Name: analysis of cap-binding proteins in human cells exposed to physiological oxygen conditions
Uploaded: 2016-12-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 40 s
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This work was supported by the Natural Sciences and Engineering Council of Canada and the Ontario Ministry of Research and Innovation.

1. Preparativos para Cultura de Células <ol><li> Comprar ações disponíveis no mercado de células humanas. NOTA: Este protocolo utiliza carcinoma colorectal HCT116 e células primárias humanas renais proximais tubulares epiteliais (HRPTEC). </li><li> Adicione 500 ml de meio de cultura de HCT116: de Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM), meio de glucose / alta suplementado com 7,5% de Soro Fetal Bovino (FBS) e 1% de penicilina / estreptomicina (P / S). </li><li> Adicione 500 ml de meio de cultura de HRPTEC: meio de células epiteliais suplementado com FBS a 5%, suplemento de crescimento de células epiteliais de 1%, e 1% de P / S. </li><li> Preparar 500 ml de 1x Solução Salina Tamponada com Fosfato (PBS): NaCl 140 mM, KCl a 3 mM, 10 mM de Na 2 HPO 4, 15 mM de KH 2 PO 4. Ajustar o pH para 7,4 e esterilizar em autoclave durante 40 min a 121 ° C. </li></ol> 2. Início de cultura de células <ol><li> Aspirar cuidadosamente o meio de um prato confluentes 80-90% sem perturbar tele células. </li><li> Alíquotas 3-5 ml de 1x PBS por placa de cultura, agite levemente cada frasco para revestir a área da superfície do prato, e cuidadosamente aspirar o PBS 1x. Repita o procedimento para uma segunda lavagem 1x PBS. </li><li> Aliquota de 3 ml de ácido etilenodiaminotetra-tripsina a 0,05% (EDTA) em cada placa de cultura e agitar suavemente para revestir uniformemente as células com tripsina-EDTA. Incubar a 37 ° C durante 2-3 min. </li><li> Transferir as células destacadas para um tubo de centrífuga de 15 ml e centrifugar a 4000 xg durante 90 seg. </li><li> Ressuspender o sedimento celular em 1 ml de DMEM completo. </li><li> Contagem de células utilizando um hemocitómetro. Calcula quantos não pirogénica e 100 milímetros de poliestireno celular de cultura de pratos são necessárias para alcançar uma densidade de sementeira inicial de cerca de 2.500-5.000 células por cm2. </li><li> meio completo pré-quente de cultura celular feito em etapas 1.2 ou 1.3 em um 37 ° C banho de água por 30-45 min. </li><li> Descontaminar a garrafa médio e frasco de células com etanol 70%. Deste ponto em diante tudooperações devem ser realizadas de forma asséptica. </li><li> Aliquota 6 ml de DMEM completo em tantas placas de cultura de células de 100 mm é necessária para utilizar todo o volume de células congeladas dentro da densidade de sementeira mencionada no passo 2.6. </li><li> Transferir o volume de suspensão de células no passo 2.6 calculada para cada um dos pratos de cultura de 100 mm. Rocha cada placa manualmente para distribuir uniformemente as células sobre a superfície da placa. </li><li> Colocar a placa de cultura de célula de 100 milímetros semeado na incubadora a 37 ° C numa atmosfera de 5% de CO 2. Permitir que as células a incubar, pelo menos, 24 h antes de os passos seguintes. </li></ol> 3. Subcultura <ol><li> Ver cada prato de cultura de células sob um microscópio para determinar a percentagem de confluência celular (% de células que cobrem a área do prato). Retorno células para a incubadora e meio completo pré-quente e 1x PBS. Vá para a próxima etapa se as células são 80-100% confluentes. </li><li> Aspirar cuidadosamente o meio passou sem perturbar oAs células em cada placa de cultura. </li><li> Alíquotas 3-5 ml de 1x PBS por placa de cultura, agite levemente cada frasco para revestir a área da superfície do prato, e cuidadosamente aspirar o PBS 1x. Repita o procedimento para uma segunda lavagem 1x PBS. </li><li> Alíquota de 3 ml de 0,05% de tripsina-EDTA em cada placa de cultura e agite levemente para uniformemente revestir as células com tripsina-EDTA. Incubar a 37 ° C durante 2-3 min. </li><li> Durante esta incubação, uma alíquota de 10 ml de meio completo em tantas placas de cultura são necessários para obter a densidade celular de 2.500-5.000 células por cm2. </li><li> Quando as células terem separado da placa, adicionar rapidamente 3 ml de inibidor de tripsina 1x definido e agitar suavemente o prato durante 1 minuto para assegurar que toda a tripsina-EDTA foi neutralizado. </li><li> Transferência das células isoladas em um 15 ml tubo de centrífuga estéril e reserve. Adicionar 3 ml de 1x PBS para o prato para recolher quaisquer células restantes, e transferir o mesmo que para 15 ml tubo de centrífuga. </li><li> Agregar as células por centrifugação a 150 xgdurante 5 min. </li><li> Aspirar o sobrenadante e ressuspender o sedimento de células em 3 ml de meio completo. </li><li> Contagem de células utilizando um hemocitómetro e semear placas de cultura de 150 mm contendo 15 ml de meio completo para se obter uma densidade celular de 2.500-5.000 células por cm2. Use duas 150 mm para cada ensaio de ligação cap. NOTA: Oxygen difusão de