We appreciate Feifei Zhang for the helpful discussions. We are grateful to Jing Gao and Yixuan Sun for the technical assistance and to Zhengshuai Liu and Fengguang Ma for the animal studies.

כל פרוטוקולי הניסוי בבעלי החיים אושרו על ידי ועדת טיפול שימוש בבעלי חיים המוסדית במכון למדעי תזונה, המכונה שנחאי עבור מדעי ביולוגיה, האקדמיה הסינית למדעים (שנחאי, סין). 1. במודל עכבר DIO <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> האכלת HFHS <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להאכיל את העכברים שמונה שבועות בן זכר C57BL / 6 עם HFHS המכיל 40 שומן קלוריות% סוכרוז% 40 קלוריות. לשכן אותם 12 שעות בתנאי מחזור כהה אור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור על עכברים במצב דיאטה האכלה HFHS במשך ארבע עד שש עשרה שבועות. בדוק שבועון משקל גוף. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוח הרכב הגוף ועל ניתוח התמונה פסאודו צבע <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נושא העכברים לניתוח מנתח הרכב הגוף. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Secure מודע, עכברים הרדים לא בתוך שפופרת פלסטיק. מדוד את מסת השומן בגוף, מסת גוף רזה, ונוזלים באמצעות מערכת NMR, כפי שתואר לעיל 2. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סרוק את כל הגוף של כל עכבר באמצעות מערכת MRI. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את העכברים עם 1% Avertin באמצעות הזרקה הזרקה (25 μL / g) ולבצע ניתוח הדמיה צינורות זכוכית מיוחדים. הערה: תהליך ההדמיה נמשכת כמעט 0.5 שעות עבור כל עכבר. בסיום הבדיקה תושלם, להחזיר את העכברים לכלוב שלהם. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סרוק את הגופים השלמים של עכברי גב, באמצע, ושכבות גחון; לסרוק את הכבד בכיוון האנכי. להשתמש במגנט 0.55 T והפרמטרים אינסטרומנטלי הבאים: שטח K = 192 x 256 מיקרומטר, עובי סעיף = 3 מ&quot;מ, TE = 14.8 ms, TR = 400 ms, FOVRead = 100 מ&quot;מ, FOVPhase = 100 מ&quot;מ, ומספר סריקות = 8. סריקה באמצעות אותו המצב מגנטי עבור כל הקבוצות של עכברים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מפה את התמונה בגוונים האפורה על גבי תמונה פסאודו צבע בהתאם לאות בעצמה 9. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המתת חסד עכבר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר dissectiכלי ng, כגון מלקחיים ומספריים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים isoflurane מספיק על מגבת נייר ולתת isoflurane לנדוף בתוך צנצנת זכוכית. ודא כי עכברים מומתים על ידי isoflurane. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן העכברים על שולחן הניתוחים. ריסוס כל הבטן עם אתנול 75%, עושים חתך הדרמיס של תהליך xiphoid באמצעות מספריים, ולקרוע את הדרמיס לאורכו דרך קו האמצע עם הידיים כדי לחשוף את הצפק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הצמד את תהליך xiphoid עם מלקחיים לחתוך את לרוחב הצפק דרך התחתון של הצלעות לחשוף את הקרביים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף דם צינורות מצופים EDTA על ידי לנקב לב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את הסרעפת לאורך הכבד ובזהירות להסיר את הכבד מן enterocoelia באמצעות מספריים בסדר. חותכים שלוש חתיכות של רקמת הכבד למדידות השומנים הבאים: א) 6 x 3 x 3 מ&quot;מ עבור צביעת H &amp; E, B) 6 x 3 x 3 מ&quot;מ עבור מכתים O אדום שמן, ו- C) 20-40 מ&quot;ג של הכבד עבור כלורופורם / מיצוי מתנול. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צביעת H &amp; E <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן הכבד אצטט פורמלין 4% שנאגרו פוספט ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה ואז להטביע אותו שעוות פרפין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים חלקים פרפין (5 מיקרומטר) ו הר להם על שקופיות זכוכית צביעת H &amp; E, כפי שתואר לעיל 3, 10. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכתים שמן האדום O <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת Regent <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן פתרון עובד שמן האדום O עם 10% פורמלין, 60% isopropanol, Hematoxylin, וריבת גליצרול. ממיסים 0.5 גרם של אבקת O האדום שמן עם 100 מ&quot;ל של isopropanol ומחממים אותו באמבט C 60 ° לעשות פתרון המניה 0.5%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל עם מים מזוקקים פעמיים (DDH 2 O) בכל 3: יחס 2 (3 מ&quot;ל של פתרון המניות ו -2 מ&quot;ל של DDH 2 O). סנן את הפתרון עובד ולתת לעמוד במשך 10 דקות לפחות בטמפרטורת החדר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שבץ הכבד בטמפרטורת חיתוך אופטימלית (אוקטובר) מתחם apתיבת הטבעה lastic. להקפיא אותו ב -20 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. חותכים אותו לחלקים 8-מיקרומטר בתוך microtome מקפיא, הר רקמת בשקופית, ולמקם אותו בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים מגבת נייר בתחתית גיגית מכתים לשפוך כמות קטנה של פורמלין 10% להרטיב מגבת נייר. מניחים את השקף באמבטיה מכתים ולתקן את הסעיפים קפוא אדי פורמלדהיד במשך 5 דקות ב 4 ° C.. