We appreciate Feifei Zhang for the helpful discussions. We are grateful to Jing Gao and Yixuan Sun for the technical assistance and to Zhengshuai Liu and Fengguang Ma for the animal studies.

모든 동물 실험 프로토콜은 생물 과학에 대한 영양 과학 연구소, 상하이 연구소, 중국 과학 아카데미 (중국 상하이)에서 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다. 1. DIO 마우스 모델 <ol><li> HFHS 공급 <ol><li> 40 킬로 칼로리 %의 지방과 40 킬로 칼로리 %의 자당을 포함하는 HFHS으로 8 주 된 수컷 C57BL / 6 마우스 피드. 12 시간 어두운 조명주기 조건을 수용. </li><li> 네 여섯 주 동안 HFHS 다이어트 수유 상태에서 마우스를 유지합니다. 체중 매주을 확인합니다. </li></ol></li><li> 신체 조성 분석 및 의사 컬러 화상 해석 <ol><li> 신체 조성 분석기 분석 생쥐 대상. <ol><li> 의 플라스틱 튜브에 의식하지 마취 마우스를 고정합니다. 이전이 설명 된 바와 같이, 본체 체지방량, 근육량 및 NMR 시스템을 이용하여 유체를 측정한다. </li></ol></li><li> MRI를 시스템을 사용하여 각 마우스의 몸 전체를 스캔합니다. <ol><li> 복강 내 주사 (25 μL / g)을 통해 1 % AVERTIN 가진 쥐를 마취 전문 유리관에서 촬상 분석을 수행한다. 참고 : 이미지의 과정은 각 마우스에 대한 약 0.5 시간 동안 지속됩니다. 측정이 완료되면, 그 케이지에 마우스를 반환한다. </li></ol></li><li> 지느러미, 중간, 복부 층에서 마우스의 전체 몸을 스캔; 수직 방향 간 스캔. 0.55 T 자석과 같은 수단이 매개 변수를 사용하여 스캔 K 공간 = 192 X 256 μm의 섹션 두께 = 3mm, TE = 14.8 MS, TR = 400 밀리, FOVRead = 100mm, FOVPhase = 100mm, 그리고 수를 = 마우스의 모든 그룹에 대해 동일한 자성 조건을 사용하여 제 스캔. </li><li> 신호 강도 9 항에있어서, 의사 컬러 화상에 계조 화상 약도. </li></ol></li><li> 마우스 안락사 <ol><li> dissecti 소독이러한 집게와 가위로 NG 도구. </li><li> 종이 타월에 충분한 이소 플루 란을 붓고 및 이소 플루 란은 유리 항아리에 휘발 할 수 있습니다. 쥐가 이소 플루 란에 의해 안락사되어 있는지 확인합니다. </li><li> 운영 테이블에 마우스를 고정합니다. 75 % 에탄올로 각각 복부 스프레이 가위를 사용하여 칼 모양 프로세스 진피에 절개를하고, 복막을 노출시키기 위해 손으로 중앙선을 통해 길이 진피 찢어. </li><li> 집게와 칼 모양의 과정을 클램프와 내장을 노출 리브의 바닥을 통해 복막 가로를 잘라. </li><li> 심장 천자에 의해 EDTA 코팅 튜브에 혈액을 수집합니다. </li><li> 간을 따라 다이어프램을 잘라 조심스럽게 좋은 가위를 사용하여 enterocoelia에서 간을 제거합니다. 다음과 같은 지질 측정 간 조직의 세 가지를 잘라 : H &amp; E 염색을위한) 6 × 3 × 3mm, b)는 오일 레드 O 염색을위한 6 × 3 × 3mm, 클로로포름에 대한 간 C) 20 ~ 40 밀리그램 / 메탄올 추출. </li></ol></li><li> H &amp; E 염색 <ol><li> 밤새 4 ° C에서 4 % 인산 완충 포르말린 아세테이트 간을 수정 한 후 파라핀 왁스를 포함. </li><li> 이전에 3, 10 설명한 바와 같이, 파라핀 섹션 (5 μm의)를 잘라 H &amp; E 염색 용 유리 슬라이드에 그들을 탑재합니다. </li></ol></li><li> 오일 레드 O 염색법 <ol><li> 리젠트 준비 <ol><li> 10 % 포르말린, 60 % 이소프로판올, 헤 마톡 실린 및 글리세롤 젤리 오일 레드 O 작업 솔루션을 준비합니다. 이소프로판올 100 mL로 오일 레드 O 분말 0.5 g을 용해시키고, 그 0.5 % 스톡 용액을 만들기 위해 60 ° C의 욕에서 가열한다. </li><li> 2 비율 (DDH 2 O 3 원액의 용액 2 ㎖) : 3에서 두 번 증류수 (DDH 2 O)로 희석. 작업 용액을 여과하고, 실온에서 적어도 10 분 동안 정치하자. </li></ol></li><li> AP 통신에 최적의 절삭 온도 OCT () 화합물의 간을 포함lastic 삽입 상자. 30 분 동안 -20 ℃로 동결. , 동결 마이크로톰 8 μm의 섹션으로 잘라 슬라이드에 조직을 탑재하고, 실온에서 30 분 동안 배치. </li><li> 염색 욕조의 바닥에 종이 타월을 놓고, 종이 타월 습윤 10 % 포르말린 소량 붓는다. 염색 욕조에 슬라이드를 넣고 4 ℃에서 5 분 동안 포름 알데히드 증기에 고정 된 부분을 수정합니다. </li><li> 3 초 동안 염색 욕조에 60 % 이소프로판올에 슬라이드를 찍어; 한 번 반복합니다. </li><li> 모든 조직을 커버하고 15 분 동안 배양 슬라이드에 오일 레드 O 작업 용액 몇 방울을 추가합니다. 실온에서 빛으로부터 조직을 보호합니다. </li><li> 3 초 동안 염색 욕조에 새 60 % 이소프로판올에 슬라이드를 씻어; 두 번 반복합니다. </li><li> 조심스럽게 두 번 증류 물을 통해 슬라이드를 씻어 조직 주위에 물을 제거합니다. 조직을 건조하지 않도록해야합니다. </li><li> 1 분 동안 헤 마톡 실린에서 슬라이드를 놓고 5-10에 대한 수돗물로 부드럽게 씻어분. 