Name: optimized analysis of in vivo and in vitro hepatic steatosis
Uploaded: 2017-03-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 58 s
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We appreciate Feifei Zhang for the helpful discussions. We are grateful to Jing Gao and Yixuan Sun for the technical assistance and to Zhengshuai Liu and Fengguang Ma for the animal studies.

Todos los protocolos experimentales con animales fueron aprobados por el comité de cuidado de los animales y el uso institucional en el Instituto de Ciencias de la Nutrición, Shanghai Institutos de Ciencias Biológicas, la Academia China de Ciencias (Shanghai, China). 1. Modelo de ratón DIO <ol><li> alimentación HFHS <ol><li> Alimentar a ratones C57BL / 6 macho de ocho semanas de edad, con un HFHS que contiene 40 kcal% de grasa y 40% de sacarosa kcal. Alojarlos en 12 h condiciones del ciclo de luz-oscuridad. </li><li> Mantener los ratones en HFHS condición de la dieta materna durante cuatro a dieciséis semanas. Compruebe semanalmente el peso corporal. </li></ol></li><li> Cuerpo análisis de la composición y análisis de imágenes pseudo-color de <ol><li> Se somete a los ratones a un análisis de la composición corporal analizador. <ol><li> Asegure ratones conscientes, no anestesiados en un tubo de plástico en el. Medir la masa grasa corporal, masa magra, y los fluidos que utilizan un sistema de RMN, como se ha descrito anteriormente 2. </li></ol></li><li> Escanear todo el cuerpo de cada ratón utilizando un sistema de resonancia magnética. <ol><li> Anestesiar a los ratones con 1% Avertin a través de inyección intraperitoneal (25 l / g) y llevar a cabo el análisis de imágenes en tubos de vidrio especializados. NOTA: El proceso de formación de imágenes tiene una duración de casi 0,5 horas para cada ratón. Cuando se completa la medición, volver a los ratones a su jaula. </li></ol></li><li> Análisis de todo el cuerpo de los ratones en dorsal, medio y capas ventrales; escanear el hígado en la dirección vertical. Utilice un imán 0,55 T y los siguientes parámetros instrumentales: el espacio K = 192 x 256 m, espesor de la sección = 3 mm, TE = 14,8 ms, TR = 400 ms, FOVRead = 100 mm, FOVPhase = 100 mm, y el número de exploraciones = 8. Scan usando la misma condición magnética para todos los grupos de ratones. </li><li> Mapear la imagen en escala de grises de una imagen de pseudo-color en función de la intensidad de la señal 9. </li></ol></li><li> la eutanasia del ratón <ol><li> esterilizar dissectiherramientas Ng, tales como pinzas y tijeras. </li><li> Vierta suficiente isoflurano en una toalla de papel y dejar que el isoflurano se volatiliza en un frasco de vidrio. Asegúrese de que los ratones son sacrificados por el isoflurano. </li><li> Fijar los ratones en una mesa de operaciones. Pulverizar cada abdomen con 75% de etanol, hacer una incisión en la dermis de la apófisis xifoides con unas tijeras, y rasgar la dermis longitudinalmente a través de la línea media con las manos para exponer el peritoneo. </li><li> Abrazadera de la apófisis xifoides con unas pinzas y cortar el peritoneo a lo ancho a través de la parte inferior de las costillas para exponer las vísceras. </li><li> Recoger la sangre en tubos con EDTA recubiertos por punción cardiaca. </li><li> Cortar el diafragma a lo largo del hígado y retirar con cuidado el hígado a partir de las enterocoelia utilizando unas tijeras finas. Cortar tres piezas de tejido hepático para las siguientes mediciones de lípidos: a) 6 x 3 x 3 mm para la tinción H &amp; E, b) 6 x 3 x 3 mm para Oil Red O tinción, y c) 20-40 mg de hígado de cloroformo / extracción con metanol. </li></ol></li><li> H &amp; E tinción <ol><li> Fijar el hígado en 4% de acetato de formalina tamponada con fosfato a 4 ° C durante la noche y luego incrustarlo en cera de parafina. </li><li> Los cortes de secciones de parafina (5 micras) y montarlos en portaobjetos de vidrio para tinción H &amp; E, como se ha descrito previamente 3, 10. </li></ol></li><li> Oil Red O tinción <ol><li> preparación Regent <ol><li> Preparar la solución de trabajo Oil Red O con 10% de formalina, 60% de isopropanol, hematoxilina, y gelatina de glicerol. Disolver 0,5 g de Oil Red O en polvo con 100 ml de isopropanol y calentar en un baño de 60 ° C para hacer una solución de 0,5%. </li><li> Diluir con agua doblemente destilada (ddH2O) en una proporción de 3: 2 (3 ml de solución de reserva y 2 ml de ddH2O). Se filtra la solución de trabajo y dejar reposar durante al menos 10 minutos a temperatura ambiente. </li></ol></li><li> Incrustar el hígado en el compuesto temperatura óptima de corte (OCT) en APLastic caja de empotrar. Congelar a -20 ° C durante 30 min. Cortarlo en secciones de 8 micras en un micrótomo de congelación, montar el tejido en una diapositiva, y colocarlo a temperatura ambiente durante 30 min. </li><li> Coloque una toalla de papel en el fondo de una bañera de tinción y se vierte una pequeña cantidad de formalina al 10% para mojar la toalla de papel. Colocar el portaobjetos en la bañera de tinción y fijar las secciones