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טובלים את השקופית isopropanol 60% באמבטיה מכתים עבור 3 s; לחזור פעם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף כמה טיפות של תמיסת עבודה האדומה שמן O לשקופית כדי לכסות את כל רקמות דגירה במשך 15 דקות. הגן על הרקמות מפני אור בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את שקופית isopropanol 60% החדשים באמבטיה המכתימה עבור 3 s; וחזור פעמיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף בעדינות את והחלק דרך מים מזוקקים פעמיים ולהסיר את המים סביב הרקמה. הקפד לא לייבש את הרקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את השקף ב Hematoxylin דקות 1 ולשטוף בעדינות עם מי ברז למשך 5-10דקות. לשטוף בעדינות את השקף במים מזוקקים פעמיים ולשמור על אותו במים מזוקקים עד מוכן לשים על coverslip. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חממו את ג&#39;לי גליצרול במיקרוגל ומניחים כמה טיפות על גבי הרקמה. בעדינות במקום coverslip על גבי ולדאוג שלא ליצור בועות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את הכתם מתחת למיקרוסקופ ללכוד תמונות מאפיינות באמצעות מטרות 20X ו 40X. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדידת שומנים בכבד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את רקמת הכבד גזור צינור צנטריפוגות 2 מ&quot;ל פלסטיק חדש. Homogenize ב 1 מ&quot;ל של PBS עם homogenizer ולהעביר את lysate אל צינור זכוכית 15 מ&quot;ל חדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 מ&quot;ל של כלורופורם / מתנול (2: 1, V / V) פתרון, מערבולת את התערובת במרץ דקות 1, ולתת לעמוד במשך 2 שעות על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב 1,650 XG במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס; התערובת צריכה להתחלק 3 שכבות: שכבת מתנול העליונה, דיסק החלבון באמצע, ואת כלורופורם ושומנים התחתונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טראן<html> ספיר השלב התחתון לתוך צינור זכוכית חדש באמצעות pipet זכוכית פסטר; אין צורך לקבל כל טיפה של השבר התחתון. הגדר את הצינור בצד על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 600 μL של 4 מ&quot;מ MgCl 2 ו -1.5 מ&quot;ל של כלורופורם לשבר supernatant עזב בצינור מערבולת הקודם במרץ. דגירה על קרח למשך 30 דקות ו צנטריפוגות ב 1,650 XG במשך 10 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבב את השלב התחתון עם צינור השלב התחתון הראשון באמצעות pipet פסטר. מחק את השכבות הגבוהות ובינוניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאדות את כלורופורם תחת גז חנקן באמבט 37 מעלות צלזיוס. שטפו את צידי צינורות זכוכית ביסודיות עם 200 μL של 1% Triton X-100 / כלורופורם (v / v). להתאדות תחת גז חנקן. ממיסים את השומנים עם 200 μL של DDH 2 O ו מערבולת היטב כדי להפוך את תחליב הסופי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את הטריגליצרידים הכולל (TG) וכולסטרול (TC) רמות באמצעות ערכת טריגליצרידים או כולסטרול על פי פרוטוקול של היצרןXref &quot;&gt; 3. הערה: ערכי השומנים הם מנורמלים לאלה של ריכוזי חלבון homogenate הראשוני, כפי שנקבעו על ידי חלבון כימות 3. </li></ol></li></ol> 2. דגם ראשונים העכבר Hepatocyte <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בידוד של hepatocytes העיקרי העכבר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים כל עכבר עם 6% הכלורל-הידרט (10 μL / g intraperitoneally). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבודד hepatocytes העיקרי, כפי שתואר לעיל 10. לגדל תאים על coverslips זכוכית מצופה קולגן צלחת 6-גם עבור מכתים O האדום השמן. להפקת שומנים בדם, זרע התאים על צלחת תרבית תאים של 10 סנטימטרים 10. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טיפול בתאי והכתים O האדום השמן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף בינוני עם 2 מ&quot;ל של מדיום רעב לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. טפל בו עם 30 גלוקוז מ&quot;מ ו -100 אינסולין ננומטר. דגירה זה תרבות חממת 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את המדיום. הוסף 2 מ&quot;ל של PBS ו מערבולת בעדינות כדי לשטוף את בינוני; לחזור פעם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את coverslip לשקופית עם גומייה. לחשוף את התאים חסידים אל פני השטח החיצוניים. בצע את מכתים O האדום השמן כפי שתואר לעיל (שלב 1.5). הערה: רמות הבסיס של הצטברות שומנים הם מגורה עם טיפול גלוקוז בתוספת אינסולין גבוה לאחר רעב בסרום. טיפות השומנים הם דמיינו ידי מכתים שמן האדום O. