oxidation and de novo lipogenesis, respectively. Quantifying metabolism in these pathways provides insight into hepatic lipid handling. Unlike in vitro quantification, using primary hepatocytes, making measurements in vivo is technically challenging and resource intensive. Hence, quantifying &#946;-fatty acid oxidation and de novo lipogenesis in cultured mouse hepatocytes provides a straight forward method to assess hepatocyte lipid handling. 
Here we describe a method for the isolation of primary mouse hepatocytes, and we demonstrate quantification of &#946;-fatty acid oxidation and de novo lipogenesis, using radiolabeled substrates.

De novo lipogenesis and &#946;-fatty acid oxidation constitute key metabolic pathways in hepatocyte, pathways that are perturbed in several metabolic disorders, including fatty liver disease. Here we demonstrate isolation of mouse primary hepatocytes and describe quantification of &#946;-fatty acid oxidation and lipogenesis.

Determinação da oxidação de ácidos gordos e Lipogênese em Rato Os hepatócitos primária

Lipid metabolism in liver is complex. In addition to importing and exporting lipid via lipoproteins, hepatocytes can oxidize lipid via fatty acid ...

Biologia

A Model of Experimental Steatosis In Vitro: Hepatocyte Cell Culture in Lipid Overload-Conditioned Medium

Metabolic dysfunction-associated fatty liver disease (MAFLD), previously known as non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD), is the most prevalent liver disease worldwide due to its relationship with obesity, diabetes type 2, and dyslipidemia. Hepatic steatosis, the accumulation of lipid droplets in the liver parenchyma, is a key feature of the disease preceding the inflammation observed in steatohepatitis, fibrosis, and end-stage liver disease. Lipid accumulation in hepatocytes might interfere with proper metabolism of xenobiotics and endogenous molecules, as well as to induce cellular processes leading to the advance of the disease. Although the experimental study of steatosis can be performed in vivo, in vitro approaches to the study of steatosis are complementary tools with different advantages. Hepatocyte culture in lipid overload-conditioned medium is an excellent reproducible option for the study of hepatic steatosis allowing the identification of cellular processes related to lipid accumulation, such as oxidative and reticular stresses, autophagia, proliferation, cell death, etcetera, as well as other testing including drug effectiveness, and toxicological testing, among many other possible applications. Here, it was aimed to describe the methodology of hepatocyte cell culture in lipid overload-conditioned medium. HepG2 cells were cultured in RMPI 1640 medium conditioned with sodium palmitate and sodium oleate. Importantly, the ratio of these two lipids is crucial to favor lipid droplet accumulation, while maintaining cell proliferation and a moderate mortality rate, as occurs in the liver during the disease. The methodology, from the preparation of the lipid solution stocks, mixture, addition to the medium, and hepatocyte culture is shown. With this approach, it is possible to identify lipid droplets in the hepatocytes that are readily observable by Oil-red O staining, as well as curves of proliferation/mortality rates.

A Model of Experimental Steatosis In Vitro: Hepatocyte Cell Culture in Lipid Overload-Conditioned Medium

This protocol is intended to be a tool to study steatosis and the molecular, biochemical, cellular changes produced by the over exposure of hepatocytes to lipids in vitro.

Um modelo de esteatose experimental in vitro: cultura celular hepatocitada em meio lipídidamente condicionado

Metabolic dysfunction-associated fatty liver disease (MAFLD), previously known as non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD), is the most prevalent liver ...

Novel In Vivo Micro-Computed Tomography Imaging Techniques for Assessing the Progression of Non-Alcoholic Fatty Liver Disease

Non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) is a growing global health issue, and the impact of NAFLD is compounded by the current lack of effective treatments. Considerable limiting factors hindering the timely and accurate diagnosis (including grading) and monitoring of NAFLD, as well as the development of potential therapies, are the current inadequacies in the characterization of the hepatic microenvironment structure and the scoring of the disease stage in a spatiotemporal and non-invasive manner. Using a diet-induced NAFLD mouse model, we investigated the use of in vivo micro-computed tomography (CT) imaging techniques as a non-invasive method to assess the progression stages of NAFLD, focusing predominantly on the hepatic vascular network due to its significant involvement in NAFLD-related hepatic dysregulation. This imaging methodology allows for longitudinal analysis of liver steatosis and functional tissue uptake, as well as the evaluation of the relative blood volume, portal vein diameter, and density of the vascular network. Understanding the adaptations of the hepatic vascular network during NAFLD progression and correlating this with other ways of characterizing the disease progression (steatosis, inflammation, fibrosis) using the proposed method can pave the way toward the establishment of new, more efficient, and reproducible approaches for NAFLD research in mice. This protocol is also expected to upgrade the value of preclinical animal models for investigating&#160;the development of novel therapies against disease progression.

Novel In Vivo Micro-Computed Tomography Imaging Techniques for Assessing the Progression of Non-Alcoholic Fatty Liver Disease

Using a diet-induced non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) mouse model, we describe the use of novel in vivo micro-computed tomography imaging techniques as a non-invasive method to assess the progression stages of NAFLD, focusing predominantly on the hepatic vascular network due to its significant involvement in NAFLD-related hepatic dysregulation.

Análise otimizada de

Resumo

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Análise de Gotículas Lipídicas Coradas por Fluorescência com Reconstrução 3D para Avaliação da Esteatose Hepática

Análise de Gotículas Lipídicas Coradas por Fluorescência com Reconstrução 3D para Avaliação da Esteatose Hepática

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Novas Técnicas de Imagem por Microtomografia Computadorizada In Vivo para Avaliação da Progressão da Doença Hepática Gordurosa Não Alcoólica