조심스럽게 두 번 증류수에 슬라이드를 씻어하고 coverslip에 넣어 준비가 될 때까지 증류수에 보관하십시오. </li><li> 전자 레인지에서 글리세롤 젤리를 가열하고, 조직의 상단에 몇 방울을 배치합니다. 조심스럽게 상단에 커버 슬립을 배치하고 거품을 형성하기 위해주의 바랍니다. </li><li> 현미경으로 얼룩을 관찰하고 20X 및 40X 목표를 사용하여 특성 사진을 캡처합니다. </li></ol></li><li> 간 지질의 측정 <ol><li> 새로운 2 mL의 플라스틱 원심 관의 해부 간 조직을 놓습니다. 균질화와 PBS의 1 mL에 균질화하고 새로운 15 mL 유리 튜브 해물 옮긴다. </li><li> 적극적으로 1 분 동안 (1, v / V를 2) 솔루션, 소용돌이 혼합물 및 얼음에 2 시간 동안 서 있도록 클로로포름 / 메탄올 5 mL를 추가합니다. </li><li> 4 ° C에서 10 분 동안 1,650 XG에 원심 분리기; 상부 메탄올 층 중간 단백질 디스크 및 하부 클로로포름 지질 : 혼합물을 3 층으로 분리한다. </li><li> 트란<html> 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 새 유리관에 바닥 sfer 단계; 바닥 분획의 방울을받을 필요가 없다. 얼음에 옆으로 튜브를 설정합니다. </li><li> 적극적으로 이전 튜브와 소용돌이에 남아있는 상층 부분에 클로로포름 4 밀리미터의 MgCl 2, 1.5 mL를 600 μL를 추가합니다. 4 ° C에서 10 분 동안 1,650 XG에 30 분 동안 얼음과 원심 분리기에 품어. </li><li> 파스퇴르 피펫을 이용하여 제 1 바닥 상 관 바닥 상을 결합한다. 상부 및 중간 계층을 폐기하십시오. </li><li> 37 °의 C 조에서 질소 가스 하에서 클로로포름을 증발. 1 % 트리톤 X-100 / 클로로포름 200 μL 충분히 유리관의 측면 워시 (V / V). 질소 기체 하에서 증발시켰다. 최종 에멀젼을 잘 200 DDH 2 O의 μL와 소용돌이와 지질을 용해. </li><li> 제조사의 프로토콜에 따라 중성 지방 또는 콜레스테롤 키트를 사용하여 총 중성 지방 (TG) 및 콜레스테롤 (TC) 수준을 측정외부 참조 &quot;&gt; 3. 주 : 단백질 정량 (3)에 의해 측정 된 지질 값은 초기 파쇄 액의 단백질 농도들로 정규화한다. </li></ol></li></ol> 2. 기본 마우스 간세포 모델 <ol><li> 마우스 차 간세포의 분리 <ol><li> 6 % 클로 랄 하이드레이트 (복강 10 μL / g)와 각 마우스를 마취. </li><li> 이전 10 설명 된대로 기본 간세포를 분리합니다. 오일 레드 O 염색을위한 6 웰 플레이트에 콜라겐 코팅 커버 글라스에 세포를 성장. 지질 추출, 10 cm 세포 배양 접시 (10)에 세포를 시드. </li></ol></li><li> 세포 치료 및 오일 레드 O 염색법 <ol><li> 기아 매체의 2 mL를 매체를 교체하고 24 시간 동안 37 ° C에서 품어. 30 mM의 포도당과 100 nM의 인슐린으로 치료. 24 시간 동안 37 ° C 형 문화 인큐베이터에서 그것을 품어. </li><li> 매체를 기음. 2 mL의 PBS의 추가 매체를 씻어 부드럽게 소용돌이 친다; 한 번 반복합니다. </li><li> 고무 밴드와 슬라이드에 커버 슬립을 수정합니다. 외부 표면에 부착 세포를 노출. (단계 150) 전술 한 바와 같이 오일 레드 O 염색을 수행한다. 참고 : 지질 축적의 기초 수준은 혈청 기아 후 높은 포도당 플러스 인슐린 치료를 자극한다. 지질 방울 오일 레드 O 염색으로 가시화된다. </li></ol></li><li> 지질의 측정 <ol><li> 동일한 조건에서 높은 포도당 플러스 인슐린 (단계 2.2.1)와 간세포 치료. 각 10 cm 세포 배양 접시에 PBS 1 ML을 추가합니다. 세포를 긁어하고 100 μL의 분취 단백질 정량 신선한 1.5mL 용량 튜브에 전송되는 새로운 15 mL 유리 튜브로 수확. </li><li> 세포의 나머지 900 μL에 (1, v / V를 2 개) 4 mL의 클로로포름 / 메탄올을 추가합니다. 대략 20 비프 음에 대한 초음파 처리 한 다음 소용돌이 적극적 출시세포의 지질. 2 시간 동안 얼음 혼합물을 품어. 지질 추출 (단계 1.6)을 수행합니다. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Angulo, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medical+progress+-+Nonalcoholic+fatty+liver+disease.">Medical progress - Nonalcoholic fatty liver disease.</a> New England Journal of Medicine. 346 (16), 1221-1231 (2002).</li><li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatic+ATF6+Increases+Fatty+Acid+Oxidation+to+Attenuate+Hepatic+Steatosis+in+Mice+through+Peroxisome+Proliferator-Activated+Receptor+Alpha.">Hepatic ATF6 Increases Fatty Acid Oxidation to Attenuate Hepatic Steatosis in Mice through Peroxisome Proliferator-Activated Receptor Alpha.</a> Diabetes. 65 (7), 1904-1915 (2016).