congeladas de vapores de formaldehído durante 5 min a 4 ° C. </li><li> Sumergir el portaobjetos en isopropanol al 60% en la bañera de tinción durante 3 s; repita una vez. </li><li> Añadir unas gotas de solución de trabajo de Oil Red O a la diapositiva para cubrir todo el tejido y se incuba durante 15 min. Proteger el tejido de la luz a temperatura ambiente. </li><li> Enjuague el portaobjetos en la nueva isopropanol 60% en la bañera de tinción durante 3 s; repetir dos veces. </li><li> Enjuague suavemente el portaobjetos a través del agua destilada dos veces y eliminar el agua alrededor del tejido. Asegúrese de no secar el tejido. </li><li> Colocar el portaobjetos en hematoxilina durante 1 min y enjuagar suavemente con agua del grifo durante 5-10min. Enjuague suavemente el portaobjetos en agua destilada dos veces y mantener la con agua destilada hasta que esté listo para poner en el cubreobjetos. </li><li> Calentar la gelatina de glicerol en el microondas y colocar varias gotas en la parte superior del tejido. Coloque con cuidado el cubreobjetos en la parte superior y tener cuidado de no formar burbujas. </li><li> Observe la mancha con un microscopio y capturar imágenes usando característicos de 20X y 40X. </li></ol></li><li> Medición de lípidos del hígado <ol><li> Coloque el tejido del hígado diseccionado en un nuevo tubo de centrífuga de 2 ml de plástico. Homogeneizar en 1 ml de PBS con un homogeneizador y transferir el lisado a un nuevo tubo de vidrio de 15 mL. </li><li> Añadir 5 ml de cloroformo / metanol (2:, 1 v / v), vórtice la mezcla vigorosamente durante 1 min, y se deja reposar durante 2 horas en hielo. </li><li> Centrifugar a 1650 xg durante 10 min a 4 ° C; la mezcla debe separarse en 3 capas: la capa superior de metanol, el disco proteína media, y la parte inferior de cloroformo y lípidos. </li><li> tran<html> sfer la fase inferior en un nuevo tubo de vidrio usando una pipeta Pasteur de vidrio; no hay necesidad de conseguir cada gota de la fracción inferior. Ajuste el tubo a un lado en el hielo. </li><li> Añadir 600 l de 4 mM MgCl 2 y 1,5 ml de cloroformo a la fracción sobrenadante que queda en el tubo anterior y agitar vigorosamente. Incubar en hielo durante 30 min y se centrifuga a 1650 xg durante 10 min a 4 ° C. </li><li> Combinar la fase inferior con el primer tubo fase inferior mediante pipeta Pasteur. Desechar las capas altas y medias. </li><li> Evaporar el cloroformo bajo gas nitrógeno en un baño de 37 ° C. Lavar los lados de los tubos de vidrio a fondo con 200 l de 1% de Triton X-100 / cloroformo (v / v). Se evapora bajo gas nitrógeno. Disolver el lípido con 200 l de ddH2O y agitar bien para hacer la emulsión final. </li><li> Mida el total de triglicéridos (TG) y colesterol (TC) niveles mediante el uso de un kit de triglicéridos o colesterol de acuerdo con el protocolo del fabricantexref &quot;&gt; 3. NOTA: Los valores de lípidos se normalizan a los de las concentraciones de proteína en el homogeneizado inicial, según lo determinado por la cuantificación de proteínas 3. </li></ol></li></ol> 2. Modelo de hepatocitos de ratón primaria <ol><li> Aislamiento de hepatocitos primarios de ratón <ol><li> Anestesiar a cada ratón con un 6% de hidrato de cloral (10 l / g por vía intraperitoneal). </li><li> Aislar hepatocitos primarios, como se describió anteriormente 10. Se cultivan las células en cubreobjetos de vidrio recubiertos de colágeno en una placa de 6 pocillos de Oil Red O tinción. Para la extracción de los lípidos, sembrar las células en 10 cm placa de cultivo celular 10. </li></ol></li><li> El tratamiento con células y Oil Red O tinción <ol><li> Reemplazar el medio con 2 ml de medio de inanición y se incuba a 37 ° C durante 24 h. Tratarla con glucosa 30 mM y 100 nM de insulina. Incubar en una incubadora de cultivo de C 37 ° durante 24 h. </li><li> Aspirar el medio. Añadir 2 ml de PBS y agitar suavemente para enjuagar el medio; repita una vez. </li><li> Fijar el cubreobjetos al portaobjetos con una banda elástica. Exponer las células adherentes a la superficie exterior. Realizar la tinción Oil Red O como se describe anteriormente (paso 1.5). NOTA: Los niveles basales de la acumulación de lípidos son estimuladas con un alto nivel de glucosa más el tratamiento con insulina después de la privación de suero. Las gotas de lípidos se visualizaron por tinción con Oil Red O. </li></ol></li><li> Medición de lípidos <ol><li> El tratamiento de los hepatocitos con alto contenido de glucosa e insulina en la misma condición (paso 2.2.1). Añadir 1 ml de PBS a cada 10 cm de placa de cultivo celular. Raspar las células y los cosechan en nuevos tubos de vidrio de 15 ml, de la que alícuotas de 100 l se transfieren a tubos frescos de 1,5 ml para la cuantificación de proteínas. </li><li> Añadir 4 ml de cloroformo / metanol (2: 1, v / v) a los restantes 900 l de células. Someter a ultrasonidos para aproximadas 20 pitidos y luego agitar vigorosamente para liberarel lípido en las células. Incubar la mezcla en hielo durante 2 h. Realizar la extracción de lípidos (paso 1.6). </li></ol></li></ol>