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדידת שומנים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פנק את hepatocytes עם גלוקוז גבוה בתוספת אינסולין באותו המצב (שלב 2.2.1). הוסף 1 מ&quot;ל של PBS על כל צלחת תרבית תאים של 10 ס&quot;מ. לגרד את התאים למסוק אותם לתוך צינורות זכוכית חדש 15 מ&quot;ל, שממנו aliquots של 100 μL מועברים צינורות 1.5 מ&quot;ל טריים כימות חלבון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 4 מ&quot;ל של כלורופורם / מתנול (2: 1, V / V) על 900 μL של התאים הנותרים. Sonicate במשך 20 צפצופים המשוער ולאחר מכן מערבולת במרץ לשחררהשומנים בתאים. דגירה את התערובת על קרח למשך 2 שעות. בצע את מיצוי השומנים (שלב 1.6). </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Angulo, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medical+progress+-+Nonalcoholic+fatty+liver+disease.">Medical progress - Nonalcoholic fatty liver disease.</a> New England Journal of Medicine. 346 (16), 1221-1231 (2002).</li><li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatic+ATF6+Increases+Fatty+Acid+Oxidation+to+Attenuate+Hepatic+Steatosis+in+Mice+through+Peroxisome+Proliferator-Activated+Receptor+Alpha.">Hepatic ATF6 Increases Fatty Acid Oxidation to Attenuate Hepatic Steatosis in Mice through Peroxisome Proliferator-Activated Receptor Alpha.</a> Diabetes. 65 (7), 1904-1915 (2016).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AMPK+phosphorylates+and+inhibits+SREBP+activity+to+attenuate+hepatic+steatosis+and+atherosclerosis+in+diet-induced+insulin-resistant+mice.">AMPK phosphorylates and inhibits SREBP activity to attenuate hepatic steatosis and atherosclerosis in diet-induced insulin-resistant mice.</a> Cell Metab. 13 (4), 376-388 (2011).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatic+SIRT1+attenuates+hepatic+steatosis+and+controls+energy+balance+in+mice+by+inducing+fibroblast+growth+factor+21.">Hepatic SIRT1 attenuates hepatic steatosis and controls energy balance in mice by inducing fibroblast growth factor 21.</a> Gastroenterology. 146 (2), 539-549 (2014).</li><li>Esau, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-122+regulation+of+lipid+metabolism+revealed+by+in+vivo+antisense+targeting.">miR-122 regulation of lipid metabolism revealed by in vivo antisense targeting.</a> Cell Metabolism. 3 (2), 87-98 (2006).</li><li>Kanda, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MCP-1+contributes+to+macrophage+infiltration+into+adipose+tissue,+insulin+resistance,+and+hepatic+steatosis+in+obesity.">MCP-1 contributes to macrophage infiltration into adipose tissue, insulin resistance, and hepatic steatosis in obesity.</a> Journal of Clinical Investigation. 116 (6), 1494-1505 (2006).</li><li>Cohen, J. C., Horton, J. D., Hobbs, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+fatty+liver+disease:+old+questions+and+new+insights.">Human fatty liver disease: old questions and new insights.</a> Science. 332 (6037), 1519-1523 (2011).</li><li>Hebbard, L., George, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+nonalcoholic+fatty+liver+disease.">Animal models of nonalcoholic fatty liver disease.</a> Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 8 (1), 35-44 (2011).</li><li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+effective+inhibition+of+lung+cancer+growth+and+metastasis+by+systemic+delivery+of+siRNA+via+multimodal+mesoporous+silica-based+nanocarrier.">Highly effective inhibition of lung cancer growth and metastasis by systemic delivery of siRNA via multimodal mesoporous silica-based nanocarrier.</a> Biomaterials. 35 (38), 10058-10069 (2014).</li><li>Gong, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+growth+factor+21+improves+hepatic+insulin+sensitivity+by+inhibiting+mammalian+target+of+rapamycin+complex+1+in+mice.">Fibroblast growth factor 21 improves hepatic insulin sensitivity by inhibiting mammalian target of rapamycin complex 1 in mice.</a> Hepatology. 64 (2), 425-438 (2016).</li><li>Anstee, Q. M., Targher, G., Day, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progression+of+NAFLD+to+diabetes+mellitus,+cardiovascular+disease+or+cirrhosis.">Progression of NAFLD to diabetes mellitus, cardiovascular disease or cirrhosis.</a> Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 10 (6), 330-344 (2013).</li></ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים. מימון: עבודה זו נתמכה על ידי מענקי הקרן הלאומית למדע טבעי של סין (מס &#39;81,270,930, 31,471,129, ו 31,671,224) והתכנית מאה ככר האקדמיה הסינית למדעים (2013OHTP04) כדי י.ל.