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AMPK+phosphorylates+and+inhibits+SREBP+activity+to+attenuate+hepatic+steatosis+and+atherosclerosis+in+diet-induced+insulin-resistant+mice.">AMPK phosphorylates and inhibits SREBP activity to attenuate hepatic steatosis and atherosclerosis in diet-induced insulin-resistant mice.</a> Cell Metab. 13 (4), 376-388 (2011).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatic+SIRT1+attenuates+hepatic+steatosis+and+controls+energy+balance+in+mice+by+inducing+fibroblast+growth+factor+21.">Hepatic SIRT1 attenuates hepatic steatosis and controls energy balance in mice by inducing fibroblast growth factor 21.</a> Gastroenterology. 146 (2), 539-549 (2014).</li><li>Esau, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-122+regulation+of+lipid+metabolism+revealed+by+in+vivo+antisense+targeting.">miR-122 regulation of lipid metabolism revealed by in vivo antisense targeting.</a> Cell Metabolism. 3 (2), 87-98 (2006).</li><li>Kanda, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MCP-1+contributes+to+macrophage+infiltration+into+adipose+tissue,+insulin+resistance,+and+hepatic+steatosis+in+obesity.">MCP-1 contributes to macrophage infiltration into adipose tissue, insulin resistance, and hepatic steatosis in obesity.</a> Journal of Clinical Investigation. 116 (6), 1494-1505 (2006).</li><li>Cohen, J. C., Horton, J. D., Hobbs, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+fatty+liver+disease:+old+questions+and+new+insights.">Human fatty liver disease: old questions and new insights.</a> Science. 332 (6037), 1519-1523 (2011).</li><li>Hebbard, L., George, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+nonalcoholic+fatty+liver+disease.">Animal models of nonalcoholic fatty liver disease.</a> Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 8 (1), 35-44 (2011).</li><li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+effective+inhibition+of+lung+cancer+growth+and+metastasis+by+systemic+delivery+of+siRNA+via+multimodal+mesoporous+silica-based+nanocarrier.">Highly effective inhibition of lung cancer growth and metastasis by systemic delivery of siRNA via multimodal mesoporous silica-based nanocarrier.</a> Biomaterials. 35 (38), 10058-10069 (2014).</li><li>Gong, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+growth+factor+21+improves+hepatic+insulin+sensitivity+by+inhibiting+mammalian+target+of+rapamycin+complex+1+in+mice.">Fibroblast growth factor 21 improves hepatic insulin sensitivity by inhibiting mammalian target of rapamycin complex 1 in mice.</a> Hepatology. 64 (2), 425-438 (2016).</li><li>Anstee, Q. M., Targher, G., Day, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progression+of+NAFLD+to+diabetes+mellitus,+cardiovascular+disease+or+cirrhosis.">Progression of NAFLD to diabetes mellitus, cardiovascular disease or cirrhosis.</a> Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 10 (6), 330-344 (2013).</li></ol>