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Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia. Financiación: Este trabajo fue apoyado por becas de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Nº 81270930, 31471129, 31671224 y) y los cien talentos del programa de la Academia de Ciencias de China (2013OHTP04) a YL

Hígado graso no alcohólico es una serie de enfermedades hepáticas progresivas que se asocia con el síndrome metabólico, la obesidad, la resistencia a la insulina, o diabetes mellitus tipo 2 (DM2) 11. El sello distintivo de hígado graso no alcohólico es la esteatosis, la acumulación de lípidos en los hepatocitos. Aquí, un espectro de métodos se presenta para caracterizar los fenotipos y los parámetros de la esteatosis hepática utilizando ratones DIO y hepatocitos primarios de ratón. ...

La obesidad es un problema de salud creciente en los países desarrollados y en desarrollo. Se ha informado de que una de las condiciones coexistentes frecuentemente asociados con la enfermedad de hígado graso no alcohólico (NAFLD), con una prevalencia que oscila entre 30 y 100 por ciento en pacientes con NAFLD 1. Debido a la fuerte correlación entre el hígado graso y la obesidad, obesidad (DIO) modelos de ratón inducidos por la dieta son ampliamente utilizados para estudiar los mecanismos moleculares complejos asociados con el desarrollo de hígado graso no alcohólico 2, 3, 4, 5, 6. La esteatosis hepática es la etapa más temprana de hígado graso no alcohólico, y puede progresar a la esteatohepatitis no alcohólica (EHNA), cirrosis, y en última instancia, el cáncer de hígado 7. Por lo tanto, el objetivo general de este método es generar modelos animales y celulares de las condiciones esteatósicos hepáticas y para prOvide protocolos detallados para un análisis de lípidos eficiente y precisa. Estos modelos y las mediciones son también útiles para la investigación de otros trastornos metabólicos, tales como resistencia a la insulina y la diabetes tipo 2. Como se identifica que la obesidad es uno de los factores de riesgo de hígado graso no alcohólico, un alto contenido de grasa, dieta alta en sacarosa (HFHS) que imita la dieta alta en grasas de tipo occidental se utiliza para inducir la obesidad en ratones. Posteriormente, el grado de esteatosis hepática puede ser evaluada utilizando diferentes métodos. En primer lugar, el peso corporal y el análisis de la composición corporal con la resonancia magnética nuclear (RMN) muestran la acumulación de lípidos durante la hora de comer. La masa grasa y masa magra se pueden cuantificar de una manera no invasiva y en tiempo real. Además, la resonancia magnética (MRI) se utiliza para mostrar tanto la de todo el cuerpo y la distribución de hígado de grasa. La señal de escala de grises del análisis de MRI se puede convertir una imagen de color pseudo-legible en, y la intensidad dela escala de grises y el color es hemi-cuantificable. Esta tecnología proporciona ventajas únicas para la medición de la acumulación de lípidos en animales vivos. En segundo lugar, el análisis histológico del hígado es el método más comúnmente utilizado para determinar la esteatosis hepática. Hematoxilina y eosina (H &amp; E) tinción histológica proporciona información, tales como la morfología de los hepatocitos y la infiltración de macrófagos, mientras que Oil Red O tinción muestra el tamaño y la posición de las gotas de lípidos en los hepatocitos. En tercer lugar, el análisis del contenido de lípidos mediante la extracción de cloroformo / metanol es una medida precisa y cuantitativa de los lípidos hepáticos. Los niveles totales de colesterol y triglicéridos se pueden medir con métodos bioquímicos. Es importante destacar que, el análisis de extracción de lípidos y Oil Red O tinción también se pueden utilizar en los hepatocitos tratados farmacéuticamente manipulado genéticamente o. La ventaja del presente método es su utilización de múltiples enfoques optimizados para generar modelos esteatósicos hepáticasy caracterizar exhaustivamente los fenotipos tanto in vivo como in vitro. Los modelos de ratones DIO pueden recapitular la patología y metabólicas fenotipos de la enfermedad de hígado graso humano. Otros parámetros metabólicos en humanos pueden ser replicados en este modelo, así 8. La generación del modelo de hepatocitos grasos sometidos en respuesta a los altos de glucosa e insulina es eficiente, útil y supera la limitación del trabajo costoso y lento ratón. Tomados en conjunto, estos métodos son suficientes y esencial para el estudio de la disfunción hepática de lípidos y resistencia a la insulina durante la sobrecarga de nutrientes.

