We appreciate Feifei Zhang for the helpful discussions. We are grateful to Jing Gao and Yixuan Sun for the technical assistance and to Zhengshuai Liu and Fengguang Ma for the animal studies.

Tutti i protocolli sperimentali su animali sono stati approvati dal comitato di cura degli animali e uso istituzionale presso l&#39;Istituto di Scienze dell&#39;Alimentazione, Istituti di Shanghai per Scienze Biologiche, Accademia Cinese delle Scienze (Shanghai, Cina). 1. DIO modello murino <ol><li> alimentazione HFHS <ol><li> Feed the otto settimane di età maschile C57BL / 6 topi con una HFHS che contiene 40 kcal% di grassi e 40 kcal% di saccarosio. loro casa a 12 h Condizioni ciclo dark-light. </li><li> Mantenere i topi in HFHS condizione di dieta al seno per quattro a sedici settimane. Controllare il settimanale del peso corporeo. </li></ol></li><li> Analisi della composizione corporea e analisi delle immagini pseudo-color <ol><li> Sottoporre i topi a una analisi della composizione corporea analizzatore. <ol><li> Fissare cosciente, topi non anestetizzati in un tubo di plastica nel. Misurare la massa grassa, massa magra, e fluidi che utilizzano un sistema di NMR, come descritto in precedenza 2. </li></ol></li><li> Eseguire la scansione di tutto il corpo di ogni mouse utilizzando un sistema di risonanza magnetica. <ol><li> Anestetizzare i topi con 1% avertin tramite iniezione intraperitoneale (25 ml / g) ed eseguire l&#39;analisi di imaging in tubi di vetro specializzati. NOTA: Il processo di formazione immagine ha una durata di circa 0,5 ore per ogni mouse. Quando la misurazione è completata, restituire i topi per gabbia. </li></ol></li><li> Eseguire la scansione l&#39;intero corpo dei topi in dorsale centrale, e gli strati ventrale; scandire il fegato in direzione verticale. Utilizzare un magnete 0,55 T e dei seguenti parametri strumentali: spazio K = 192 x 256 micron, lo spessore della sezione = 3 mm, TE = 14,8 ms, TR = 400 ms, FOVRead = 100 mm, FOVPhase = 100 mm, e il numero di scansioni = 8. scansione utilizzando la stessa condizione magnetica per i tutti i gruppi di topi. </li><li> Mappa scala di grigio dell&#39;immagine una pseudo-colore sul secondo l&#39;intensità del segnale 9. </li></ol></li><li> l&#39;eutanasia del mouse <ol><li> sterilizzare dissectistrumenti NG, come pinze e forbici. </li><li> Versare isoflurano sufficienti su un tovagliolo di carta e lasciare che il isoflurano volatilizza in un barattolo di vetro. Assicurarsi che i topi sono eutanasia dal isoflurano. </li><li> Fissare i topi su un tavolo operatorio. Spruzzare ogni addome con 75% etanolo, fare un&#39;incisione nel derma del processo xifoideo con le forbici, e strappare il derma longitudinalmente attraverso la linea mediana con le mani per esporre il peritoneo. </li><li> Bloccare il processo xifoideo con una pinza e tagliare il peritoneo in larghezza attraverso il fondo delle nervature per esporre le viscere. </li><li> Prelevare il sangue in provette EDTA rivestite mediante puntura cardiaca. </li><li> Tagliare il diaframma lungo il fegato e rimuovere con attenzione il fegato dai enterocoelia con le forbici sottili. Tagliare tre pezzi di tessuto epatico per le seguenti misure lipidi: a) 6 x 3 x 3 mm per H &amp; E colorazione, b) 6 x 3 x 3 mm per Oil Red O colorazione, e c) 20-40 mg di fegato per il cloroformio / l&#39;estrazione metanolo. </li></ol></li><li> Colorazione H &amp; E <ol><li> Fissare il fegato in 4% tampone fosfato di formalina acetato a 4 ° C durante la notte e poi incorporare in paraffina. </li><li> Tagliare sezioni di paraffina (5 micron) e montare su vetrini per colorazione H &amp; E, come precedentemente descritto 3, 10. </li></ol></li><li> Oil Red O colorazione <ol><li> preparazione Regent <ol><li> Preparare la soluzione di lavoro Oil Red O con formalina al 10%, il 60% di isopropanolo, ematossilina, e gelatina glicerolo. Sciogliere 0.5 g di Oil Red O polvere con 100 ml di isopropanolo e riscaldare in un bagno a 60 ° C per ottenere una soluzione stock di 0,5%. </li><li> Diluire con acqua bidistillata (DDH 2 O) in un rapporto 3: 2 (3 ml di soluzione madre e 2 ml di DDH 2 O). Filtrare la soluzione di lavoro e lasciate riposare per almeno 10 minuti a temperatura ambiente. </li></ol></li><li> Incorpora il fegato di temperatura di taglio ottimale (OCT) composto in apscatola incasso lastic. Congelarlo a -20 ° C per 30 min. Tagliare in sezioni di 8 micron di un microtomo di congelamento, montare il tessuto su un vetrino, e metterlo a temperatura ambiente per 30 min. </li><li> Posizionare un tovagliolo di carta sul fondo di una vasca di colorazione e versare una piccola quantità di formalina al 10% di bagnare l&#39;asciugamano di carta. Posizionare il vetrino nella colorazione vasca e fissare le sezioni congelate in vapori di formaldeide per 5 minuti a 4 ° C. </li><li> Immergere il vetrino nel 60% isopropanolo nella vasca