저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가 없음을 선언합니다. 자금 조달 :이 작품은 중국 국가 자연 과학 재단 (제 81270930, 31471129 및 31671224)와 백 재능 중국 과학 아카데미의 프로그램 (2013OHTP04) YL에 대한 보조금에 의해 지원되었다

NAFLD 대사 증후군, 비만, 인슐린 내성이나 2 형 당뇨병 (T2DM) 11와 연관된 프로그레시브 간 질환의 시리즈이다. NAFLD의 특징은 지방간, 간세포에 지방의 축적이다. 여기서, 방법의 스펙트럼은 표현형 및 DIO 마우스 및 마우스 차 간세포를 사용하여 간 지방증의 파라미터를 특성화하기 위해 제공된다. 이 절차는 비 알코올성 지방간 질환 및 기타 관련 대사 질환의 분자 메커니즘을 규?...

비만은 선진국과 개발 도상국의 급성장 건강 문제입니다. NAFLD 환자 (1) 30 % 내지 100 범위의 유병률 자주 알코올성 지방 간 질환 (NAFLD)와 연관된 공존하는 조건 중 하나 인 것으로보고되었다. 인해 지방간, 비만의 강한 상관 관계,식이 유도 비만 (DIO) 마우스 모델은 광범위 NAFLD 2, 3, 4, 5, 6의 개발과 관련된 복잡한 분자 메커니즘을 연구하는데 사용된다. 간 지방증은 NAFLD의 초기 단계이며, 비 알코올성 지방 간염 (NASH), 간경변, 궁극적으로 간암 7 진행할 수있다. 따라서,이 방법의 전반적인 목표는 간 steatotic 조건의 동물 및 세포 모델을 생성하고 홍보하는 것입니다효율적이고 정확한 지질 측정 ovide 상세한 프로토콜. 이 모델과 측정은 또한 인슐린 저항성과 제 2 형 당뇨병 등의 대사 질환의 연구에 유용하다. 비만 NAFLD, 고지방위한 중요한 위험 인자 중 하나 인 것으로 확인 된 바와 같이, 높은 크로스 다이어트 서양식 고지방식이를 모방 (HFHS)는 마우스에서 비만을 유도하기 위해 사용된다. 이어서, 간 지방증의 정도는 다양한 방법을 사용하여 평가 될 수있다. 먼저, 체중 및 핵 자기 공명 (NMR)와 신체 조성 분석 시간 동안 먹이 지질 축적을 나타낸다. 지방 질량과 근육량은 비 침습적 실시간 방식으로 정량화 할 수있다. 또한, 자기 공명 영상 (MRI)는 전신 및 지방 간 분포 모두를 표시하기 위해 사용된다. 자기 공명 영상의 분석의 계조 신호는 명료 한 의사 컬러 화상으로 변환하고, 강도 수그레이 스케일과 컬러는 헤미 - 정량화이다. 이 기술은 살아있는 동물에서 지방 축적의 측정에 독특한 이점을 제공한다. 둘째, 간의 조직 학적 분석 간 지방증을 결정하기 위해 가장 많이 사용되는 방법이다. 오일 레드 O 염색은 간세포에서 지질 소적의 크기와 위치를 나타내고있다 Hematoxylin &amp; Eosin 염색 얼룩, 예컨대 간세포 형태와 같은 식세포 침윤 학적 정보를 제공한다. 셋째, 클로로포름 / 메탄올을 사용하여 추출 지질 함량 분석 간 지질의 정확한 정량적 측정이다. 총 트리글리세리드 및 콜레스테롤 수준은 생화학 적 방법으로 측정 할 수있다. 중요한 지질 추출 분석 및 오일 레드 O 염색은 또한 유전자 조작 또는 약학 간세포 치료에 사용될 수있다. 본 방법의 장점은 간 steatotic 모델을 생성하는 여러 최적화 방법의 사용이다 그종합적 생체 내 및 시험관 내에서 모두 표현형을 특성화. DIO 마우스 모델은 인간 지방간 질환의 병리 및 대사 표현형 요점을 되풀이 할 수있다. 인간의 다른 대사 매개 변수가 아니라 8로이 모델에 복제 할 수 있습니다. 높은 포도당 플러스 인슐린에 응답 steatotic 간세포 모델의 생성에 유용하고 효율적이며, 많은 비용과 시간이 소요 마우스 연구의 한계를 극복한다. 함께 찍은, 이러한 방법은 영양 과부하시 간 지질 장애와 인슐린 저항성의 연구에 대한 충분하고 필수적이다.

<table><tbody><tr><td>O.C.T compound</td><td>SAKURA</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Oil Red O</td><td>Sigma</td><td>O0625-25G</td><td></td></tr><tr><td>Infinity Triglycerides kit</td><td>Fisher&amp;nbsp;Scientific</td><td>TR22421</td><td></td></tr><tr><td>Infinity Cholesterol kit</td><td>Fisher&amp;nbsp;Scientific</td><td>TR13421</td><td></td></tr><tr><td>Collagen type I, Rat tail</td><td>Millipore</td><td>08-115</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (low glucose)</td><td>Invitrogen</td><td>11885-092</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin / Streptomycin</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Invitrogen</td><td>10099141</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>cellgro</td><td>R21-040-CVR</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>cellgro</td><td>20-021-CV</td><td></td></tr><tr><td>Insulin</td><td>TOCRIS Bioscience</td><td>3435</td><td>dissolve in PBS, 1 mM for stock</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma</td><td>G8270-100G</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Olympus</td><td>BX53</td><td></td></tr><tr><td>Peristaltic pump</td><td>Longerpump</td><td>BT100-2J</td><td></td></tr><tr><td>10 cm cell culture dish</td><td>Corning</td><td>420167</td><td></td></tr><tr><td>6-well-plate</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>BCA assay</td><td>Beyotime</td><td>P0010</td><td></td></tr><tr><td>Nuclear Magnetic Resonance</td><td>Niumag technology</td><td>MiniQMR23-060H-I</td><td></td></tr><tr><td>High fat high surcose diet (HFHS)</td><td>Research Diets</td><td>D12327</td><td></td></tr></tbody></table>