NAFLD היא סדרה של מחלות כבד מתקדמת אשר מזוהה עם תסמונת מטבולית, השמנה, עמידות לאינסולין, או סוכרת סוג 2 (T2DM) 11. המאפיין העיקרי של NAFLD הוא steatosis, הצטברות של שומנים hepatocytes. הנה, קשת של שיטות מוצגת לאפיין את פנוטיפים ופרמטרים של steatosis בכבד באמצעות עכברי DIO ו hepatocytes הע...

השמנה היא בעיה בריאותית המתפתחת במדינות מפותחות ומתפתחות. זה כבר דווח להיות אחד מחלות רקע קשורה לעיתים קרובות עם מחלת כבד שומני לא אלכוהולי (NAFLD), עם שכיחות הנע בין 30 ל -100 אחוזים בחולים NAFLD 1. בשל הקשר החזק בין כבד שומני והשמנה, שמנים-induced דיאטה (DIO) במודלים של עכברים נמצאים בשימוש נרחב כדי לחקור את המנגנונים המולקולריים מורכבים הקשורים בפיתוח NAFLD 2, 3, 4, 5, 6. Steatosis כבדיה היא השלב המוקדם של NAFLD, וזה יכול להתקדם steatohepatitis אלכוהולי (NASH), שחמת כבד, ובסופו של דבר, סרטן כבד 7. לכן, המטרה הכוללת של שיטה זו היא ליצור מודלים של בעלי חיים ותא של תנאי steatotic בכבד ל- PRפרוטוקולי ovide מפורטים למדידת שומנים יעילה ומדויקת. מודלים ומדידות אלה שימושיים גם עבור החקירה של הפרעות מטבוליות אחרות, כגון עמידות לאינסולין וסוכרת מסוג 2. כפי מזוהה שמן להיות אחד מגורמי הסיכון המרכזיים עבור NAFLD, א-שומן גבוה, סוכרוז דיאטה (HFHS) המחקה את הדיאטה עתיר שומן בסגנון המערבי משמשת לגרום להשמנה בעכברים. בהמשך לכך, מידת steatosis הכבד ניתן להעריך באמצעות שיטות שונות. ראשית, משקל הגוף וניתוח הרכב הגוף עם תהודה מגנטית גרעינית (NMR) להראות את הצטברות השומנים במהלך שעת ההאכלה. מסת שומן המסה רזה ניתן לכמת באופן פולשני בזמן אמת. בנוסף, הדמיה בתהודה מגנטית (MRI) משמשת כדי להראות הוא את הגוף ואת חלוקת הכבד של שומן. האות בגווני אפור של ניתוח MRI ניתן להמיר תמונה פסאודו צבע קריא, ואת עוצמתאת הגוון האפור והצבע הוא חם לכימות. טכנולוגיה זו מספקת יתרונות ייחודיים למדידת הצטברות שומנים בבעלי חיים. שנית, ניתוח היסטולוגית של הכבד הוא השיטה הנפוצה ביותר כדי לקבוע steatosis בכבד. מכתים Hematoxylin ו Eosin (H &amp; E) מספק מידע היסטולוגית, כגון מורפולוגיה hepatocyte וחדירה מקרופאג, בעוד מכתים האדום O שמן מראה את הגודל והמיקום של טיפות השומנים ב hepatocytes. שלישית, ניתוח תוכן השומנים באמצעות מיצוי כלורופורם / מתנול הוא מדידה מדויקת וכמותית של שומנים בכבד. רמות הטריגליצרידים והכולסטרול סה&quot;כ ניתן למדוד עם שיטות ביוכימיות. חשוב לציין, ניתוח שאיבת שומנים מכתים האדום O שמן יכול לשמש גם מניפולציה גנטית או hepatocytes מטופלים pharmaceutically. היתרון של השיטה הנוכחית הוא הניצול של גישות אופטימיזציה מרובות כדי ליצור מודלי steatotic כבדיםולאפיין את פנוטיפים הוא in vivo ו במבחנה מקיפה. המודלים העכבר DIO יכול לשחזר את פנוטיפים פתולוגיה מטבולית של מחלת כבד שומני האדם. פרמטרים מטבוליים אחרים בבני אדם ניתן לשכפל במודל זה, כמו גם 8. הדור של מודל hepatocyte steatotic בתגובה גבוהה גלוקוז בתוספת אינסולין יעיל, שימושי, מתגבר על מגבלה של עבודה עכבר זמן רב ויקר. יחדיו, שיטות אלה מספיקות וחיוניים לחקר תפקוד ועמידות לאינסולין שומנים בכבדים במהלך עומס יתר מזין.

<table><tbody><tr><td>O.C.T compound</td><td>SAKURA</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Oil Red O</td><td>Sigma</td><td>O0625-25G</td><td></td></tr><tr><td>Infinity Triglycerides kit</td><td>Fisher&amp;nbsp;Scientific</td><td>TR22421</td><td></td></tr><tr><td>Infinity Cholesterol kit</td><td>Fisher&amp;nbsp;Scientific</td><td>TR13421</td><td></td></tr><tr><td>Collagen type I, Rat tail</td><td>Millipore</td><td>08-115</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (low glucose)</td><td>Invitrogen</td><td>11885-092</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin / Streptomycin</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Invitrogen</td><td>10099141</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>cellgro</td><td>R21-040-CVR</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>cellgro</td><td>20-021-CV</td><td></td></tr><tr><td>Insulin</td><td>TOCRIS Bioscience</td><td>3435</td><td>dissolve in PBS, 1 mM for stock</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma</td><td>G8270-100G</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Olympus</td><td>BX53</td><td></td></tr><tr><td>Peristaltic pump</td><td>Longerpump</td><td>BT100-2J</td><td></td></tr><tr><td>10 cm cell culture dish</td><td>Corning</td><td>420167</td><td></td></tr><tr><td>6-well-plate</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>BCA assay</td><td>Beyotime</td><td>P0010</td><td></td></tr><tr><td>Nuclear Magnetic Resonance</td><td>Niumag technology</td><td>MiniQMR23-060H-I</td><td></td></tr><tr><td>High fat high surcose diet (HFHS)</td><td>Research Diets</td><td>D12327</td><td></td></tr></tbody></table>