colorazione per 3 s; ripetere una volta. </li><li> Aggiungere poche gocce di soluzione di lavoro Oil Red O alla diapositiva per coprire tutto il tessuto e incubare per 15 min. Proteggere i tessuti dalla luce a temperatura ambiente. </li><li> Lavare il vetrino in nuova isopropanolo 60% nella vasca colorazione per 3 s; ripetere due volte. </li><li> Lavare delicatamente il vetrino con acqua distillata due volte e rimuovere l&#39;acqua in tutto il tessuto. Assicurarsi di non asciugare il tessuto. </li><li> Posizionare il vetrino in ematossilina per 1 min e risciacquare delicatamente con acqua corrente per 5-10min. Lavare delicatamente il vetrino in acqua distillata due volte e mantenere l&#39;in acqua distillata fino al momento di mettere sul vetrino. </li><li> Riscaldare la gelatina glicerolo nel microonde e mettere alcune gocce sulla parte superiore del tessuto. Posizionare delicatamente il coprioggetto sulla parte superiore e fare attenzione a non formare bolle. </li><li> Osservare la macchia sotto un microscopio e catturare immagini caratteristici utilizzando 20X e 40X obiettivi. </li></ol></li><li> Dosaggio dei lipidi del fegato <ol><li> Posizionare il tessuto epatico sezionato in una nuova provetta da centrifuga 2 mL di plastica. Omogeneizzare in 1 mL di PBS con un omogeneizzatore e trasferire il lisato in un tubo di vetro da 15 ml. </li><li> Aggiungere 5 ml di cloroformio / metanolo (2: 1, v / v), vortex la miscela vigorosamente per 1 minuto, e lasciate riposare per 2 ore sul ghiaccio. </li><li> Centrifugare a 1.650 xg per 10 min a 4 ° C; la miscela deve separare in 3 strati: lo strato superiore metanolo, il disco proteine ​​centrale, e il cloroformio inferiore e lipidi. </li><li> Tran<html> SFER la fase di fondo in un nuovo tubo di vetro con una lente di Pasteur pipetta; non vi è alcuna necessità di ottenere ogni goccia della frazione inferiore. Impostare il tubo da parte su ghiaccio. </li><li> Aggiungere 600 ml di 4 mM MgCl 2 e 1,5 mL di cloroformio alla frazione supernatante sinistra nel tubo precedente e agitare vigorosamente. Incubare in ghiaccio per 30 minuti e centrifugare a 1.650 xg per 10 min a 4 ° C. </li><li> Unire la fase di fondo con il primo tubo fase di fondo utilizzando Pasteur pipetta. Eliminare gli strati superiori e medie. </li><li> Si evapora il cloroformio sotto azoto in un bagno a 37 ° C. Lavare i lati dei tubi di vetro a fondo con 200 ml di 1% Triton X-100 / cloroformio (v / v). Far evaporare sotto azoto. Sciogliere il lipidico con 200 ml di DDH 2 O e vortice bene a fare l&#39;emulsione finale. </li><li> Misurare la trigliceridi totali (TG) e colesterolo (TC) livelli utilizzando un trigliceride o colesterolo kit secondo il protocollo del produttorexref &quot;&gt; 3. NOTA: I valori lipidici sono normalizzati a quelli delle concentrazioni di proteine in omogenato iniziale, come determinato dalla proteina quantificazione 3. </li></ol></li></ol> Modello 2. principale del mouse epatociti <ol><li> L&#39;isolamento di epatociti primari di topo <ol><li> Anestetizzare ogni mouse con il 6% cloralio idrato (10 ml / g per via intraperitoneale). </li><li> Isolare epatociti primari, come descritto in precedenza 10. Crescere le cellule su vetrini collagene rivestite in un 6-pozzetti per Oil Red O colorazione. Per l&#39;estrazione dei lipidi, seminare le cellule su un 10-cm coltura cellulare piatto 10. </li></ol></li><li> Trattamento con cellule e Oil Red O colorazione <ol><li> Sostituire il mezzo con 2 mL di terreno fame e incubare a 37 ° C per 24 h. Trattare con 30 mM glucosio e di insulina 100 nM. Incubare a 37 ° C cultura incubatore per 24 h. </li><li> Aspirare il mezzo. Aggiungere 2 ml di PBS e miscelare delicatamente per sciacquare il medium; ripetere una volta. </li><li> Fissare il vetrino alla slitta con un elastico. Esporre le cellule aderenti alla superficie esterna. Eseguire la colorazione Oil Red O come descritto sopra (punto 1.5). NOTA: I livelli basali di accumulo di lipidi vengono stimolati con un elevato glucosio più trattamento insulina dopo deprivazione di siero. Le gocce lipidiche vengono visualizzati con Oil Red O colorazione. </li></ol></li><li> Dosaggio dei lipidi <ol><li> Trattare gli epatociti con alte concentrazioni di glucosio più insulina nella stessa condizione (punto 2.2.1). Aggiungere 1 ml di soluzione salina in ogni 10 cm piatto di coltura cellulare. Raschiare le cellule e li raccolgono in nuovi tubi di vetro da 15 ml, da cui aliquote di 100 microlitri vengono trasferiti ai tubi freschi 1.5 mL per la quantificazione delle proteine. </li><li> Aggiungere 4 mL di cloroformio / metanolo (2: 1, v / v) al residuo 900 ml di cellule. Con ultrasuoni per circa il 20 emette un segnale acustico e poi vortice vigorosamente per liberarei lipidi nelle cellule. Incubare la miscela in ghiaccio per 2 ore. Eseguire l&#39;estrazione dei lipidi (passo 1,6). </li></ol></li></ol>