células através de meios líquidos é dependente do volume 36. Recomenda-se para manter o volume do meio consistente entre as experiências se as células aderentes ou células em suspensão são utilizados. Os meios podem ser pré-condicionado (incubados na estação de trabalho, durante 24 h, como discutido em Discussão) para evitar estas variabilidades em difusão. </li><li> Colocar os pratos de cultura semeado na incubadora a 37 ° C numa atmosfera de 5% de CO 2. Permitir que as células a incubar pelo menos 24 horas antes de prosseguir para as próximas etapas. </li></ol> 4. A exposição Physioxic <ol><li> Ver as células ao microscópio. para besresultados t, assegurar que as células são 70-80% confluentes para uma exposição de 24 horas, 50-60% confluentes para uma exposição de 48 horas, e 40-50% confluentes para uma exposição de 72 horas. </li><li> Colocar as células em hipoxia uma estação de trabalho durante o tempo desejado (24, 48, ou 72 horas, dependendo da experiência). </li><li> Defina a estação de trabalho para o physioxia apropriado. NOTA: Por exemplo, uma configuração de 3% de O2 seria acompanhado por 5% de CO 2 e 92% de N2. NOTA: Se as flutuações de oxigênio dentro de um intervalo dinâmico são desejados ao longo de um cronograma específico, o programa da agenda para o instrumento ou ajustar manualmente as configurações de oxigênio nos intervalos desejados. </li><li> Ajuste a umidade para 60%. A atmosfera da estação de trabalho é muito seco, no entanto, e meios de comunicação visivelmente evaporar durante experimentos longos (&gt; 48 h). Manter uma reserva de mídia em uma garrafa de cultura de célula dentro da estação de trabalho (de modo que a mídia está equilibrada com a atmosfera estação de trabalho) para repor os meios de comunicação no dis cultura de célulashes. NOTA: Qualquer solução que vai interagir com as células antes da lise (tal como PBS e tripsina-EDTA) deve ser pré-condicionadas durante 24 horas antes da utilização dentro da estação de trabalho de hipoxia de modo que o oxigénio dissolvido se equilibra com o oxigénio atmosférico 36. </li><li> Manter as células no interior da estação de trabalho até a lise. </li></ol> 5. Amortecedores preparando para Ensaio Cap-obrigatório <ol><li> Prepare 1x Tris salina (TBS). <ol><li> Em 800 mL de dH2O, dissolve-se 8,76 g de NaCl e 6,05 g de Tris Base. </li><li> Levar a solução a um pH final de 7,4 utilizando HCl 1 M. </li><li> Levar o volume final de 1 L utilizando dH2O </li></ol></li><li> Preparar tampão de lise não desnaturante. Preparar tampão de lise no dia do ensaio de ligação a tampa. Adicione tampão de lise adicional para lavar as pérolas de agarose em branco e o γ-aminofenil-m 7 GTP agarose C10-ligados (passos 7.9 e 7.13). <ol><li> Em 7 ml de dH 2 O, adicionar 160 ul de 5 M NaCl, 160 ul de 1 M de Tris-HCl pH 7,4, 40 ul de 200 mM de NaF, 40 ul de 1 M de MgCl2, e ortovanadato de sódio 1 mM 40 ul. </li><li> Adicionar 40 ul de Igepal-se à solução 7 ml. Cortar a ponta da pipeta para ajudar a recuperar o Igepal, uma vez que é extremamente viscoso. </li><li> Misturar por pipetagem para cima e para baixo, ou de vórtice, a solução 7 ml até todo o Igepal foi dissolvido. </li><li> Aumentar o volume final da solução de 8 ml e manter em gelo. </li></ol></li><li> Prepare tampão de 4x Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) -Page Sample. <ol><li> Numa proveta, combinar 16 ml de 1 M de Tris-HCl pH 6,8, 12,64 ml de glicerol, e 8 ml de ditiotreitol (DTT). </li><li> Adicionar 3,2 g de SDS e 0,16 g de azul de bromofenol. Permitir que o pó se dissolver completamente, misturando com uma barra de agitação magnética. </li><li> Alíquota em 1,5 ml tubos de microcentrífuga e armazenar a -20 ° C. </li></ol></li></ol> 6. Lise Celular <ol><li> Preparar tampão de lise não desnaturante e manter em gelo do dia do the ensaio de ligação cap-. </li><li> Pré-aquecido PBS 1x tripsina e num banho de água a 37 ° C durante 30 min. </li><li> Alíquotas de 980 ul de tampão de lise para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml para cada teste de ligação de tampa a ser realizada. </li><li> Adicionar 10 ul de 4- (2-aminoetil) benzenossulfonilo cloridrato de fluoreto e 10 ul de mistura de inibidores de protease 100X aos 980 ul de tampão de lise. Manter em gelo. </li><li> Descarte a mídia a partir de cada prato 150 mm de um recipiente de resíduos dentro da estação de trabalho hipóxia. </li><li> Lavar as células com 3-4 ml de PBS morno 1x e descartar todo o líquido. </li><li> Adicionar 1 ml de 0,05% de tripsina quente-EDTA a cada placa e deixar repousar durante 2 minutos ou até que as células não estão aderidas à chapa. </li><li> Usando uma pipeta, transferir as células de uma placa para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Repita conforme necessário de modo a que cada placa de células é transferida para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml separado. </li><li> Centrifugar os tubos de 1,5 ml de microcentrífuga a 6.000 xg durante 90 seg tO sedimentar as células. </li><li> Aspirar a tripsina usando uma pipeta, sem