optimized analysis of in vivo and in vitro hepatic steatosis

Establishing a system of procedures to qualitatively and quantitatively characterize in vivo and in vitro hepatic steatosis is important for metabolic study in the liver. Here, numerous assays are described to comprehensively measure the phenotype and parameters of hepatic steatosis in mouse and hepatocyte models. 
Combining the physiological, histological, and biochemical methods, this system can be used to assess the progress of hepatic steatosis. In vivo, the measurements of body weight and nuclear magnetic resonance (NMR) provide a general understanding of mice in a non-invasive manner. Hematoxylin and Eosin (H&amp;E) and Oil Red O staining determine the histological morphology and lipid deposition of liver tissue under nutrient overload conditions, such as high-fat diet feeding. Next, the total lipid contents are isolated by chloroform/methanol extraction, which are followed by a biochemical analysis for triglyceride and cholesterol. Moreover, mouse primary hepatocytes are treated with high glucose plus insulin to stimulate lipid accumulation, an efficient in vitro model to mimic diet-induced hyperglycemia and hyperinsulinemia in vivo. Then, the lipid deposition is measured by Oil Red O staining and chloroform/methanol extraction. Oil Red O staining determines intuitive hepatic steatotic phenotypes, while the lipid extraction analysis determines the parameters that can be analyzed statistically. The present protocols are of interest to scientists in the fields of fatty liver diseases, insulin resistance, and type 2 diabetes.

도 1a에 도시 된 바와 같이, 마우스의 체중은 약 차우 다이어트 공급 군보다 1.5 배이다 HFHS 공급, 16 주 후에 45 ± 1.2 g으로 증가시켰다. 핵 자기 공명 신체 조성은 지방 질량과 쥐의 근육량을 보여주는 분석하면 (그림 1B) 표시됩니다. 몸 전체와 간장의 지방 분포는 MRI에 의해 결정하고, 라이브, 의식 생쥐의 대표적인 의사 컬러 이미지는 그림 1C-...

Watch this Scientific Journal Video about Optimized Analysis of In Vivo and In Vitro Hepatic Steatosis at JoVE.com

Optimized Analysis of In Vivo and In Vitro Hepatic Steatosis

Here, optimized methods to generate in vivo and in vitro models of hepatic steatosis and to analyze the steatotic phenotypes and related physiological parameters are described.

의 최적화 분석<em&gt; 생체</em&gt; 및<em&gt; 체외</em&gt; 간 지방증

Establishing a system of procedures to qualitatively and quantitatively characterize in vivo and in vitro hepatic steatosis is important for metabolic ...

optimized-analysis-of-in-vivo-and-in-vitro-hepatic-steatosis

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Medicine

Optimized Analysis of In Vivo and In Vitro Hepatic Steatosis

15.8K 조회수.  Chinese Academy of Sciences. Here, optimized methods to generate in vivo and in vitro models of hepatic steatosis and to analyze the steatotic phenotypes and related physiological parameters are described. 

비디오: Optimized Analysis of In Vivo and In Vitro Hepatic Steatosis

Visualization and Analysis of Blood Flow and Oxygen Consumption in Hepatic Microcirculation: Application to an Acute Hepatitis Model

There is a considerable discrepancy between oxygen supply and demand in the liver because hepatic oxygen consumption is relatively high but about 70% of the hepatic blood supply is poorly oxygenated portal vein blood derived from the gastrointestinal tract and spleen. Oxygen is delivered to hepatocytes by blood flowing from a terminal branch of the portal vein to a central venule via sinusoids, and this makes an oxygen gradient in hepatic lobules. The oxygen gradient is an important physical parameter that involves the expression of enzymes upstream and downstream in hepatic microcirculation, but the lack of techniques for measuring oxygen consumption in the hepatic microcirculation has delayed the elucidation of mechanisms relating to oxygen metabolism in liver. We therefore used FITC-labeled erythrocytes to visualize the hepatic microcirculation and used laser-assisted phosphorimetry to measure the partial pressure of oxygen in the microvessels there. Noncontact and continuous optical measurement can quantify blood flow velocities, vessel diameters, and oxygen gradients related to oxygen consumption in the liver. In an acute hepatitis model we made by administering acetaminophen to mice we observed increased oxygen pressure in both portal and central venules but a decreased oxygen gradient in the sinusoids, indicating that hepatocyte necrosis in the pericentral zone could shift the oxygen pressure up and affect enzyme expression in the periportal zone. In conclusion, our optical methods for measuring hepatic hemodynamics and oxygen consumption can reveal mechanisms related to hepatic disease.