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	<li>Angulo, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medical+progress+-+Nonalcoholic+fatty+liver+disease.">Medical progress - Nonalcoholic fatty liver disease.</a> New England Journal of Medicine. 346 (16), 1221-1231 (2002).</li><li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatic+ATF6+Increases+Fatty+Acid+Oxidation+to+Attenuate+Hepatic+Steatosis+in+Mice+through+Peroxisome+Proliferator-Activated+Receptor+Alpha.">Hepatic ATF6 Increases Fatty Acid Oxidation to Attenuate Hepatic Steatosis in Mice through Peroxisome Proliferator-Activated Receptor Alpha.</a> Diabetes. 65 (7), 1904-1915 (2016).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AMPK+phosphorylates+and+inhibits+SREBP+activity+to+attenuate+hepatic+steatosis+and+atherosclerosis+in+diet-induced+insulin-resistant+mice.">AMPK phosphorylates and inhibits SREBP activity to attenuate hepatic steatosis and atherosclerosis in diet-induced insulin-resistant mice.</a> Cell Metab. 13 (4), 376-388 (2011).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatic+SIRT1+attenuates+hepatic+steatosis+and+controls+energy+balance+in+mice+by+inducing+fibroblast+growth+factor+21.">Hepatic SIRT1 attenuates hepatic steatosis and controls energy balance in mice by inducing fibroblast growth factor 21.</a> Gastroenterology. 146 (2), 539-549 (2014).</li><li>Esau, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-122+regulation+of+lipid+metabolism+revealed+by+in+vivo+antisense+targeting.">miR-122 regulation of lipid metabolism revealed by in vivo antisense targeting.</a> Cell Metabolism. 3 (2), 87-98 (2006).</li><li>Kanda, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MCP-1+contributes+to+macrophage+infiltration+into+adipose+tissue,+insulin+resistance,+and+hepatic+steatosis+in+obesity.">MCP-1 contributes to macrophage infiltration into adipose tissue, insulin resistance, and hepatic steatosis in obesity.</a> Journal of Clinical Investigation. 116 (6), 1494-1505 (2006).</li><li>Cohen, J. C., Horton, J. D., Hobbs, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+fatty+liver+disease:+old+questions+and+new+insights.">Human fatty liver disease: old questions and new insights.</a> Science. 332 (6037), 1519-1523 (2011).</li><li>Hebbard, L., George, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+nonalcoholic+fatty+liver+disease.">Animal models of nonalcoholic fatty liver disease.</a> Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 8 (1), 35-44 (2011).</li><li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+effective+inhibition+of+lung+cancer+growth+and+metastasis+by+systemic+delivery+of+siRNA+via+multimodal+mesoporous+silica-based+nanocarrier.">Highly effective inhibition of lung cancer growth and metastasis by systemic delivery of siRNA via multimodal mesoporous silica-based nanocarrier.</a> Biomaterials. 35 (38), 10058-10069 (2014).</li><li>Gong, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+growth+factor+21+improves+hepatic+insulin+sensitivity+by+inhibiting+mammalian+target+of+rapamycin+complex+1+in+mice.">Fibroblast growth factor 21 improves hepatic insulin sensitivity by inhibiting mammalian target of rapamycin complex 1 in mice.</a> Hepatology. 64 (2), 425-438 (2016).</li><li>Anstee, Q. M., Targher, G., Day, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progression+of+NAFLD+to+diabetes+mellitus,+cardiovascular+disease+or+cirrhosis.">Progression of NAFLD to diabetes mellitus, cardiovascular disease or cirrhosis.</a> Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 10 (6), 330-344 (2013).</li></ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti. Finanziamento: Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal National Science Foundation naturale della Cina (n ° 81.270.930, 31.471.129, e 31.671.224) e le cento talenti del programma della Accademia Cinese delle Scienze (2013OHTP04) a YL

NAFLD è una serie di malattie epatiche progressive che è associato con la sindrome metabolica, l&#39;obesità, insulino-resistenza, o diabete mellito tipo 2 (DM2) 11. Il segno distintivo di NAFLD è steatosi, l&#39;accumulo di lipidi negli epatociti. Qui, uno spettro di metodi è presentata per caratterizzare i fenotipi e parametri di steatosi epatica utilizzando topi DIO e epatociti del mouse primarie. Questa procedura potrebbe essere utile per chiarire i meccanismi molecolari di NAFLD e altre...