perturbar o sedimento. Se o sedimento é perturbado, re-centrifugar o tubo de microcentrífuga de 1,5 ml a 6000 xg durante 90 seg. </li><li> Lavam-se as células com PBS morno 1x pipetando suavemente 200 ul de PBS para dentro do tubo imediatamente acima do sedimento. Re-se o sedimento de centrifugação é perturbado. </li><li> Aspirar o PBS sem perturbar o sedimento. </li><li> Pipetar 500 ul de 1 ml dos preparados solução tampão de lise sobre o primeiro sedimento celular. Ressuspender o sedimento inteiramente por pipetagem cima e para baixo. </li><li> Combine as células ressuspensas com o segundo agregado de células e ressuspender o pellet segunda pipetando cima e para baixo. Repetir este processo até que todos os peletes foram combinadas e ressuspensas para cada amostra. </li><li> Combinar o lisado com os restantes 500 ul de tampão de lise em um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. </li><li> Retirar amostras a partir da estação de trabalho hipóxia. NOTA: Depois de adicionar tampão de lise, all passos subsequentes devem ser realizadas no ar ambiente como a estação de trabalho hipoxia é definido como 37 ° C e os passos seguintes são para ser realizada a frio (4 ° C ou sobre gelo). </li><li> Lisar as células, utilizando agitação suave através da rotação das amostras a 4 ° C durante 1,5-2 h. </li><li> Centrifugar as células lisadas a 12000 xg durante 15 min a 4 ° C para remover os restos celulares. </li><li> Transferir o lisado para um novo tubo de microcentrifugação de 1,5 mL e rejeitar o sedimento. </li><li> Reservar uma parte (5-10%) do sobrenadante a ser usado como um controle de entrada de lisado de células inteiras para futura análise Western Blot. </li></ol> 7. Ensaio de ligação Cap <ol><li> Para cada amostra, transferir 50 ul da suspensão de esferas de agarose de controlo em branco e 50 ul da suspensão do grânulo γ-aminofenil-m 7 GTP de agarose-C10 ligado para separar 1,5 ml de tubos de microcentrífuga. Utilize uma tesoura para remover a ponta da pipeta para facilitar a recolha da pasta de grânulo. </li><li> Sedimentar as contas bY centrifugação da suspensão a 500 xg durante 30 seg. </li><li> Remover o sobrenadante e ressuspender cuidadosamente as pérolas em 500 ul de TBS. </li><li> Repita os passos 7.2 e 7.3. Sedimentar as pérolas a 500 xg durante 30 seg e remover o sobrenadante. </li><li> Transferir o sobrenadante contendo o lisado proveniente de passo de 6,19 para o tubo de microcentrífuga de 1,5 ml contendo as contas de agarose em branco. NOTA: As esferas de agarose em branco actuar como um passo de pré-limpeza para remover as proteínas a partir do lisado que não interagem especificamente com o grânulo. </li><li> Incubar durante 10 min a 4 ° C com agitação suave. </li><li> Sedimentar as pérolas de agarose em branco por centrifugação a 500 xg durante 30 seg. </li><li> Transferir o lisado para o tubo de microcentrífuga de 1,5 ml contendo os γ-aminofenil-m 7 GTP agarose contas ligadas a C10. </li><li> Lavam-se as pérolas de agarose em branco por ressuspensão das pérolas em 500 ul de tampão de lise, sedimentando os grânulos por centrifugação a 500 xg durante 30 seg, e descartando o Supernatant. Repetir este quatro vezes para um total de cinco lavagens. </li><li> Ressuspender as esferas de agarose em tampão de amostra em branco 1x SDS-PAGE, e os grânulos ferver durante 90 segundos a 95 ° C. Armazenar a -20 ° C para futura análise de Western blot para observar se a proteína de interesse se liga não especificamente à esfera. </li><li> Incubar o lisado com os grânulos γ-aminofenil-m 7 GTP de agarose-C10 com ligações com agitação suave durante 1 hora a 4 ° C para capturar as proteínas de ligação ao tampão. </li><li> Agregar as γ-aminofenil-m 7 GTP agarose contas ligadas a C10 por centrifugação a 500 xg durante 30 seg. Descartar o sobrenadante. </li><li> Lavar as γ-aminofenil-m 7 GTP esferas de agarose ligadas-C10, repetindo o passo 7.9. </li><li> Ressuspender as pérolas em 600 ul de tampão de lise. </li><li> Adicionar GTP a uma concentração final de 1 mM. </li><li> Incubar as γ-aminofenil-m 7 GTP esferas de agarose ligadas-C10 + GTP 1 mM, com agitação suave durante 1 hora a 4 ° C. Nota: Esteirá dissociar as proteínas que não interactuam especificamente com M 7 GTP (isto é, também interagir com GTP não-metilada). </li><li> Agregar as γ-aminofenil-m 7 GTP agarose contas ligadas a C10 por centrifugação a 500 xg durante 30 seg. </li><li> Transferir o sobrenadante para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml e adicionar 200 ul de tampão de amostra 4x de SDS-PAGE (Tris 50 mM-HCl, DTT 100 mM, SDS a 2%, 0,1% de azul de bromofenol e glicerol a 10%). Armazenar a amostra de controlo de GTP a -20 ° C para futura análise de Western blot 37. Lave as contas repetindo o passo 7.9. </li><li> Ressuspender as esferas em 1x tampão de amostra de SDS-PAGE (Tris 50 mM-HCl, DTT 100 mM, SDS a 2%, 0,1% de azul de bromofenol e glicerol a 10%), e ferver a 95 ° C durante 90 seg. Armazenar a fracção m-7 GTP ligado a -20 ° C para futura análise de Western blot 37. </li></ol>