An optical system was developed to visualize hepatic microcirculation with FITC-labeled erythrocytes and to measure the partial pressure of oxygen in the microvessels with laser-assisted phosphorimetry. This method can be used to investigate physiological and pathological mechanisms by analyzing microvascular structure, diameter, blood flow velocity, and oxygen tension.

급성 간염 모델 신청 : 시각화와 간장 Microcirculation의 혈류와 산소 소비 분석

There is a considerable discrepancy between oxygen supply and demand in the liver because hepatic oxygen consumption is relatively high but about 70% of ...

연구

의학

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. Here, we describe a general protocol for cell labeling, imaging, and image processing. The technique is applicable to various cell types and animal models, although here we focus on a typical mouse model for tracking murine immune cells. The most important issues for cell labeling are described, as these are relevant to all models. Similarly, key imaging parameters are listed, although the details will vary depending on the MRI system and the individual setup. Finally, we include an image processing protocol for quantification. Variations for this, and other parts of the protocol, are assessed in the Discussion section. Based on the detailed procedure described here, the user will need to adapt the protocol for each specific cell type, cell label, animal model, and imaging setup. Note that the protocol can also be adapted for human use, as long as clinical restrictions are met.

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

We describe a general protocol for in vivo cell tracking using MRI in a mouse model with ex vivo labeled cells. A typical protocol for cell labeling, image acquisition processing and quantification is included.

세포 추적을위한 생체 19 F MRI에서

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. ...

Measurement of Fatty Acid &#946;-Oxidation in a Suspension of Freshly Isolated Mouse Hepatocytes

Fatty acid &#946;-oxidation is a key metabolic pathway to meet the energy demands of the liver and provide substrates and cofactors for additional processes, such as ketogenesis and gluconeogenesis, which are essential to maintain whole-body glucose homeostasis and support extra-hepatic organ function in the fasted state. Fatty acid &#946;-oxidation occurs within the mitochondria and peroxisomes and is regulated through multiple mechanisms, including the uptake and activation of fatty acids, enzyme expression levels, and availability of cofactors such as coenzyme A and NAD+. In assays that measure fatty acid &#946;-oxidation in liver homogenates, cell lysis and the common addition of supraphysiological levels of cofactors mask the effects of these regulatory mechanisms. Furthermore, the integrity of the organelles in the homogenates is hard to control and can vary significantly between preparations. The measurement of fatty acid &#946;-oxidation in intact primary hepatocytes overcomes the above pitfalls. This protocol describes a method for the measurement of fatty acid &#946;-oxidation in a suspension of freshly isolated primary mouse hepatocytes incubated with 14C-labeled palmitic acid. By avoiding hours to days of culture, this method has the advantage of better preserving the protein expression levels and metabolic pathway activity of the original liver, including the activation of fatty acid &#946;-oxidation observed in hepatocytes isolated from fasted mice compared to fed mice.

Fatty acid &#946;-oxidation is an essential metabolic pathway responsible for generating energy in many different cell types, including hepatocytes. Here, we describe a method to measure fatty acid &#946;-oxidation in freshly isolated primary hepatocytes using 14C-labeled palmitic acid.

갓 분리된 마우스 간세포의 현탁액에서의 지방산 β산화의 측정

Fatty acid &#946;-oxidation is a key metabolic pathway to meet the energy demands of the liver and provide substrates and cofactors for additional ...

생화학

3D Fluorescence Lipid Droplet Reconstruction을 통한 간 지방증 평가

Analysis of Fluorescent-Stained Lipid Droplets with 3D Reconstruction for Hepatic Steatosis Assessment

Lipid droplets (LDs) are specialized organelles that mediate lipid storage and play a very important role in suppressing lipotoxicity and preventing dysfunction caused by free fatty acids (FAs). The liver, given its critical role in the body's fat metabolism, is persistently threatened by the intracellular accumulation of LDs in the form of both microvesicular and macrovesicular hepatic steatosis. The histologic characterization of LDs is typically based on lipid-soluble diazo dyes, such as Oil Red O (ORO) staining, but a number of disadvantages consistently hamper the use of this analysis with liver specimens. More recently, lipophilic fluorophores 493/503 have become popular for visualizing and locating LDs due to their rapid uptake and accumulation into the neutral lipid droplet core. Even though most applications are well-described in cell cultures, there is less evidence demonstrating the reliable use of lipophilic fluorophore probes as an LD imaging tool in tissue samples. Herein, we propose an optimized boron dipyrromethene (BODIPY) 493/503-based protocol for the evaluation of LDs in liver specimens from an animal model of high-fat diet (HFD)-induced hepatic steatosis. This protocol covers liver sample preparation, tissue sectioning, BODIPY 493/503 staining, image acquisition, and data analysis. We demonstrate an increased number, intensity, area ratio, and diameter of hepatic LDs upon HFD feeding. Using orthogonal projections and 3D reconstructions, it was possible to observe the full content of neutral lipids in the LD core, which appeared as nearly spherical droplets. Moreover, with the fluorophore BODIPY 493/503, we were able to distinguish microvesicles (1 &#181;m &lt; d &#8804; 3 &#181;m), intermediate vesicles (3 &#181;m &lt; d &#8804; 9 &#181;m), and macrovesicles (d &gt; 9 &#181;m), allowing the successful discrimination of microvesicular and macrovesicular steatosis. Overall, this BODIPY 493/503 fluorescence-based protocol is a reliable and simple tool for hepatic LD characterization and may represent a complementary approach to the classical histological protocols.