<table><tbody><tr><td>O.C.T compound</td><td>SAKURA</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Oil Red O</td><td>Sigma</td><td>O0625-25G</td><td></td></tr><tr><td>Infinity Triglycerides kit</td><td>Fisher&amp;nbsp;Scientific</td><td>TR22421</td><td></td></tr><tr><td>Infinity Cholesterol kit</td><td>Fisher&amp;nbsp;Scientific</td><td>TR13421</td><td></td></tr><tr><td>Collagen type I, Rat tail</td><td>Millipore</td><td>08-115</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (low glucose)</td><td>Invitrogen</td><td>11885-092</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin / Streptomycin</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Invitrogen</td><td>10099141</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>cellgro</td><td>R21-040-CVR</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>cellgro</td><td>20-021-CV</td><td></td></tr><tr><td>Insulin</td><td>TOCRIS Bioscience</td><td>3435</td><td>dissolve in PBS, 1 mM for stock</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma</td><td>G8270-100G</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Olympus</td><td>BX53</td><td></td></tr><tr><td>Peristaltic pump</td><td>Longerpump</td><td>BT100-2J</td><td></td></tr><tr><td>10 cm cell culture dish</td><td>Corning</td><td>420167</td><td></td></tr><tr><td>6-well-plate</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>BCA assay</td><td>Beyotime</td><td>P0010</td><td></td></tr><tr><td>Nuclear Magnetic Resonance</td><td>Niumag technology</td><td>MiniQMR23-060H-I</td><td></td></tr><tr><td>High fat high surcose diet (HFHS)</td><td>Research Diets</td><td>D12327</td><td></td></tr></tbody></table>

optimized analysis of in vivo and in vitro hepatic steatosis

Establishing a system of procedures to qualitatively and quantitatively characterize in vivo and in vitro hepatic steatosis is important for metabolic study in the liver. Here, numerous assays are described to comprehensively measure the phenotype and parameters of hepatic steatosis in mouse and hepatocyte models. 
Combining the physiological, histological, and biochemical methods, this system can be used to assess the progress of hepatic steatosis. In vivo, the measurements of body weight and nuclear magnetic resonance (NMR) provide a general understanding of mice in a non-invasive manner. Hematoxylin and Eosin (H&amp;E) and Oil Red O staining determine the histological morphology and lipid deposition of liver tissue under nutrient overload conditions, such as high-fat diet feeding. Next, the total lipid contents are isolated by chloroform/methanol extraction, which are followed by a biochemical analysis for triglyceride and cholesterol. Moreover, mouse primary hepatocytes are treated with high glucose plus insulin to stimulate lipid accumulation, an efficient in vitro model to mimic diet-induced hyperglycemia and hyperinsulinemia in vivo. Then, the lipid deposition is measured by Oil Red O staining and chloroform/methanol extraction. Oil Red O staining determines intuitive hepatic steatotic phenotypes, while the lipid extraction analysis determines the parameters that can be analyzed statistically. The present protocols are of interest to scientists in the fields of fatty liver diseases, insulin resistance, and type 2 diabetes.