L&#39;obesità è un problema di salute in rapida crescita nei paesi sviluppati e in via di sviluppo. E &#39;stato segnalato per essere una delle condizioni coesistenti frequentemente associati con steatosi epatica non alcolica (NAFLD), con una prevalenza che varia tra il 30 e il 100 per cento in pazienti con NAFLD 1. A causa della forte correlazione tra il fegato grasso e l&#39;obesità, obesi (DIO) modelli murini di dieta-indotta sono ampiamente utilizzati per studiare i meccanismi molecolari complessi associati con lo sviluppo di NAFLD 2, 3, 4, 5, 6. Steatosi epatica è il primo stadio della NAFLD, e può progredire a steatoepatite non alcolica (NASH), cirrosi, e in ultima analisi, il cancro del fegato 7. Pertanto, l&#39;obiettivo generale di questo metodo è quello di generare modelli animali e cellulari di condizioni steatosico epatiche e al PrOvide protocolli dettagliati per la misurazione dei lipidi efficiente ed accurato. Questi modelli e misure sono utili anche per la ricerca di altri disordini metabolici, come la resistenza all&#39;insulina e diabete di tipo 2. Come l&#39;obesità è identificato come uno dei principali fattori di rischio per la NAFLD, un alto contenuto di grassi, ad alto saccarosio dieta (HFHS) che imita la dieta ricca di grassi di tipo occidentale è usato per indurre l&#39;obesità nei topi. Successivamente, il grado di steatosi epatica può essere valutata con metodi diversi. In primo luogo, il peso corporeo e analisi della composizione corporea con risonanza magnetica nucleare (NMR) mostrano l&#39;accumulo di lipidi durante il tempo di alimentazione. La massa grassa e massa magra possono essere quantificati in modo non invasivo e in tempo reale. Inoltre, la risonanza magnetica (MRI) viene utilizzata sia per il corpo intero e la distribuzione fegato grasso. Il segnale scala di grigi dell&#39;analisi MRI può essere convertito un&#39;immagine pseudo-colori leggibile in, e l&#39;intensità dellala scala di grigi e colore è emi-quantificabile. Questa tecnologia offre vantaggi unici per la misurazione di accumulo di lipidi di animali vivi. In secondo luogo, l&#39;analisi istologica del fegato è il metodo più comunemente utilizzato per determinare steatosi epatica. Ematossilina ed eosina (H &amp; E) colorazione istologica fornisce informazioni, quali epatociti morfologia e infiltrazione di macrofagi, mentre Oil Red O colorazione mostra la dimensione e la posizione delle goccioline lipidiche in epatociti. In terzo luogo, l&#39;analisi del contenuto di lipidi utilizzando estrazione con cloroformio / metanolo è una misurazione accurata e quantitativa dei lipidi epatici. Totale livelli di trigliceridi e di colesterolo possono essere misurati con metodi biochimici. È importante sottolineare che l&#39;analisi estrazione dei lipidi e Oil Red O colorazione possono essere utilizzati anche in geneticamente manipolato o trattato farmaceuticamente epatociti. Il vantaggio del presente metodo è la sua utilizzazione di approcci multipli ottimizzati per generare modelli steatosico epatichee caratterizzare completo fenotipi sia in vivo che in vitro. I modelli DIO mouse possono ricapitolare i patologia e metaboliche fenotipi di malattia del fegato grasso umano. Altri parametri metabolici negli esseri umani possono essere replicati in questo modello, come pure 8. La generazione del modello epatociti steatosico in risposta ad alta glucosio più insulina è efficiente, utile, e supera la limitazione del lavoro costoso e richiede tempo mouse. Nel loro insieme, questi metodi sono sufficienti ed essenziali per lo studio della disfunzione epatica lipidi e insulino-resistenza durante sovraccarico di nutrienti.

<table><tbody><tr><td>O.C.T compound</td><td>SAKURA</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Oil Red O</td><td>Sigma</td><td>O0625-25G</td><td></td></tr><tr><td>Infinity Triglycerides kit</td><td>Fisher&amp;nbsp;Scientific</td><td>TR22421</td><td></td></tr><tr><td>Infinity Cholesterol kit</td><td>Fisher&amp;nbsp;Scientific</td><td>TR13421</td><td></td></tr><tr><td>Collagen type I, Rat tail</td><td>Millipore</td><td>08-115</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (low glucose)</td><td>Invitrogen</td><td>11885-092</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin / Streptomycin</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Invitrogen</td><td>10099141</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>cellgro</td><td>R21-040-CVR</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>cellgro</td><td>20-021-CV</td><td></td></tr><tr><td>Insulin</td><td>TOCRIS Bioscience</td><td>3435</td><td>dissolve in PBS, 1 mM for stock</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma</td><td>G8270-100G</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Olympus</td><td>BX53</td><td></td></tr><tr><td>Peristaltic pump</td><td>Longerpump</td><td>BT100-2J</td><td></td></tr><tr><td>10 cm cell culture dish</td><td>Corning</td><td>420167</td><td></td></tr><tr><td>6-well-plate</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>BCA assay</td><td>Beyotime</td><td>P0010</td><td></td></tr><tr><td>Nuclear Magnetic Resonance</td><td>Niumag technology</td><td>MiniQMR23-060H-I</td><td></td></tr><tr><td>High fat high surcose diet (HFHS)</td><td>Research Diets</td><td>D12327</td><td></td></tr></tbody></table>