저자 스포트라이트: 간 지방증 평가를 위한 3D 재구성을 통한 형광 염색 지질 방울 분석  

Herein, we demonstrate an optimized BODIPY 493/503 fluorescence-based protocol for lipid droplet characterization in liver tissue. Through the use of orthogonal projections and 3D reconstructions, the fluorophore allows for successful discrimination between microvesicular and macrovesicular steatosis and may represent a complementary approach to the classical histological protocols for hepatic steatosis assessment.

간 지방증 평가를 위한 3D 재구성을 통한 형광 염색 지질 방울 분석

Lipid droplets (LDs) are specialized organelles that mediate lipid storage and play a very important role in suppressing lipotoxicity and preventing ...

Inducing and Characterizing Vesicular Steatosis in Differentiated HepaRG Cells

Hepatic steatosis represents a metabolic dysfunction that results from an accumulation of triglyceride-containing lipid droplets in hepatocytes. Excessive fat accumulation leads to non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD), &#160;which is potentially reversible and may evolve into non-alcoholic steatohepatitis (NASH) and eventually cirrhosis and hepatocellular carcinoma (HCC). The molecular mechanisms linking lipid accumulation in hepatocytes with the progression to NASH, irreversible liver damage, fibrosis, cirrhosis, and even HCC still remains unclear. To this end, several in vitro and in vivo models have been developed to elucidate the pathological processes that cause NAFLD. In the present study, we describe a cellular model for the induction of liver vesicular steatosis that consists of DMSO-differentiated human hepatic HepaRG cells treated with the fatty acid salt sodium oleate. Indeed, sodium oleate-treated HepaRG cells accumulate lipid droplets in the cytoplasm and show typical features of steatosis. This in vitro human model represents a valuable alternative to in vivo mice models as well as to the primary human hepatocytes. We also present a comparison of several methods for the quantification and evaluation of fat accumulation in HepaRG cells, including Oil Red O staining, cytofluorimetric Bodipy measurement, metabolic gene expression analysis by qPCR, and coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) microscopy. CARS imaging combines the chemical specificity of Raman spectroscopy, a chemical analysis technique well-known in materials science applications, with the benefits of high-speed, high-resolution non-linear optical microscopies to allow precise quantification of lipid accumulation and lipid droplet dynamics. The establishment of an efficient in vitro model for the induction of vesicular steatosis, alongside an accurate method for the quantification and characterization of lipid accumulation, could lead to the development of early stage diagnosis of NAFLD via the identification of molecular markers, and to the generation of new treatment strategies.

In this study, we describe a detailed protocol for inducing liver vesicular steatosis in differentiated HepaRG cells with the fatty acid salt sodium oleate and employ methods for detection and quantification of lipid accumulation, including coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) microscopy, cytofluorimetric analysis, Oil red O staining, and qPCR.&#160;

분화된 HepaRG 세포에서 베아토시스 유도 및 특성화

Hepatic steatosis represents a metabolic dysfunction that results from an accumulation of triglyceride-containing lipid droplets in hepatocytes. Excessive ...

Determination of Fatty Acid Oxidation and Lipogenesis in Mouse Primary Hepatocytes

Lipid metabolism in liver is complex. In addition to importing and exporting lipid via lipoproteins, hepatocytes can oxidize lipid via fatty acid oxidation, or alternatively, synthesize new lipid via de novo lipogenesis. The net sum of these pathways is dictated by a number of factors, which in certain disease states leads to fatty liver disease. Excess hepatic lipid accumulation is associated with whole body insulin resistance and coronary heart disease. Tools to study lipid metabolism in hepatocytes are useful to understand the role of hepatic lipid metabolism in certain metabolic disorders.
In the liver, hepatocytes regulate the breakdown and synthesis of fatty acids via &#946;-fatty oxidation and de novo lipogenesis, respectively. Quantifying metabolism in these pathways provides insight into hepatic lipid handling. Unlike in vitro quantification, using primary hepatocytes, making measurements in vivo is technically challenging and resource intensive. Hence, quantifying &#946;-fatty acid oxidation and de novo lipogenesis in cultured mouse hepatocytes provides a straight forward method to assess hepatocyte lipid handling. 
Here we describe a method for the isolation of primary mouse hepatocytes, and we demonstrate quantification of &#946;-fatty acid oxidation and de novo lipogenesis, using radiolabeled substrates.

De novo lipogenesis and &#946;-fatty acid oxidation constitute key metabolic pathways in hepatocyte, pathways that are perturbed in several metabolic disorders, including fatty liver disease. Here we demonstrate isolation of mouse primary hepatocytes and describe quantification of &#946;-fatty acid oxidation and lipogenesis.

마우스 차 간세포에서 지방산 산화 및 지방 생성의 결정

Lipid metabolism in liver is complex. In addition to importing and exporting lipid via lipoproteins, hepatocytes can oxidize lipid via fatty acid ...