Como se muestra en la Figura 1A, el peso corporal del ratón se aumentó a 45 ± 1,2 g después de 16 semanas de alimentación HFHS, que es aproximadamente 1,5 veces mayor que en el grupo de alimentación de dieta de pienso. Los análisis de la composición corporal de RMN que muestra la masa grasa y la masa magra de ratones se indican (Figura 1B). Las distribuciones de grasa de todo el cuerpo y del hígado se determinó por resonancia magnética, y las ...

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Optimized Analysis of In Vivo and In Vitro Hepatic Steatosis

Here, optimized methods to generate in vivo and in vitro models of hepatic steatosis and to analyze the steatotic phenotypes and related physiological parameters are described.

Análisis optimizada de<em&gt; En Vivo</em&gt; y<em&gt; In Vitro</em&gt; La esteatosis hepática

Establishing a system of procedures to qualitatively and quantitatively characterize in vivo and in vitro hepatic steatosis is important for metabolic ...

optimized-analysis-of-in-vivo-and-in-vitro-hepatic-steatosis

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Medicine

Optimized Analysis of In Vivo and In Vitro Hepatic Steatosis

15.8K vistas.  Chinese Academy of Sciences. Here, optimized methods to generate in vivo and in vitro models of hepatic steatosis and to analyze the steatotic phenotypes and related physiological parameters are described. 

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Visualization and Analysis of Blood Flow and Oxygen Consumption in Hepatic Microcirculation: Application to an Acute Hepatitis Model

There is a considerable discrepancy between oxygen supply and demand in the liver because hepatic oxygen consumption is relatively high but about 70% of the hepatic blood supply is poorly oxygenated portal vein blood derived from the gastrointestinal tract and spleen. Oxygen is delivered to hepatocytes by blood flowing from a terminal branch of the portal vein to a central venule via sinusoids, and this makes an oxygen gradient in hepatic lobules. The oxygen gradient is an important physical parameter that involves the expression of enzymes upstream and downstream in hepatic microcirculation, but the lack of techniques for measuring oxygen consumption in the hepatic microcirculation has delayed the elucidation of mechanisms relating to oxygen metabolism in liver. We therefore used FITC-labeled erythrocytes to visualize the hepatic microcirculation and used laser-assisted phosphorimetry to measure the partial pressure of oxygen in the microvessels there. Noncontact and continuous optical measurement can quantify blood flow velocities, vessel diameters, and oxygen gradients related to oxygen consumption in the liver. In an acute hepatitis model we made by administering acetaminophen to mice we observed increased oxygen pressure in both portal and central venules but a decreased oxygen gradient in the sinusoids, indicating that hepatocyte necrosis in the pericentral zone could shift the oxygen pressure up and affect enzyme expression in the periportal zone. In conclusion, our optical methods for measuring hepatic hemodynamics and oxygen consumption can reveal mechanisms related to hepatic disease.

An optical system was developed to visualize hepatic microcirculation with FITC-labeled erythrocytes and to measure the partial pressure of oxygen in the microvessels with laser-assisted phosphorimetry. This method can be used to investigate physiological and pathological mechanisms by analyzing microvascular structure, diameter, blood flow velocity, and oxygen tension.

Visualización y análisis de flujo de la sangre y del consumo de oxígeno en la microcirculación hepática: Aplicación a un Modelo de cuadro de hepatitis aguda

There is a considerable discrepancy between oxygen supply and demand in the liver because hepatic oxygen consumption is relatively high but about 70% of ...

Investigación

Medicina

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. Here, we describe a general protocol for cell labeling, imaging, and image processing. The technique is applicable to various cell types and animal models, although here we focus on a typical mouse model for tracking murine immune cells. The most important issues for cell labeling are described, as these are relevant to all models. Similarly, key imaging parameters are listed, although the details will vary depending on the MRI system and the individual setup. Finally, we include an image processing protocol for quantification. Variations for this, and other parts of the protocol, are assessed in the Discussion section. Based on the detailed procedure described here, the user will need to adapt the protocol for each specific cell type, cell label, animal model, and imaging setup. Note that the protocol can also be adapted for human use, as long as clinical restrictions are met.

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

We describe a general protocol for in vivo cell tracking using MRI in a mouse model with ex vivo labeled cells. A typical protocol for cell labeling, image acquisition processing and quantification is included.

In vivo MRI de 19F para el seguimiento de la célula

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. ...