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E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ISG15+modification+of+the+eIF4E+cognate+4EHP+enhances+cap+structure-binding+activity+of+4EHP.">ISG15 modification of the eIF4E cognate 4EHP enhances cap structure-binding activity of 4EHP.</a> Genes Dev. 21 (3), 255-260 (2007).</li><li>Kedersha, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+that+ternary+complex+(eIF2-GTP-tRNA(i)(Met))-deficient+preinitiation+complexes+are+core+constituents+of+mammalian+stress+granules.">Evidence that ternary complex (eIF2-GTP-tRNA(i)(Met))-deficient preinitiation complexes are core constituents of mammalian stress granules.</a> Mol Biol Cell. 13 (1), 195-210 (2002).</li><li>Gu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+the+structure,+mechanism,+and+regulation+of+scavenger+mRNA+decapping+activity.">Insights into the structure, mechanism, and regulation of scavenger mRNA decapping activity.</a> Mol Cell. 14 (1), 67-80 (2004).</li><li>Szczepaniak, S. A., Zuberek, J., Darzynkiewicz, E., Kufel, J., Jemielity, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affinity+resins+containing+enzymatically+resistant+mRNA+cap+analogs--a+new+tool+for+the+analysis+of+cap-binding+proteins.">Affinity resins containing enzymatically resistant mRNA cap analogs--a new tool for the analysis of cap-binding proteins.</a> RNA. 18 (7), 1421-1432 (2012).</li><li>Joshi, B., Cameron, A., Jagus, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+mammalian+eIF4E-family+members.">Characterization of mammalian eIF4E-family members.</a> Eur J Biochem. 271 (11), 2189-2203 (2004).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