생물학

A Model of Experimental Steatosis In Vitro: Hepatocyte Cell Culture in Lipid Overload-Conditioned Medium

Metabolic dysfunction-associated fatty liver disease (MAFLD), previously known as non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD), is the most prevalent liver disease worldwide due to its relationship with obesity, diabetes type 2, and dyslipidemia. Hepatic steatosis, the accumulation of lipid droplets in the liver parenchyma, is a key feature of the disease preceding the inflammation observed in steatohepatitis, fibrosis, and end-stage liver disease. Lipid accumulation in hepatocytes might interfere with proper metabolism of xenobiotics and endogenous molecules, as well as to induce cellular processes leading to the advance of the disease. Although the experimental study of steatosis can be performed in vivo, in vitro approaches to the study of steatosis are complementary tools with different advantages. Hepatocyte culture in lipid overload-conditioned medium is an excellent reproducible option for the study of hepatic steatosis allowing the identification of cellular processes related to lipid accumulation, such as oxidative and reticular stresses, autophagia, proliferation, cell death, etcetera, as well as other testing including drug effectiveness, and toxicological testing, among many other possible applications. Here, it was aimed to describe the methodology of hepatocyte cell culture in lipid overload-conditioned medium. HepG2 cells were cultured in RMPI 1640 medium conditioned with sodium palmitate and sodium oleate. Importantly, the ratio of these two lipids is crucial to favor lipid droplet accumulation, while maintaining cell proliferation and a moderate mortality rate, as occurs in the liver during the disease. The methodology, from the preparation of the lipid solution stocks, mixture, addition to the medium, and hepatocyte culture is shown. With this approach, it is possible to identify lipid droplets in the hepatocytes that are readily observable by Oil-red O staining, as well as curves of proliferation/mortality rates.

A Model of Experimental Steatosis In Vitro: Hepatocyte Cell Culture in Lipid Overload-Conditioned Medium

This protocol is intended to be a tool to study steatosis and the molecular, biochemical, cellular changes produced by the over exposure of hepatocytes to lipids in vitro.

시험관내실험용 스테토시스 모델 : 지질 과부하 조절 배지의 간세포 배양

Metabolic dysfunction-associated fatty liver disease (MAFLD), previously known as non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD), is the most prevalent liver ...

Novel In Vivo Micro-Computed Tomography Imaging Techniques for Assessing the Progression of Non-Alcoholic Fatty Liver Disease

Non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) is a growing global health issue, and the impact of NAFLD is compounded by the current lack of effective treatments. Considerable limiting factors hindering the timely and accurate diagnosis (including grading) and monitoring of NAFLD, as well as the development of potential therapies, are the current inadequacies in the characterization of the hepatic microenvironment structure and the scoring of the disease stage in a spatiotemporal and non-invasive manner. Using a diet-induced NAFLD mouse model, we investigated the use of in vivo micro-computed tomography (CT) imaging techniques as a non-invasive method to assess the progression stages of NAFLD, focusing predominantly on the hepatic vascular network due to its significant involvement in NAFLD-related hepatic dysregulation. This imaging methodology allows for longitudinal analysis of liver steatosis and functional tissue uptake, as well as the evaluation of the relative blood volume, portal vein diameter, and density of the vascular network. Understanding the adaptations of the hepatic vascular network during NAFLD progression and correlating this with other ways of characterizing the disease progression (steatosis, inflammation, fibrosis) using the proposed method can pave the way toward the establishment of new, more efficient, and reproducible approaches for NAFLD research in mice. This protocol is also expected to upgrade the value of preclinical animal models for investigating&#160;the development of novel therapies against disease progression.

Novel In Vivo Micro-Computed Tomography Imaging Techniques for Assessing the Progression of Non-Alcoholic Fatty Liver Disease

Using a diet-induced non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) mouse model, we describe the use of novel in vivo micro-computed tomography imaging techniques as a non-invasive method to assess the progression stages of NAFLD, focusing predominantly on the hepatic vascular network due to its significant involvement in NAFLD-related hepatic dysregulation.

의 최적화 분석

요약

더 많은 비디오 탐색

이 비디오의 챕터

급성 간염 모델 신청 : 시각화와 간장 Microcirculation의 혈류와 산소 소비 분석

세포 추적을위한 생체 ¹⁹ F MRI에서

갓 분리된 마우스 간세포의 현탁액에서의 지방산 β산화의 측정

간 지방증 평가를 위한 3D 재구성을 통한 형광 염색 지질 방울 분석

간 지방증 평가를 위한 3D 재구성을 통한 형광 염색 지질 방울 분석

간 지방증 평가를 위한 3D 재구성을 통한 형광 염색 지질 방울 분석

분화된 HepaRG 세포에서 베아토시스 유도 및 특성화

마우스 차 간세포에서 지방산 산화 및 지방 생성의 결정

시험관내실험용 스테토시스 모델 : 지질 과부하 조절 배지의 간세포 배양

비알코올성 지방간 질환의 진행을 평가하기 위한 새로운 생체 내 미세 컴퓨터 단층 촬영 이미징 기술