optimized analysis of in vivo and in vitro hepatic steatosis

Establishing a system of procedures to qualitatively and quantitatively characterize in vivo and in vitro hepatic steatosis is important for metabolic study in the liver. Here, numerous assays are described to comprehensively measure the phenotype and parameters of hepatic steatosis in mouse and hepatocyte models. 
Combining the physiological, histological, and biochemical methods, this system can be used to assess the progress of hepatic steatosis. In vivo, the measurements of body weight and nuclear magnetic resonance (NMR) provide a general understanding of mice in a non-invasive manner. Hematoxylin and Eosin (H&amp;E) and Oil Red O staining determine the histological morphology and lipid deposition of liver tissue under nutrient overload conditions, such as high-fat diet feeding. Next, the total lipid contents are isolated by chloroform/methanol extraction, which are followed by a biochemical analysis for triglyceride and cholesterol. Moreover, mouse primary hepatocytes are treated with high glucose plus insulin to stimulate lipid accumulation, an efficient in vitro model to mimic diet-induced hyperglycemia and hyperinsulinemia in vivo. Then, the lipid deposition is measured by Oil Red O staining and chloroform/methanol extraction. Oil Red O staining determines intuitive hepatic steatotic phenotypes, while the lipid extraction analysis determines the parameters that can be analyzed statistically. The present protocols are of interest to scientists in the fields of fatty liver diseases, insulin resistance, and type 2 diabetes.

כפי שניתן לראות בתרשים 1 א &#39;, משקל גוף העכבר הוגדל ל 45 ± 1.2 גרם לאחר 16 שבועות של האכלת HFHS, וזה בערך פי 1.5 גבוה יותר מאשר קבוצת האכלת דיאטת צ&#39;או. הרכב הגוף NMR ניתוחי מראה את מסת השומן ומסת רזה של עכברים מסומנים (איור 1B). התפלגויות השומן ...

Watch this Scientific Journal Video about Optimized Analysis of In Vivo and In Vitro Hepatic Steatosis at JoVE.com

Optimized Analysis of In Vivo and In Vitro Hepatic Steatosis

Here, optimized methods to generate in vivo and in vitro models of hepatic steatosis and to analyze the steatotic phenotypes and related physiological parameters are described.

ניתוח אופטימלי של<em&gt; In vivo</em&gt; ו<em&gt; במבחנה</em&gt; כבדית steatosis

Establishing a system of procedures to qualitatively and quantitatively characterize in vivo and in vitro hepatic steatosis is important for metabolic ...

optimized-analysis-of-in-vivo-and-in-vitro-hepatic-steatosis

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Medicine

Optimized Analysis of In Vivo and In Vitro Hepatic Steatosis

15.8K Views.  Chinese Academy of Sciences. Here, optimized methods to generate in vivo and in vitro models of hepatic steatosis and to analyze the steatotic phenotypes and related physiological parameters are described. 

Video: Optimized Analysis of In Vivo and In Vitro Hepatic Steatosis

Visualization and Analysis of Blood Flow and Oxygen Consumption in Hepatic Microcirculation: Application to an Acute Hepatitis Model

There is a considerable discrepancy between oxygen supply and demand in the liver because hepatic oxygen consumption is relatively high but about 70% of the hepatic blood supply is poorly oxygenated portal vein blood derived from the gastrointestinal tract and spleen. Oxygen is delivered to hepatocytes by blood flowing from a terminal branch of the portal vein to a central venule via sinusoids, and this makes an oxygen gradient in hepatic lobules. The oxygen gradient is an important physical parameter that involves the expression of enzymes upstream and downstream in hepatic microcirculation, but the lack of techniques for measuring oxygen consumption in the hepatic microcirculation has delayed the elucidation of mechanisms relating to oxygen metabolism in liver. We therefore used FITC-labeled erythrocytes to visualize the hepatic microcirculation and used laser-assisted phosphorimetry to measure the partial pressure of oxygen in the microvessels there. Noncontact and continuous optical measurement can quantify blood flow velocities, vessel diameters, and oxygen gradients related to oxygen consumption in the liver. In an acute hepatitis model we made by administering acetaminophen to mice we observed increased oxygen pressure in both portal and central venules but a decreased oxygen gradient in the sinusoids, indicating that hepatocyte necrosis in the pericentral zone could shift the oxygen pressure up and affect enzyme expression in the periportal zone. In conclusion, our optical methods for measuring hepatic hemodynamics and oxygen consumption can reveal mechanisms related to hepatic disease.

An optical system was developed to visualize hepatic microcirculation with FITC-labeled erythrocytes and to measure the partial pressure of oxygen in the microvessels with laser-assisted phosphorimetry. This method can be used to investigate physiological and pathological mechanisms by analyzing microvascular structure, diameter, blood flow velocity, and oxygen tension.