A análise de proteínas de ligação de PAC em células humanas expostas a condições fisiológicas de oxigénio pode permitir a identificação de novos factores de iniciação de tradução regulada de oxigénio. A afinidade destes factores para a tampa 5 &#39;do mRNA ou de outras proteínas associadas a tampa pode ser medida pela força da sua associação a 7 m-GTP ligados esferas de agarose. Uma limitação desta técnica é que ele mede o potencial de ligação a tampa de proteínas pós-lise, mas é ...

Controle de translação está a emergir como um passo igualmente importante para a regulação da transcrição na expressão do gene, especialmente durante períodos de estresse celular 1. Um ponto focal de controlo de tradução é para o passo limitante da velocidade de início em que os primeiros passos da síntese de proteínas envolve a ligação do factor eucariótico de iniciação 4E (eIF4E) para o 7-metilguanosina (m 7 GTP) 5 &#39;tampão de mRNAs 2 . eIF4E é parte de um complexo trimérico chamado eIF4F que inclui elF4A, uma helicase de ARN, e eIF4G, uma proteína andaime necessário para o recrutamento de outros factores de tradução e os ribossomas 40S 3. Sob condições fisiológicas normais, a grande maioria dos mRNAs são traduzidas por um mecanismo dependente da tampa, mas sob períodos de stress celular, aproximadamente 10% de mRNAs humanos contêm 5 &#39;UTRs que podem permitir a tradução independente de cap iniciação 1,4. tradução dependente de Cap tem sido historicamente sinônimoous com eIF4F, no entanto, variações específicas de estresse dos eIF4F tornaram-se um trending topic 5-8. Várias tensões celulares causar actividade eIF4E a ser reprimido através do alvo de mamífero do complexo rapamicina 1 (mTORC1). Esta quinase torna-se prejudicada sob estresse, o que resulta no aumento da atividade de um dos seus alvos, proteína do 4E de ligação (4E-BP). Não fosforilada 4E-BP liga-se a eIF4E e bloqueia a sua capacidade de interagir com eIF4G fazendo com que a repressão da tradução dependente de tampão 9,10. Curiosamente, um homólogo de eIF4E chamado eIF4E2 (ou 4EHP) tem uma afinidade muito menor para 4E-BP 11, permitindo que ele talvez para evadir a repressão mediada por stress. Com efeito, caracterizada inicialmente como um repressor da tradução devido à sua falta de interacção com eIF4G 12, eIF4E2 inicia a tradução de centenas de ARNm que contêm elementos de resposta a hipoxia de ARN na sua UTR 3 &#39;durante o stress hipóxico 6,13. Este i activaçãos alcançado através de interações com ligação eIF4G3, RNA motivo de proteína 4 e 2α o fator inducible hipoxia (HIF) para constituir um complexo eIF4F hipóxica ou eIF4F H 6,13. Como um repressor em condições normais, se liga com eIF4E2 GIGYF2 e ZNF598 14. Estes complexos foram, em parte, identificados através de m 7 resinas GTP de afinidade de agarose ligadas. Este método clássico 15 é padrão na área de tradução e é os ensaios de melhor e mais comumente utilizado técnica para isolar complexos de ligação de PAC em puxar para baixo e in vitro de ligação 16-19. À medida que a maquinaria de tradução dependente de tampão está a emergir como flexível e adaptável com partes inter- mudando 6-8,13, este método é uma ferramenta poderosa para identificar rapidamente novas proteínas de ligação ao tampão envolvidas na resposta ao stress. Além disso, as variações na eIF4F poderia ter implicações amplas como vários sistemas modelo eucarióticos parecem usar um homólogo eIF4E2 para as respostas ao estresse taiscomo A. thaliana 20, S. Pombe 21, 22 de D. melanogaster e C. elegans 23. As evidências sugerem que variações no eIF4F pode não ser estritamente limitado a condições de estresse, mas estar envolvidos na fisiologia normal 24. O fornecimento de oxigénio para os tecidos (em extremidades capilares) ou dentro dos tecidos (medida através de microeléctrodos) varia de 2-6% no cérebro 25, 3-12% nos pulmões 26, 3,5-6% no intestino 27, 4% em o fígado 28, 7-12% no rim 29, 4% no músculo 30, e 6-7% na medula óssea 31. Células e mitocôndrias contêm menos de 1,3% de oxigênio 32. Estes valores são muito mais próximos à hipoxia do que a do ar ambiente, quando as células são cultivadas por rotina. Isto sugere que o que foram previamente pensado como processos celulares específicas de hipóxia pode ser relevante em um ambiente fisiológico. Curiosamente, eIF4F e H eIF4F </sup&gt; participar activamente na iniciação da tradução de piscinas distintas ou classes de mRNAs em várias linhas de células humanas diferentes expostas ao oxigénio fisiológica ou &quot;physioxia&quot; 24. Baixo oxigênio também impulsiona o desenvolvimento fetal adequado 33 e células geralmente têm taxas mais elevadas de proliferação, a expectativa de vida mais longos, menos danos ao DNA e menos respostas de estresse geral em physioxia 34. Portanto, é provável H eIF4F um factor-chave na expressão de genes selecionados em condições fisiológicas. Aqui, nós fornecemos um protocolo para células de cultura em condições de oxigénio fisiológicas fixos ou em um intervalo de flutuação dinâmica que é provável mais representativo do microambiente do tecido. Uma vantagem deste método é que as células são lisadas dentro da estação de trabalho hipóxia. Não é claro como muitas vezes a transição a partir da cultura de células hipóxicas à lise das células é realizada em outros protocolos. As células são muitas vezes removidos em primeiro lugar a partir de uma pequena incubadora ser hipoxiatona lise, mas esta exposição ao oxigénio poderia afectar vias bioquímicas como a resposta celular ao oxigénio é rápido (uma ou duas min) 35. Certas proteínas de ligação PAC necessitem de interações com uma segunda base ou pode hidrolisar o GTP m 7, portanto, alguns interagentes cap podem ser desperdiçada no processo de purificação. Agarose ligada aos análogos cap resistentes enzimaticamente pode ser substituído neste protocolo. Explorando a atividade e composição do eIF4F H e outras variações de eIF4F através do método descrito aqui vai lançar luz sobre os mecanismos de expressão genética intrincados que as células utilizam durante as condições fisiológicas ou respostas ao estresse.