optimized analysis of in vivo and in vitro hepatic steatosis

Establishing a system of procedures to qualitatively and quantitatively characterize in vivo and in vitro hepatic steatosis is important for metabolic study in the liver. Here, numerous assays are described to comprehensively measure the phenotype and parameters of hepatic steatosis in mouse and hepatocyte models. 
Combining the physiological, histological, and biochemical methods, this system can be used to assess the progress of hepatic steatosis. In vivo, the measurements of body weight and nuclear magnetic resonance (NMR) provide a general understanding of mice in a non-invasive manner. Hematoxylin and Eosin (H&amp;E) and Oil Red O staining determine the histological morphology and lipid deposition of liver tissue under nutrient overload conditions, such as high-fat diet feeding. Next, the total lipid contents are isolated by chloroform/methanol extraction, which are followed by a biochemical analysis for triglyceride and cholesterol. Moreover, mouse primary hepatocytes are treated with high glucose plus insulin to stimulate lipid accumulation, an efficient in vitro model to mimic diet-induced hyperglycemia and hyperinsulinemia in vivo. Then, the lipid deposition is measured by Oil Red O staining and chloroform/methanol extraction. Oil Red O staining determines intuitive hepatic steatotic phenotypes, while the lipid extraction analysis determines the parameters that can be analyzed statistically. The present protocols are of interest to scientists in the fields of fatty liver diseases, insulin resistance, and type 2 diabetes.

Come mostrato in figura 1A, il peso del corpo del mouse è stato aumentato a 45 ± 1,2 g dopo 16 settimane di HFHS alimentazione, che è circa 1,5 volte superiore rispetto al gruppo di alimentazione dieta chow. La composizione corporea NMR analisi mostra la massa grassa e massa magra di topi sono indicati (Figura 1B). Le distribuzioni di grasso del corpo e del fegato sono state determinate mediante MRI, e immagini rappresentative pseudo-colori in vivo, t...

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Optimized Analysis of In Vivo and In Vitro Hepatic Steatosis

Here, optimized methods to generate in vivo and in vitro models of hepatic steatosis and to analyze the steatotic phenotypes and related physiological parameters are described.

Analisi ottimizzata delle<em&gt; In Vivo</em&gt; e<em&gt; In Vitro</em&gt; Epatica steatosi

Establishing a system of procedures to qualitatively and quantitatively characterize in vivo and in vitro hepatic steatosis is important for metabolic ...

optimized-analysis-of-in-vivo-and-in-vitro-hepatic-steatosis

Universidad de Cartagena UDEC

Research

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Medicine

Optimized Analysis of In Vivo and In Vitro Hepatic Steatosis

15.8K Views.  Chinese Academy of Sciences. Here, optimized methods to generate in vivo and in vitro models of hepatic steatosis and to analyze the steatotic phenotypes and related physiological parameters are described. 

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Visualization and Analysis of Blood Flow and Oxygen Consumption in Hepatic Microcirculation: Application to an Acute Hepatitis Model

There is a considerable discrepancy between oxygen supply and demand in the liver because hepatic oxygen consumption is relatively high but about 70% of the hepatic blood supply is poorly oxygenated portal vein blood derived from the gastrointestinal tract and spleen. Oxygen is delivered to hepatocytes by blood flowing from a terminal branch of the portal vein to a central venule via sinusoids, and this makes an oxygen gradient in hepatic lobules. The oxygen gradient is an important physical parameter that involves the expression of enzymes upstream and downstream in hepatic microcirculation, but the lack of techniques for measuring oxygen consumption in the hepatic microcirculation has delayed the elucidation of mechanisms relating to oxygen metabolism in liver. We therefore used FITC-labeled erythrocytes to visualize the hepatic microcirculation and used laser-assisted phosphorimetry to measure the partial pressure of oxygen in the microvessels there. Noncontact and continuous optical measurement can quantify blood flow velocities, vessel diameters, and oxygen gradients related to oxygen consumption in the liver. In an acute hepatitis model we made by administering acetaminophen to mice we observed increased oxygen pressure in both portal and central venules but a decreased oxygen gradient in the sinusoids, indicating that hepatocyte necrosis in the pericentral zone could shift the oxygen pressure up and affect enzyme expression in the periportal zone. In conclusion, our optical methods for measuring hepatic hemodynamics and oxygen consumption can reveal mechanisms related to hepatic disease.