הדמיה וניתוח של זרימת הדם ואת צריכת החמצן microcirculation כבד: בקשה דגם הפטיטיס חריפה

There is a considerable discrepancy between oxygen supply and demand in the liver because hepatic oxygen consumption is relatively high but about 70% of ...

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. Here, we describe a general protocol for cell labeling, imaging, and image processing. The technique is applicable to various cell types and animal models, although here we focus on a typical mouse model for tracking murine immune cells. The most important issues for cell labeling are described, as these are relevant to all models. Similarly, key imaging parameters are listed, although the details will vary depending on the MRI system and the individual setup. Finally, we include an image processing protocol for quantification. Variations for this, and other parts of the protocol, are assessed in the Discussion section. Based on the detailed procedure described here, the user will need to adapt the protocol for each specific cell type, cell label, animal model, and imaging setup. Note that the protocol can also be adapted for human use, as long as clinical restrictions are met.

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

We describe a general protocol for in vivo cell tracking using MRI in a mouse model with ex vivo labeled cells. A typical protocol for cell labeling, image acquisition processing and quantification is included.

בF-MRI 19 vivo למעקב סלולרי

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. ...

Measurement of Fatty Acid &#946;-Oxidation in a Suspension of Freshly Isolated Mouse Hepatocytes

Fatty acid &#946;-oxidation is a key metabolic pathway to meet the energy demands of the liver and provide substrates and cofactors for additional processes, such as ketogenesis and gluconeogenesis, which are essential to maintain whole-body glucose homeostasis and support extra-hepatic organ function in the fasted state. Fatty acid &#946;-oxidation occurs within the mitochondria and peroxisomes and is regulated through multiple mechanisms, including the uptake and activation of fatty acids, enzyme expression levels, and availability of cofactors such as coenzyme A and NAD+. In assays that measure fatty acid &#946;-oxidation in liver homogenates, cell lysis and the common addition of supraphysiological levels of cofactors mask the effects of these regulatory mechanisms. Furthermore, the integrity of the organelles in the homogenates is hard to control and can vary significantly between preparations. The measurement of fatty acid &#946;-oxidation in intact primary hepatocytes overcomes the above pitfalls. This protocol describes a method for the measurement of fatty acid &#946;-oxidation in a suspension of freshly isolated primary mouse hepatocytes incubated with 14C-labeled palmitic acid. By avoiding hours to days of culture, this method has the advantage of better preserving the protein expression levels and metabolic pathway activity of the original liver, including the activation of fatty acid &#946;-oxidation observed in hepatocytes isolated from fasted mice compared to fed mice.

Fatty acid &#946;-oxidation is an essential metabolic pathway responsible for generating energy in many different cell types, including hepatocytes. Here, we describe a method to measure fatty acid &#946;-oxidation in freshly isolated primary hepatocytes using 14C-labeled palmitic acid.

מדידה של חומצת שומן β-חמצון בהשעיה של הפטוציטים עכברים מבודדים טריים

Fatty acid &#946;-oxidation is a key metabolic pathway to meet the energy demands of the liver and provide substrates and cofactors for additional ...

Biochemistry

הערכת סטאטוזיס בכבד עם שחזור טיפות שומנים פלואורסצנטיות תלת ממדיות

Analysis of Fluorescent-Stained Lipid Droplets with 3D Reconstruction for Hepatic Steatosis Assessment

Lipid droplets (LDs) are specialized organelles that mediate lipid storage and play a very important role in suppressing lipotoxicity and preventing dysfunction caused by free fatty acids (FAs). The liver, given its critical role in the body's fat metabolism, is persistently threatened by the intracellular accumulation of LDs in the form of both microvesicular and macrovesicular hepatic steatosis. The histologic characterization of LDs is typically based on lipid-soluble diazo dyes, such as Oil Red O (ORO) staining, but a number of disadvantages consistently hamper the use of this analysis with liver specimens. More recently, lipophilic fluorophores 493/503 have become popular for visualizing and locating LDs due to their rapid uptake and accumulation into the neutral lipid droplet core. Even though most applications are well-described in cell cultures, there is less evidence demonstrating the reliable use of lipophilic fluorophore probes as an LD imaging tool in tissue samples. Herein, we propose an optimized boron dipyrromethene (BODIPY) 493/503-based protocol for the evaluation of LDs in liver specimens from an animal model of high-fat diet (HFD)-induced hepatic steatosis. This protocol covers liver sample preparation, tissue sectioning, BODIPY 493/503 staining, image acquisition, and data analysis. We demonstrate an increased number, intensity, area ratio, and diameter of hepatic LDs upon HFD feeding. Using orthogonal projections and 3D reconstructions, it was possible to observe the full content of neutral lipids in the LD core, which appeared as nearly spherical droplets. Moreover, with the fluorophore BODIPY 493/503, we were able to distinguish microvesicles (1 &#181;m &lt; d &#8804; 3 &#181;m), intermediate vesicles (3 &#181;m &lt; d &#8804; 9 &#181;m), and macrovesicles (d &gt; 9 &#181;m), allowing the successful discrimination of microvesicular and macrovesicular steatosis. Overall, this BODIPY 493/503 fluorescence-based protocol is a reliable and simple tool for hepatic LD characterization and may represent a complementary approach to the classical histological protocols.