<table><tbody><tr><td>&amp;gamma;-aminophenyl-m&lt;sup&gt;7&lt;/sup&gt;GTP agarose C&lt;sub&gt;10&lt;/sub&gt;-linked beads</td><td>Jena Bioscience</td><td>AC-1555</td><td>Agarose-linked m&lt;sup&gt;7&lt;/sup&gt;GTP</td></tr><tr><td>100 mm culture dish</td><td>Corning</td><td>877222</td><td>10-cm culture dish</td></tr><tr><td>150 mm culture dish</td><td>Thermofisher</td><td>130183</td><td>15 cm culture dish</td></tr><tr><td>AEBSF Hydrochloride</td><td>ACROS Organics</td><td>A0356829</td><td>AEBSF</td></tr><tr><td>Agarose Beads</td><td>Jena Bioscience&amp;nbsp;</td><td>AC-0015</td><td>Agarose bead control</td></tr><tr><td>Bromophenol Blue</td><td>Fisher</td><td>BP112-25</td><td>Component of SDS-PAGE loading buffer</td></tr><tr><td>1.5 ml Centrifuge Tubes</td><td>FroggaBio</td><td>1210-00S</td><td>Used to centrifuge small volumes</td></tr><tr><td>15 ml Conical Centrifuge Tubes</td><td>Fisher</td><td>1495970C</td><td>Used in culturing primary cells</td></tr><tr><td>Defined trypsin inhibitor</td><td>Fisher</td><td>R007100</td><td>DTI</td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Fisher</td><td>BP172-25</td><td>DTT</td></tr><tr><td>Epithelial cell medium (complete kit)</td><td>ScienCell</td><td>4101</td><td>Includes serum and growth factor supplements)</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Fisher</td><td>BP229-1</td><td>Component of SDS-PAGE loading buffer</td></tr><tr><td>100 mM Guanosine 5&#039;-triphosphate, 1 ml</td><td>Jena Bioscience</td><td>272076-0251M</td><td>GTP</td></tr><tr><td>HCT116 colorectal carcinoma</td><td>ATCC</td><td>CCL-247</td><td>Human cancer cell line</td></tr><tr><td>Human renal proximal tubular epithelial cells</td><td>ATCC</td><td>PCS-400-010</td><td>HRPTEC</td></tr><tr><td>Hyclone DMEM/High Glucose</td><td>GE Life Sciences</td><td>SH30022.01</td><td>Standard media for human cell culture</td></tr><tr><td>Hyclone Penicillin-Streptomycin solution</td><td>GE Life Sciences</td><td>SV30010</td><td>Antibiotic component of DMEM</td></tr><tr><td>H35 HypOxystation</td><td>Hypoxygen</td><td>N/A</td><td>Hypoxia workstation</td></tr><tr><td>Igepal CA-630</td><td>MP Biomedicals</td><td>2198596</td><td>Detergent component of lysis buffer</td></tr><tr><td>Monopotassium phosphate</td><td>Fisher</td><td>P288-500</td><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>Fisher</td><td>P217-500</td><td>KCl</td></tr><tr><td>Magnesium chloride</td><td>Fisher</td><td>M33-500</td><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Fisher</td><td>BP358-10</td><td>NaCl</td></tr><tr><td>Sodium fluoride</td><td>Fisher</td><td>5299-100</td><td>NaF (phosphatase inhibitor component of lysis buffer)</td></tr><tr><td>Disodium phosphate</td><td>Fisher</td><td>5369-500</td><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>Premium Grade Fetal Bovine Serum</td><td>Seradigm</td><td>1500-500</td><td>FBS</td></tr><tr><td>Protease Inhibitor Cocktail (100x)</td><td>Cell Signalling</td><td>58715</td><td>Component of lysis buffer</td></tr><tr><td>Sodium Dodecyl Sulfate</td><td>Fisher</td><td>BP166-100</td><td>SDS</td></tr><tr><td>Sodium Orthovanadate</td><td>Sigma</td><td>56508</td><td>Na&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;VO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Fisher</td><td>BP152-5</td><td>Component of buffers</td></tr><tr><td>0.05% Trypsin-EDTA (1x)</td><td>Life Technologies</td><td>2500-067</td><td>Trypsin used to detach adherent cells</td></tr></tbody></table>

analysis of cap-binding proteins in human cells exposed to physiological oxygen conditions

Translational control is a focal point of gene regulation, especially during periods of cellular stress. Cap-dependent translation via the eIF4F complex is by far the most common pathway to initiate protein synthesis in eukaryotic cells, but stress-specific variations of this complex are now emerging. Purifying cap-binding proteins with an affinity resin composed of Agarose-linked m7GTP (a 5' mRNA cap analog) is a useful tool to identify factors involved in the regulation of translation initiation. Hypoxia (low oxygen) is a cellular stress encountered during fetal development and tumor progression, and is highly dependent on translation regulation. Furthermore, it was recently reported that human adult organs have a lower oxygen content (physioxia 1-9% oxygen) that is closer to hypoxia than the ambient air where cells are routinely cultured. With the ongoing characterization of a hypoxic eIF4F complex (eIF4FH), there is increasing interest in understanding oxygen-dependent translation initiation through the 5' mRNA cap. We have recently developed a human cell culture method to analyze cap-binding proteins that are regulated by oxygen availability. This protocol emphasizes that cell culture and lysis be performed in a hypoxia workstation to eliminate exposure to oxygen. Cells must be incubated for at least 24 hr for the liquid media to equilibrate with the atmosphere within the workstation. To avoid this limitation, pre-conditioned media (de-oxygenated) can be added to cells if shorter time points are required. Certain cap-binding proteins require interactions with a second base or can hydrolyze the m7GTP, therefore some cap interactors may be missed in the purification process. Agarose-linked to enzymatically resistant cap analogs may be substituted in this protocol. This method allows the user to identify novel oxygen-regulated translation factors involved in cap-dependent translation.

Análise da Capacidade Cap-obrigatório em resposta a Oxygen de eIF4E e eIF4E2 em uma m 7 GTP de afinidade de coluna As Figuras 1 e 2 representam Western blot de m 7 GTP purificação por afinidade típica de duas importantes proteínas de ligação do tampão em resposta a flutuações de oxigênio em duas linhas de células humanas: células primárias humanas renais proxi...

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Analysis of Cap-binding Proteins in Human Cells Exposed to Physiological Oxygen Conditions

Here, we present human cell culture protocols to analyze translation initiation factors that bind the 5' cap of mRNA during physiological oxygen conditions. This method utilizes an Agarose-linked m7GTP cap analog and is suitable to investigate cap-binding factors and their interacting partners.