An optical system was developed to visualize hepatic microcirculation with FITC-labeled erythrocytes and to measure the partial pressure of oxygen in the microvessels with laser-assisted phosphorimetry. This method can be used to investigate physiological and pathological mechanisms by analyzing microvascular structure, diameter, blood flow velocity, and oxygen tension.

Visualizzazione e analisi del flusso ematico e consumo di ossigeno nella microcircolazione epatica: Applicazione di un modello di epatite acuta

There is a considerable discrepancy between oxygen supply and demand in the liver because hepatic oxygen consumption is relatively high but about 70% of ...

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Medicina

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. Here, we describe a general protocol for cell labeling, imaging, and image processing. The technique is applicable to various cell types and animal models, although here we focus on a typical mouse model for tracking murine immune cells. The most important issues for cell labeling are described, as these are relevant to all models. Similarly, key imaging parameters are listed, although the details will vary depending on the MRI system and the individual setup. Finally, we include an image processing protocol for quantification. Variations for this, and other parts of the protocol, are assessed in the Discussion section. Based on the detailed procedure described here, the user will need to adapt the protocol for each specific cell type, cell label, animal model, and imaging setup. Note that the protocol can also be adapted for human use, as long as clinical restrictions are met.

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

We describe a general protocol for in vivo cell tracking using MRI in a mouse model with ex vivo labeled cells. A typical protocol for cell labeling, image acquisition processing and quantification is included.

In vivo 19 F MRI per il tracciamento cellulare

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. ...

Measurement of Fatty Acid &#946;-Oxidation in a Suspension of Freshly Isolated Mouse Hepatocytes

Fatty acid &#946;-oxidation is a key metabolic pathway to meet the energy demands of the liver and provide substrates and cofactors for additional processes, such as ketogenesis and gluconeogenesis, which are essential to maintain whole-body glucose homeostasis and support extra-hepatic organ function in the fasted state. Fatty acid &#946;-oxidation occurs within the mitochondria and peroxisomes and is regulated through multiple mechanisms, including the uptake and activation of fatty acids, enzyme expression levels, and availability of cofactors such as coenzyme A and NAD+. In assays that measure fatty acid &#946;-oxidation in liver homogenates, cell lysis and the common addition of supraphysiological levels of cofactors mask the effects of these regulatory mechanisms. Furthermore, the integrity of the organelles in the homogenates is hard to control and can vary significantly between preparations. The measurement of fatty acid &#946;-oxidation in intact primary hepatocytes overcomes the above pitfalls. This protocol describes a method for the measurement of fatty acid &#946;-oxidation in a suspension of freshly isolated primary mouse hepatocytes incubated with 14C-labeled palmitic acid. By avoiding hours to days of culture, this method has the advantage of better preserving the protein expression levels and metabolic pathway activity of the original liver, including the activation of fatty acid &#946;-oxidation observed in hepatocytes isolated from fasted mice compared to fed mice.

Fatty acid &#946;-oxidation is an essential metabolic pathway responsible for generating energy in many different cell types, including hepatocytes. Here, we describe a method to measure fatty acid &#946;-oxidation in freshly isolated primary hepatocytes using 14C-labeled palmitic acid.

Misurazione della β-ossidazione degli acidi grassi in una sospensione di epatociti di topo appena isolati

Fatty acid &#946;-oxidation is a key metabolic pathway to meet the energy demands of the liver and provide substrates and cofactors for additional ...

Biochimica

Valutazione della steatosi epatica con la ricostruzione di goccioline lipidiche a fluorescenza 3D

Analysis of Fluorescent-Stained Lipid Droplets with 3D Reconstruction for Hepatic Steatosis Assessment

Lipid droplets (LDs) are specialized organelles that mediate lipid storage and play a very important role in suppressing lipotoxicity and preventing dysfunction caused by free fatty acids (FAs). The liver, given its critical role in the body's fat metabolism, is persistently threatened by the intracellular accumulation of LDs in the form of both microvesicular and macrovesicular hepatic steatosis. The histologic characterization of LDs is typically based on lipid-soluble diazo dyes, such as Oil Red O (ORO) staining, but a number of disadvantages consistently hamper the use of this analysis with liver specimens. More recently, lipophilic fluorophores 493/503 have become popular for visualizing and locating LDs due to their rapid uptake and accumulation into the neutral lipid droplet core. Even though most applications are well-described in cell cultures, there is less evidence demonstrating the reliable use of lipophilic fluorophore probes as an LD imaging tool in tissue samples. Herein, we propose an optimized boron dipyrromethene (BODIPY) 493/503-based protocol for the evaluation of LDs in liver specimens from an animal model of high-fat diet (HFD)-induced hepatic steatosis. This protocol covers liver sample preparation, tissue sectioning, BODIPY 493/503 staining, image acquisition, and data analysis. We demonstrate an increased number, intensity, area ratio, and diameter of hepatic LDs upon HFD feeding. Using orthogonal projections and 3D reconstructions, it was possible to observe the full content of neutral lipids in the LD core, which appeared as nearly spherical droplets. Moreover, with the fluorophore BODIPY 493/503, we were able to distinguish microvesicles (1 &#181;m &lt; d &#8804; 3 &#181;m), intermediate vesicles (3 &#181;m &lt; d &#8804; 9 &#181;m), and macrovesicles (d &gt; 9 &#181;m), allowing the successful discrimination of microvesicular and macrovesicular steatosis. Overall, this BODIPY 493/503 fluorescence-based protocol is a reliable and simple tool for hepatic LD characterization and may represent a complementary approach to the classical histological protocols.