מחבר זרקור: ניתוח טיפות שומנים מוכתמות פלואורסצנטיות עם שחזור תלת ממדי להערכת סטאטוזיס בכבד  

Herein, we demonstrate an optimized BODIPY 493/503 fluorescence-based protocol for lipid droplet characterization in liver tissue. Through the use of orthogonal projections and 3D reconstructions, the fluorophore allows for successful discrimination between microvesicular and macrovesicular steatosis and may represent a complementary approach to the classical histological protocols for hepatic steatosis assessment.

ניתוח טיפות שומנים מוכתמות פלואורסצנטיות עם שחזור תלת ממדי להערכת סטאטוזיס בכבד

Lipid droplets (LDs) are specialized organelles that mediate lipid storage and play a very important role in suppressing lipotoxicity and preventing ...

Inducing and Characterizing Vesicular Steatosis in Differentiated HepaRG Cells

Hepatic steatosis represents a metabolic dysfunction that results from an accumulation of triglyceride-containing lipid droplets in hepatocytes. Excessive fat accumulation leads to non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD), &#160;which is potentially reversible and may evolve into non-alcoholic steatohepatitis (NASH) and eventually cirrhosis and hepatocellular carcinoma (HCC). The molecular mechanisms linking lipid accumulation in hepatocytes with the progression to NASH, irreversible liver damage, fibrosis, cirrhosis, and even HCC still remains unclear. To this end, several in vitro and in vivo models have been developed to elucidate the pathological processes that cause NAFLD. In the present study, we describe a cellular model for the induction of liver vesicular steatosis that consists of DMSO-differentiated human hepatic HepaRG cells treated with the fatty acid salt sodium oleate. Indeed, sodium oleate-treated HepaRG cells accumulate lipid droplets in the cytoplasm and show typical features of steatosis. This in vitro human model represents a valuable alternative to in vivo mice models as well as to the primary human hepatocytes. We also present a comparison of several methods for the quantification and evaluation of fat accumulation in HepaRG cells, including Oil Red O staining, cytofluorimetric Bodipy measurement, metabolic gene expression analysis by qPCR, and coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) microscopy. CARS imaging combines the chemical specificity of Raman spectroscopy, a chemical analysis technique well-known in materials science applications, with the benefits of high-speed, high-resolution non-linear optical microscopies to allow precise quantification of lipid accumulation and lipid droplet dynamics. The establishment of an efficient in vitro model for the induction of vesicular steatosis, alongside an accurate method for the quantification and characterization of lipid accumulation, could lead to the development of early stage diagnosis of NAFLD via the identification of molecular markers, and to the generation of new treatment strategies.

In this study, we describe a detailed protocol for inducing liver vesicular steatosis in differentiated HepaRG cells with the fatty acid salt sodium oleate and employ methods for detection and quantification of lipid accumulation, including coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) microscopy, cytofluorimetric analysis, Oil red O staining, and qPCR.&#160;

גרימת ואפיון שלפוחית הזרע ב הבדיל תאים HepaRG

Hepatic steatosis represents a metabolic dysfunction that results from an accumulation of triglyceride-containing lipid droplets in hepatocytes. Excessive ...

Determination of Fatty Acid Oxidation and Lipogenesis in Mouse Primary Hepatocytes

Lipid metabolism in liver is complex. In addition to importing and exporting lipid via lipoproteins, hepatocytes can oxidize lipid via fatty acid oxidation, or alternatively, synthesize new lipid via de novo lipogenesis. The net sum of these pathways is dictated by a number of factors, which in certain disease states leads to fatty liver disease. Excess hepatic lipid accumulation is associated with whole body insulin resistance and coronary heart disease. Tools to study lipid metabolism in hepatocytes are useful to understand the role of hepatic lipid metabolism in certain metabolic disorders.
In the liver, hepatocytes regulate the breakdown and synthesis of fatty acids via &#946;-fatty oxidation and de novo lipogenesis, respectively. Quantifying metabolism in these pathways provides insight into hepatic lipid handling. Unlike in vitro quantification, using primary hepatocytes, making measurements in vivo is technically challenging and resource intensive. Hence, quantifying &#946;-fatty acid oxidation and de novo lipogenesis in cultured mouse hepatocytes provides a straight forward method to assess hepatocyte lipid handling. 
Here we describe a method for the isolation of primary mouse hepatocytes, and we demonstrate quantification of &#946;-fatty acid oxidation and de novo lipogenesis, using radiolabeled substrates.

De novo lipogenesis and &#946;-fatty acid oxidation constitute key metabolic pathways in hepatocyte, pathways that are perturbed in several metabolic disorders, including fatty liver disease. Here we demonstrate isolation of mouse primary hepatocytes and describe quantification of &#946;-fatty acid oxidation and lipogenesis.

קביעת חומצות שומן החמצון וLipogenesis בעכבר העיקרי hepatocytes

Lipid metabolism in liver is complex. In addition to importing and exporting lipid via lipoproteins, hepatocytes can oxidize lipid via fatty acid ...