Measurement of Fatty Acid &#946;-Oxidation in a Suspension of Freshly Isolated Mouse Hepatocytes

Fatty acid &#946;-oxidation is a key metabolic pathway to meet the energy demands of the liver and provide substrates and cofactors for additional processes, such as ketogenesis and gluconeogenesis, which are essential to maintain whole-body glucose homeostasis and support extra-hepatic organ function in the fasted state. Fatty acid &#946;-oxidation occurs within the mitochondria and peroxisomes and is regulated through multiple mechanisms, including the uptake and activation of fatty acids, enzyme expression levels, and availability of cofactors such as coenzyme A and NAD+. In assays that measure fatty acid &#946;-oxidation in liver homogenates, cell lysis and the common addition of supraphysiological levels of cofactors mask the effects of these regulatory mechanisms. Furthermore, the integrity of the organelles in the homogenates is hard to control and can vary significantly between preparations. The measurement of fatty acid &#946;-oxidation in intact primary hepatocytes overcomes the above pitfalls. This protocol describes a method for the measurement of fatty acid &#946;-oxidation in a suspension of freshly isolated primary mouse hepatocytes incubated with 14C-labeled palmitic acid. By avoiding hours to days of culture, this method has the advantage of better preserving the protein expression levels and metabolic pathway activity of the original liver, including the activation of fatty acid &#946;-oxidation observed in hepatocytes isolated from fasted mice compared to fed mice.

Fatty acid &#946;-oxidation is an essential metabolic pathway responsible for generating energy in many different cell types, including hepatocytes. Here, we describe a method to measure fatty acid &#946;-oxidation in freshly isolated primary hepatocytes using 14C-labeled palmitic acid.

Medición de la β-oxidación de ácidos grasos en una suspensión de hepatocitos de ratón recién aislados

Fatty acid &#946;-oxidation is a key metabolic pathway to meet the energy demands of the liver and provide substrates and cofactors for additional ...

Bioquímica

Evaluación de la esteatosis hepática con reconstrucción de gotas lipídicas con fluorescencia 3D

Analysis of Fluorescent-Stained Lipid Droplets with 3D Reconstruction for Hepatic Steatosis Assessment

Lipid droplets (LDs) are specialized organelles that mediate lipid storage and play a very important role in suppressing lipotoxicity and preventing dysfunction caused by free fatty acids (FAs). The liver, given its critical role in the body's fat metabolism, is persistently threatened by the intracellular accumulation of LDs in the form of both microvesicular and macrovesicular hepatic steatosis. The histologic characterization of LDs is typically based on lipid-soluble diazo dyes, such as Oil Red O (ORO) staining, but a number of disadvantages consistently hamper the use of this analysis with liver specimens. More recently, lipophilic fluorophores 493/503 have become popular for visualizing and locating LDs due to their rapid uptake and accumulation into the neutral lipid droplet core. Even though most applications are well-described in cell cultures, there is less evidence demonstrating the reliable use of lipophilic fluorophore probes as an LD imaging tool in tissue samples. Herein, we propose an optimized boron dipyrromethene (BODIPY) 493/503-based protocol for the evaluation of LDs in liver specimens from an animal model of high-fat diet (HFD)-induced hepatic steatosis. This protocol covers liver sample preparation, tissue sectioning, BODIPY 493/503 staining, image acquisition, and data analysis. We demonstrate an increased number, intensity, area ratio, and diameter of hepatic LDs upon HFD feeding. Using orthogonal projections and 3D reconstructions, it was possible to observe the full content of neutral lipids in the LD core, which appeared as nearly spherical droplets. Moreover, with the fluorophore BODIPY 493/503, we were able to distinguish microvesicles (1 &#181;m &lt; d &#8804; 3 &#181;m), intermediate vesicles (3 &#181;m &lt; d &#8804; 9 &#181;m), and macrovesicles (d &gt; 9 &#181;m), allowing the successful discrimination of microvesicular and macrovesicular steatosis. Overall, this BODIPY 493/503 fluorescence-based protocol is a reliable and simple tool for hepatic LD characterization and may represent a complementary approach to the classical histological protocols.

Autor destacado: Análisis de gotas de lípidos teñidas con fluorescente con reconstrucción 3D para la evaluación de la esteatosis hepática  

Herein, we demonstrate an optimized BODIPY 493/503 fluorescence-based protocol for lipid droplet characterization in liver tissue. Through the use of orthogonal projections and 3D reconstructions, the fluorophore allows for successful discrimination between microvesicular and macrovesicular steatosis and may represent a complementary approach to the classical histological protocols for hepatic steatosis assessment.

Análisis de gotitas de lípidos teñidas con fluorescencia con reconstrucción 3D para la evaluación de la esteatosis hepática

Lipid droplets (LDs) are specialized organelles that mediate lipid storage and play a very important role in suppressing lipotoxicity and preventing ...