Autore in primo piano: Analisi di goccioline lipidiche colorate con fluorescenza con ricostruzione 3D per la valutazione della steatosi epatica  

Herein, we demonstrate an optimized BODIPY 493/503 fluorescence-based protocol for lipid droplet characterization in liver tissue. Through the use of orthogonal projections and 3D reconstructions, the fluorophore allows for successful discrimination between microvesicular and macrovesicular steatosis and may represent a complementary approach to the classical histological protocols for hepatic steatosis assessment.

Analisi di goccioline lipidiche colorate con fluorescenza con ricostruzione 3D per la valutazione della steatosi epatica

Lipid droplets (LDs) are specialized organelles that mediate lipid storage and play a very important role in suppressing lipotoxicity and preventing ...

Inducing and Characterizing Vesicular Steatosis in Differentiated HepaRG Cells

Hepatic steatosis represents a metabolic dysfunction that results from an accumulation of triglyceride-containing lipid droplets in hepatocytes. Excessive fat accumulation leads to non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD), &#160;which is potentially reversible and may evolve into non-alcoholic steatohepatitis (NASH) and eventually cirrhosis and hepatocellular carcinoma (HCC). The molecular mechanisms linking lipid accumulation in hepatocytes with the progression to NASH, irreversible liver damage, fibrosis, cirrhosis, and even HCC still remains unclear. To this end, several in vitro and in vivo models have been developed to elucidate the pathological processes that cause NAFLD. In the present study, we describe a cellular model for the induction of liver vesicular steatosis that consists of DMSO-differentiated human hepatic HepaRG cells treated with the fatty acid salt sodium oleate. Indeed, sodium oleate-treated HepaRG cells accumulate lipid droplets in the cytoplasm and show typical features of steatosis. This in vitro human model represents a valuable alternative to in vivo mice models as well as to the primary human hepatocytes. We also present a comparison of several methods for the quantification and evaluation of fat accumulation in HepaRG cells, including Oil Red O staining, cytofluorimetric Bodipy measurement, metabolic gene expression analysis by qPCR, and coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) microscopy. CARS imaging combines the chemical specificity of Raman spectroscopy, a chemical analysis technique well-known in materials science applications, with the benefits of high-speed, high-resolution non-linear optical microscopies to allow precise quantification of lipid accumulation and lipid droplet dynamics. The establishment of an efficient in vitro model for the induction of vesicular steatosis, alongside an accurate method for the quantification and characterization of lipid accumulation, could lead to the development of early stage diagnosis of NAFLD via the identification of molecular markers, and to the generation of new treatment strategies.

In this study, we describe a detailed protocol for inducing liver vesicular steatosis in differentiated HepaRG cells with the fatty acid salt sodium oleate and employ methods for detection and quantification of lipid accumulation, including coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) microscopy, cytofluorimetric analysis, Oil red O staining, and qPCR.&#160;

Indurre e caratterizzare la vesapica steatosi nelle celle HepaRG differenziate

Hepatic steatosis represents a metabolic dysfunction that results from an accumulation of triglyceride-containing lipid droplets in hepatocytes. Excessive ...

Determination of Fatty Acid Oxidation and Lipogenesis in Mouse Primary Hepatocytes

Lipid metabolism in liver is complex. In addition to importing and exporting lipid via lipoproteins, hepatocytes can oxidize lipid via fatty acid oxidation, or alternatively, synthesize new lipid via de novo lipogenesis. The net sum of these pathways is dictated by a number of factors, which in certain disease states leads to fatty liver disease. Excess hepatic lipid accumulation is associated with whole body insulin resistance and coronary heart disease. Tools to study lipid metabolism in hepatocytes are useful to understand the role of hepatic lipid metabolism in certain metabolic disorders.
In the liver, hepatocytes regulate the breakdown and synthesis of fatty acids via &#946;-fatty oxidation and de novo lipogenesis, respectively. Quantifying metabolism in these pathways provides insight into hepatic lipid handling. Unlike in vitro quantification, using primary hepatocytes, making measurements in vivo is technically challenging and resource intensive. Hence, quantifying &#946;-fatty acid oxidation and de novo lipogenesis in cultured mouse hepatocytes provides a straight forward method to assess hepatocyte lipid handling. 
Here we describe a method for the isolation of primary mouse hepatocytes, and we demonstrate quantification of &#946;-fatty acid oxidation and de novo lipogenesis, using radiolabeled substrates.

De novo lipogenesis and &#946;-fatty acid oxidation constitute key metabolic pathways in hepatocyte, pathways that are perturbed in several metabolic disorders, including fatty liver disease. Here we demonstrate isolation of mouse primary hepatocytes and describe quantification of &#946;-fatty acid oxidation and lipogenesis.