Biology

A Model of Experimental Steatosis In Vitro: Hepatocyte Cell Culture in Lipid Overload-Conditioned Medium

Metabolic dysfunction-associated fatty liver disease (MAFLD), previously known as non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD), is the most prevalent liver disease worldwide due to its relationship with obesity, diabetes type 2, and dyslipidemia. Hepatic steatosis, the accumulation of lipid droplets in the liver parenchyma, is a key feature of the disease preceding the inflammation observed in steatohepatitis, fibrosis, and end-stage liver disease. Lipid accumulation in hepatocytes might interfere with proper metabolism of xenobiotics and endogenous molecules, as well as to induce cellular processes leading to the advance of the disease. Although the experimental study of steatosis can be performed in vivo, in vitro approaches to the study of steatosis are complementary tools with different advantages. Hepatocyte culture in lipid overload-conditioned medium is an excellent reproducible option for the study of hepatic steatosis allowing the identification of cellular processes related to lipid accumulation, such as oxidative and reticular stresses, autophagia, proliferation, cell death, etcetera, as well as other testing including drug effectiveness, and toxicological testing, among many other possible applications. Here, it was aimed to describe the methodology of hepatocyte cell culture in lipid overload-conditioned medium. HepG2 cells were cultured in RMPI 1640 medium conditioned with sodium palmitate and sodium oleate. Importantly, the ratio of these two lipids is crucial to favor lipid droplet accumulation, while maintaining cell proliferation and a moderate mortality rate, as occurs in the liver during the disease. The methodology, from the preparation of the lipid solution stocks, mixture, addition to the medium, and hepatocyte culture is shown. With this approach, it is possible to identify lipid droplets in the hepatocytes that are readily observable by Oil-red O staining, as well as curves of proliferation/mortality rates.

A Model of Experimental Steatosis In Vitro: Hepatocyte Cell Culture in Lipid Overload-Conditioned Medium

This protocol is intended to be a tool to study steatosis and the molecular, biochemical, cellular changes produced by the over exposure of hepatocytes to lipids in vitro.

מודל של סטאטוזיס ניסיוני במבחנה: תרבית תאי הפטוציט במדיום מותנה בעומס יתר של שומנים

Metabolic dysfunction-associated fatty liver disease (MAFLD), previously known as non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD), is the most prevalent liver ...

Novel In Vivo Micro-Computed Tomography Imaging Techniques for Assessing the Progression of Non-Alcoholic Fatty Liver Disease

Non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) is a growing global health issue, and the impact of NAFLD is compounded by the current lack of effective treatments. Considerable limiting factors hindering the timely and accurate diagnosis (including grading) and monitoring of NAFLD, as well as the development of potential therapies, are the current inadequacies in the characterization of the hepatic microenvironment structure and the scoring of the disease stage in a spatiotemporal and non-invasive manner. Using a diet-induced NAFLD mouse model, we investigated the use of in vivo micro-computed tomography (CT) imaging techniques as a non-invasive method to assess the progression stages of NAFLD, focusing predominantly on the hepatic vascular network due to its significant involvement in NAFLD-related hepatic dysregulation. This imaging methodology allows for longitudinal analysis of liver steatosis and functional tissue uptake, as well as the evaluation of the relative blood volume, portal vein diameter, and density of the vascular network. Understanding the adaptations of the hepatic vascular network during NAFLD progression and correlating this with other ways of characterizing the disease progression (steatosis, inflammation, fibrosis) using the proposed method can pave the way toward the establishment of new, more efficient, and reproducible approaches for NAFLD research in mice. This protocol is also expected to upgrade the value of preclinical animal models for investigating&#160;the development of novel therapies against disease progression.

Novel In Vivo Micro-Computed Tomography Imaging Techniques for Assessing the Progression of Non-Alcoholic Fatty Liver Disease

Using a diet-induced non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) mouse model, we describe the use of novel in vivo micro-computed tomography imaging techniques as a non-invasive method to assess the progression stages of NAFLD, focusing predominantly on the hepatic vascular network due to its significant involvement in NAFLD-related hepatic dysregulation.

ניתוח אופטימלי של

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

הדמיה וניתוח של זרימת הדם ואת צריכת החמצן microcirculation כבד: בקשה דגם הפטיטיס חריפה

בF-MRI ¹⁹ vivo למעקב סלולרי

מדידה של חומצת שומן β-חמצון בהשעיה של הפטוציטים עכברים מבודדים טריים

ניתוח טיפות שומנים מוכתמות פלואורסצנטיות עם שחזור תלת ממדי להערכת סטאטוזיס בכבד

ניתוח טיפות שומנים מוכתמות פלואורסצנטיות עם שחזור תלת ממדי להערכת סטאטוזיס בכבד

ניתוח טיפות שומנים מוכתמות פלואורסצנטיות עם שחזור תלת ממדי להערכת סטאטוזיס בכבד

גרימת ואפיון שלפוחית הזרע ב הבדיל תאים HepaRG

קביעת חומצות שומן החמצון וLipogenesis בעכבר העיקרי hepatocytes

מודל של סטאטוזיס ניסיוני במבחנה: תרבית תאי הפטוציט במדיום מותנה בעומס יתר של שומנים

רומן in vivo טכניקות הדמיה טומוגרפיה מיקרו-ממוחשבת להערכת ההתקדמות של מחלת כבד שומני לא אלכוהולי