Inducing and Characterizing Vesicular Steatosis in Differentiated HepaRG Cells

Hepatic steatosis represents a metabolic dysfunction that results from an accumulation of triglyceride-containing lipid droplets in hepatocytes. Excessive fat accumulation leads to non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD), &#160;which is potentially reversible and may evolve into non-alcoholic steatohepatitis (NASH) and eventually cirrhosis and hepatocellular carcinoma (HCC). The molecular mechanisms linking lipid accumulation in hepatocytes with the progression to NASH, irreversible liver damage, fibrosis, cirrhosis, and even HCC still remains unclear. To this end, several in vitro and in vivo models have been developed to elucidate the pathological processes that cause NAFLD. In the present study, we describe a cellular model for the induction of liver vesicular steatosis that consists of DMSO-differentiated human hepatic HepaRG cells treated with the fatty acid salt sodium oleate. Indeed, sodium oleate-treated HepaRG cells accumulate lipid droplets in the cytoplasm and show typical features of steatosis. This in vitro human model represents a valuable alternative to in vivo mice models as well as to the primary human hepatocytes. We also present a comparison of several methods for the quantification and evaluation of fat accumulation in HepaRG cells, including Oil Red O staining, cytofluorimetric Bodipy measurement, metabolic gene expression analysis by qPCR, and coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) microscopy. CARS imaging combines the chemical specificity of Raman spectroscopy, a chemical analysis technique well-known in materials science applications, with the benefits of high-speed, high-resolution non-linear optical microscopies to allow precise quantification of lipid accumulation and lipid droplet dynamics. The establishment of an efficient in vitro model for the induction of vesicular steatosis, alongside an accurate method for the quantification and characterization of lipid accumulation, could lead to the development of early stage diagnosis of NAFLD via the identification of molecular markers, and to the generation of new treatment strategies.

In this study, we describe a detailed protocol for inducing liver vesicular steatosis in differentiated HepaRG cells with the fatty acid salt sodium oleate and employ methods for detection and quantification of lipid accumulation, including coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) microscopy, cytofluorimetric analysis, Oil red O staining, and qPCR.&#160;

Inducir y caracterizar la esteatosis vesicular en células hepa-repartidas diferenciadas

Hepatic steatosis represents a metabolic dysfunction that results from an accumulation of triglyceride-containing lipid droplets in hepatocytes. Excessive ...

Determination of Fatty Acid Oxidation and Lipogenesis in Mouse Primary Hepatocytes

Lipid metabolism in liver is complex. In addition to importing and exporting lipid via lipoproteins, hepatocytes can oxidize lipid via fatty acid oxidation, or alternatively, synthesize new lipid via de novo lipogenesis. The net sum of these pathways is dictated by a number of factors, which in certain disease states leads to fatty liver disease. Excess hepatic lipid accumulation is associated with whole body insulin resistance and coronary heart disease. Tools to study lipid metabolism in hepatocytes are useful to understand the role of hepatic lipid metabolism in certain metabolic disorders.
In the liver, hepatocytes regulate the breakdown and synthesis of fatty acids via &#946;-fatty oxidation and de novo lipogenesis, respectively. Quantifying metabolism in these pathways provides insight into hepatic lipid handling. Unlike in vitro quantification, using primary hepatocytes, making measurements in vivo is technically challenging and resource intensive. Hence, quantifying &#946;-fatty acid oxidation and de novo lipogenesis in cultured mouse hepatocytes provides a straight forward method to assess hepatocyte lipid handling. 
Here we describe a method for the isolation of primary mouse hepatocytes, and we demonstrate quantification of &#946;-fatty acid oxidation and de novo lipogenesis, using radiolabeled substrates.

De novo lipogenesis and &#946;-fatty acid oxidation constitute key metabolic pathways in hepatocyte, pathways that are perturbed in several metabolic disorders, including fatty liver disease. Here we demonstrate isolation of mouse primary hepatocytes and describe quantification of &#946;-fatty acid oxidation and lipogenesis.

Determinación de la oxidación de ácidos grasos y la lipogénesis en el ratón hepatocitos primarios

Lipid metabolism in liver is complex. In addition to importing and exporting lipid via lipoproteins, hepatocytes can oxidize lipid via fatty acid ...