Determinazione della ossidazione degli acidi grassi e la lipogenesi nel topo primaria Epatociti

Lipid metabolism in liver is complex. In addition to importing and exporting lipid via lipoproteins, hepatocytes can oxidize lipid via fatty acid ...

Biologia

A Model of Experimental Steatosis In Vitro: Hepatocyte Cell Culture in Lipid Overload-Conditioned Medium

Metabolic dysfunction-associated fatty liver disease (MAFLD), previously known as non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD), is the most prevalent liver disease worldwide due to its relationship with obesity, diabetes type 2, and dyslipidemia. Hepatic steatosis, the accumulation of lipid droplets in the liver parenchyma, is a key feature of the disease preceding the inflammation observed in steatohepatitis, fibrosis, and end-stage liver disease. Lipid accumulation in hepatocytes might interfere with proper metabolism of xenobiotics and endogenous molecules, as well as to induce cellular processes leading to the advance of the disease. Although the experimental study of steatosis can be performed in vivo, in vitro approaches to the study of steatosis are complementary tools with different advantages. Hepatocyte culture in lipid overload-conditioned medium is an excellent reproducible option for the study of hepatic steatosis allowing the identification of cellular processes related to lipid accumulation, such as oxidative and reticular stresses, autophagia, proliferation, cell death, etcetera, as well as other testing including drug effectiveness, and toxicological testing, among many other possible applications. Here, it was aimed to describe the methodology of hepatocyte cell culture in lipid overload-conditioned medium. HepG2 cells were cultured in RMPI 1640 medium conditioned with sodium palmitate and sodium oleate. Importantly, the ratio of these two lipids is crucial to favor lipid droplet accumulation, while maintaining cell proliferation and a moderate mortality rate, as occurs in the liver during the disease. The methodology, from the preparation of the lipid solution stocks, mixture, addition to the medium, and hepatocyte culture is shown. With this approach, it is possible to identify lipid droplets in the hepatocytes that are readily observable by Oil-red O staining, as well as curves of proliferation/mortality rates.

A Model of Experimental Steatosis In Vitro: Hepatocyte Cell Culture in Lipid Overload-Conditioned Medium

This protocol is intended to be a tool to study steatosis and the molecular, biochemical, cellular changes produced by the over exposure of hepatocytes to lipids in vitro.

Un modello di steatosi sperimentale in vitro:coltura cellulare di epatociti in mezzo condizionato da sovraccarico lipidico

Metabolic dysfunction-associated fatty liver disease (MAFLD), previously known as non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD), is the most prevalent liver ...

Novel In Vivo Micro-Computed Tomography Imaging Techniques for Assessing the Progression of Non-Alcoholic Fatty Liver Disease

Non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) is a growing global health issue, and the impact of NAFLD is compounded by the current lack of effective treatments. Considerable limiting factors hindering the timely and accurate diagnosis (including grading) and monitoring of NAFLD, as well as the development of potential therapies, are the current inadequacies in the characterization of the hepatic microenvironment structure and the scoring of the disease stage in a spatiotemporal and non-invasive manner. Using a diet-induced NAFLD mouse model, we investigated the use of in vivo micro-computed tomography (CT) imaging techniques as a non-invasive method to assess the progression stages of NAFLD, focusing predominantly on the hepatic vascular network due to its significant involvement in NAFLD-related hepatic dysregulation. This imaging methodology allows for longitudinal analysis of liver steatosis and functional tissue uptake, as well as the evaluation of the relative blood volume, portal vein diameter, and density of the vascular network. Understanding the adaptations of the hepatic vascular network during NAFLD progression and correlating this with other ways of characterizing the disease progression (steatosis, inflammation, fibrosis) using the proposed method can pave the way toward the establishment of new, more efficient, and reproducible approaches for NAFLD research in mice. This protocol is also expected to upgrade the value of preclinical animal models for investigating&#160;the development of novel therapies against disease progression.

Novel In Vivo Micro-Computed Tomography Imaging Techniques for Assessing the Progression of Non-Alcoholic Fatty Liver Disease

Using a diet-induced non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) mouse model, we describe the use of novel in vivo micro-computed tomography imaging techniques as a non-invasive method to assess the progression stages of NAFLD, focusing predominantly on the hepatic vascular network due to its significant involvement in NAFLD-related hepatic dysregulation.

Analisi ottimizzata delle

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Analisi di goccioline lipidiche colorate con fluorescenza con ricostruzione 3D per la valutazione della steatosi epatica

Analisi di goccioline lipidiche colorate con fluorescenza con ricostruzione 3D per la valutazione della steatosi epatica

Analisi di goccioline lipidiche colorate con fluorescenza con ricostruzione 3D per la valutazione della steatosi epatica

Indurre e caratterizzare la vesapica steatosi nelle celle HepaRG differenziate

Determinazione della ossidazione degli acidi grassi e la lipogenesi nel topo primaria Epatociti

Un modello di steatosi sperimentale in vitro:coltura cellulare di epatociti in mezzo condizionato da sovraccarico lipidico

Nuove tecniche di imaging con tomografia microcomputerizzata in vivo per valutare la progressione della steatosi epatica non alcolica