Análise de proteínas Cap-ligação em células humanas expostas a condições de oxigênio fisiológicos

Translational control is a focal point of gene regulation, especially during periods of cellular stress. Cap-dependent translation via the eIF4F complex ...

analysis-cap-binding-proteins-human-cells-exposed-to-physiological

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Genetics

7.7K visualizações.  University of Guelph. Here, we present human cell culture protocols to analyze translation initiation factors that bind the 5' cap of mRNA during physiological oxygen conditions. This method utilizes an Agarose-linked m7GTP cap analog and is suitable to investigate cap-binding factors and their interacting partners.

Vídeo: Analysis of Cap-binding Proteins in Human Cells Exposed to Physiological Oxygen Conditions

Measuring mRNA Levels Over Time During the Yeast S. cerevisiae Hypoxic Response

Complex changes in gene expression typically mediate a large portion of a cellular response. Each gene may change expression with unique kinetics as the gene is regulated by the particular timing of one of many stimuli, signaling pathways or secondary effects. In order to capture the entire gene expression response to hypoxia in the yeast S. cerevisiae, RNA-seq analysis was used to monitor the mRNA levels of all genes at specific times after exposure to hypoxia. Hypoxia was established by growing cells in ~100% N2 gas. Importantly, unlike other hypoxic studies, ergosterol and unsaturated fatty acids were not added to the media because these metabolites affect gene expression. Time points were chosen in the range of 0 - 4 h after hypoxia because that period captures the major changes in gene expression. At each time point, mid-log hypoxic cells were quickly filtered and frozen, limiting exposure to O2 and concomitant changes in gene expression. Total RNA was extracted from cells and used to enrich for mRNA, which was then converted to cDNA. From this cDNA, multiplex libraries were created and eight or more samples were sequenced in one lane of a next-generation sequencer. A post-sequencing pipeline is described, which includes quality base trimming, read mapping and determining the number of reads per gene. DESeq2 within the R statistical environment was used to identify genes that change significantly at any one of the hypoxic time points. Analysis of three biological replicates revealed high reproducibility, genes of differing kinetics and a large number of expected O2-regulated genes. These methods can be used to study how the cells of various organisms respond to hypoxia over time and adapted to study gene expression during other cellular responses.

Measuring mRNA Levels Over Time During the Yeast S. cerevisiae Hypoxic Response

Here, we present a protocol using RNA-seq to monitor mRNA levels over time during the hypoxic response of S. cerevisiae cells. This method can be adapted to analyze gene expression during any cellular response.

Medição de níveis de mRNA ao longo do tempo durante a levedura s. cerevisiae hipóxica resposta

Complex changes in gene expression typically mediate a large portion of a cellular response. Each gene may change expression with unique kinetics as the ...

Genética

Tracking Hypoxic Signaling within Encapsulated Cell Aggregates

In Diabetes mellitus type 1, autoimmune destruction of the pancreatic &beta;-cells results in loss of insulin production and potentially lethal hyperglycemia. As an alternative treatment option to exogenous insulin injection, transplantation of functional pancreatic tissue has been explored1,2. This approach offers the promise of a more natural, long-term restoration of normoglycemia. Protection of the donor tissue from the host's immune system is required to prevent rejection and encapsulation is a method used to help achieve this aim.
Biologically-derived materials, such as alginate3 and agarose4, have been the traditional choice for capsule construction but may induce inflammation or fibrotic overgrowth5 which can impede nutrient and oxygen transport. Alternatively, synthetic poly(ethylene glycol) (PEG)-based hydrogels are non-degrading, easily functionalized, available at high purity, have controllable pore size, and are extremely biocompatible,6,7,8. As an additional benefit, PEG hydrogels may be formed rapidly in a simple photo-crosslinking reaction that does not require application of non-physiological temperatures6,7. Such a procedure is described here. In the crosslinking reaction, UV degradation of the photoinitiator, 1-[4-(2-Hydroxyethoxy)-phenyl]-2-hydroxy-2-methyl-1-propane-1-one (Irgacure 2959), produces free radicals which attack the vinyl carbon-carbon double bonds of dimethacrylated PEG (PEGDM) inducing crosslinking at the chain ends. Crosslinking can be achieved within 10 minutes. PEG hydrogels constructed in such a manner have been shown to favorably support cells7,9, and the low photoinitiator concentration and brief exposure to UV irradiation is not detrimental to viability and function of the encapsulated tissue10. While we methacrylate our PEG with the method described below, PEGDM can also be directly purchased from vendors such as Sigma.
An inherent consequence of encapsulation is isolation of the cells from a vascular network. Supply of nutrients, notably oxygen, is therefore reduced and limited by diffusion. This reduced oxygen availability may especially impact &beta;-cells whose insulin secretory function is highly dependent on oxygen11-13. Capsule composition and geometry will also impact diffusion rates and lengths for oxygen. Therefore, we also describe a technique for identifying hypoxic cells within our PEG capsules. Infection of the cells with a recombinant adenovirus allows for a fluorescent signal to be produced when intracellular hypoxia-inducible factor (HIF) pathways are activated14. As HIFs are the primary regulators of the transcriptional response to hypoxia, they represent an ideal target marker for detection of hypoxic signaling15. This approach allows for easy and rapid detection of hypoxic cells. Briefly, the adenovirus has the sequence for a red fluorescent protein (Ds Red DR from Clontech) under the control of a hypoxia-responsive element (HRE) trimer. Stabilization of HIF-1 by low oxygen conditions will drive transcription of the fluorescent protein (Figure 1). Additional details on the construction of this virus have been published previously15. The virus is stored in 10% glycerol at -80&deg; C as many 150 &mu;L aliquots in 1.5 mL centrifuge tubes at a concentration of 3.4 x 1010 pfu/mL. 
Previous studies in our lab have shown that MIN6 cells encapsulated as aggregates maintain their viability throughout 4 weeks of culture in 20% oxygen. MIN6 aggregates cultured at 2 or 1% oxygen showed both signs of necrotic cells (still about 85-90% viable) by staining with ethidium bromide as well as morphological changes relative to cells in 20% oxygen. The smooth spherical shape of the aggregates displayed at 20% was lost and aggregates appeared more like disorganized groups of cells. While the low oxygen stress does not cause a pronounced drop in viability, it is clearly impacting MIN6 aggregation and function as measured by glucose-stimulated insulin secretion15. Western blot analysis of encapsulated cells in 20% and 1% oxygen also showed a significant increase in HIF-1&alpha; for cells cultured in the low oxygen conditions which correlates with the expression of the DsRed DR protein.