Biología

A Model of Experimental Steatosis In Vitro: Hepatocyte Cell Culture in Lipid Overload-Conditioned Medium

Metabolic dysfunction-associated fatty liver disease (MAFLD), previously known as non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD), is the most prevalent liver disease worldwide due to its relationship with obesity, diabetes type 2, and dyslipidemia. Hepatic steatosis, the accumulation of lipid droplets in the liver parenchyma, is a key feature of the disease preceding the inflammation observed in steatohepatitis, fibrosis, and end-stage liver disease. Lipid accumulation in hepatocytes might interfere with proper metabolism of xenobiotics and endogenous molecules, as well as to induce cellular processes leading to the advance of the disease. Although the experimental study of steatosis can be performed in vivo, in vitro approaches to the study of steatosis are complementary tools with different advantages. Hepatocyte culture in lipid overload-conditioned medium is an excellent reproducible option for the study of hepatic steatosis allowing the identification of cellular processes related to lipid accumulation, such as oxidative and reticular stresses, autophagia, proliferation, cell death, etcetera, as well as other testing including drug effectiveness, and toxicological testing, among many other possible applications. Here, it was aimed to describe the methodology of hepatocyte cell culture in lipid overload-conditioned medium. HepG2 cells were cultured in RMPI 1640 medium conditioned with sodium palmitate and sodium oleate. Importantly, the ratio of these two lipids is crucial to favor lipid droplet accumulation, while maintaining cell proliferation and a moderate mortality rate, as occurs in the liver during the disease. The methodology, from the preparation of the lipid solution stocks, mixture, addition to the medium, and hepatocyte culture is shown. With this approach, it is possible to identify lipid droplets in the hepatocytes that are readily observable by Oil-red O staining, as well as curves of proliferation/mortality rates.

A Model of Experimental Steatosis In Vitro: Hepatocyte Cell Culture in Lipid Overload-Conditioned Medium

This protocol is intended to be a tool to study steatosis and the molecular, biochemical, cellular changes produced by the over exposure of hepatocytes to lipids in vitro.

Un modelo de esteatosis experimental in vitro:cultivo de células de hepatocitos en medio condicionado por sobrecarga lipídica

Metabolic dysfunction-associated fatty liver disease (MAFLD), previously known as non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD), is the most prevalent liver ...

Novel In Vivo Micro-Computed Tomography Imaging Techniques for Assessing the Progression of Non-Alcoholic Fatty Liver Disease

Non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) is a growing global health issue, and the impact of NAFLD is compounded by the current lack of effective treatments. Considerable limiting factors hindering the timely and accurate diagnosis (including grading) and monitoring of NAFLD, as well as the development of potential therapies, are the current inadequacies in the characterization of the hepatic microenvironment structure and the scoring of the disease stage in a spatiotemporal and non-invasive manner. Using a diet-induced NAFLD mouse model, we investigated the use of in vivo micro-computed tomography (CT) imaging techniques as a non-invasive method to assess the progression stages of NAFLD, focusing predominantly on the hepatic vascular network due to its significant involvement in NAFLD-related hepatic dysregulation. This imaging methodology allows for longitudinal analysis of liver steatosis and functional tissue uptake, as well as the evaluation of the relative blood volume, portal vein diameter, and density of the vascular network. Understanding the adaptations of the hepatic vascular network during NAFLD progression and correlating this with other ways of characterizing the disease progression (steatosis, inflammation, fibrosis) using the proposed method can pave the way toward the establishment of new, more efficient, and reproducible approaches for NAFLD research in mice. This protocol is also expected to upgrade the value of preclinical animal models for investigating&#160;the development of novel therapies against disease progression.

Novel In Vivo Micro-Computed Tomography Imaging Techniques for Assessing the Progression of Non-Alcoholic Fatty Liver Disease

Using a diet-induced non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) mouse model, we describe the use of novel in vivo micro-computed tomography imaging techniques as a non-invasive method to assess the progression stages of NAFLD, focusing predominantly on the hepatic vascular network due to its significant involvement in NAFLD-related hepatic dysregulation.

Análisis optimizada de

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Visualización y análisis de flujo de la sangre y del consumo de oxígeno en la microcirculación hepática: Aplicación a un Modelo de cuadro de hepatitis aguda

In vivo MRI ^{de 19F} para el seguimiento de la célula

Medición de la β-oxidación de ácidos grasos en una suspensión de hepatocitos de ratón recién aislados

Análisis de gotitas de lípidos teñidas con fluorescencia con reconstrucción 3D para la evaluación de la esteatosis hepática

Análisis de gotitas de lípidos teñidas con fluorescencia con reconstrucción 3D para la evaluación de la esteatosis hepática

Análisis de gotitas de lípidos teñidas con fluorescencia con reconstrucción 3D para la evaluación de la esteatosis hepática

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Determinación de la oxidación de ácidos grasos y la lipogénesis en el ratón hepatocitos primarios

Un modelo de esteatosis experimental in vitro:cultivo de células de hepatocitos en medio condicionado por sobrecarga lipídica

Nuevas técnicas de imagen de microtomografía computarizada in vivo para evaluar la progresión de la enfermedad del hígado graso no alcohólico