A method for photo-encapsulation of cells in a crosslinked PEG hydrogel is described. Hypoxic signaling within encapsulated murine insulinoma (MIN6) aggregates is tracked using a fluorescent marker system. This system allows serial examination of cells within a hydrogel scaffold and correlation of hypoxic signaling with changes in cell phenotype.

Rastreamento de Sinalização Hipóxico dentro agregados celulares Encapsulated

In Diabetes mellitus type 1, autoimmune destruction of the pancreatic &beta;-cells results in loss of insulin production and potentially lethal ...

Bioengenharia

Proteomic Analysis of Human Macrophage Polarization Under a Low Oxygen Environment

Macrophages are innate immune cells involved in a number of physiological functions ranging from responses to infectious pathogens to tissue homeostasis. The various functions of these cells are related to their activation states, which is also called polarization. The precise molecular description of these various polarizations is a priority in the field of macrophage biology. It is currently acknowledged that a multidimensional approach is necessary to describe how polarization is controlled by environmental signals. In this report, we describe a protocol designed to obtain the proteomic signature of various polarizations in human macrophages. This protocol is based on a label-free quantification of macrophage protein expression obtained from in-gel fractionated and Lys C/trypsin-digested cellular lysis content. We also provide a protocol based on in-solution digestion and isoelectric focusing fractionation to use as an alternative. Because oxygen concentration is a relevant environmental parameter in tissues, we use this protocol to explore how atmospheric composition or a low oxygen environment affects the classification of macrophage polarization.

We present a protocol to obtain proteomic signatures of human macrophages and apply this to determination of the impact of a low oxygen environment on macrophage polarization.

Análise de Proteomic do macrófago humano polarização sob um ambiente de baixo oxigênio

Macrophages are innate immune cells involved in a number of physiological functions ranging from responses to infectious pathogens to tissue homeostasis. ...

Bioquímica

Rastreamento de isótopos estáveis e análise LC-MS para medir as atividades de DHODH e SDH

Oxygen-Independent Assays to Measure Mitochondrial Function in Mammals

The flow of electrons in the mitochondrial electron transport chain (ETC) supports multifaceted biosynthetic, bioenergetic, and signaling functions in mammalian cells. As oxygen (O2) is the most ubiquitous terminal electron acceptor for the mammalian ETC, the O2 consumption rate is frequently used as a proxy for mitochondrial function. However, emerging research demonstrates that this parameter is not always indicative of mitochondrial function, as fumarate can be employed as an alternative electron acceptor to sustain mitochondrial functions in hypoxia. This article compiles a series of protocols that allow researchers to measure mitochondrial function independently of the O2 consumption rate. These assays are particularly useful when studying mitochondrial function in hypoxic environments. Specifically, we describe methods to measure mitochondrial ATP production, de novo pyrimidine biosynthesis, NADH oxidation by complex I, and superoxide production. In combination with classical respirometry experiments, these orthogonal and economical assays will provide researchers with a more comprehensive assessment of mitochondrial function in their system of interest.

Autor em destaque: ensaios independentes de oxigênio para medir a função mitocondrial em mamíferos  

Here, we present a compilation of assays to directly measure mitochondrial function in mammalian cells independently of their ability to consume molecular oxygen.

Ensaios Independentes de Oxigênio para Medir a Função Mitocondrial em Mamíferos

The flow of electrons in the mitochondrial electron transport chain (ETC) supports multifaceted biosynthetic, bioenergetic, and signaling functions in ...

Respirometric Oxidative Phosphorylation Assessment in Saponin-permeabilized Cardiac Fibers

Investigation of mitochondrial function represents an important parameter of cardiac physiology as mitochondria are involved in energy metabolism, oxidative stress, apoptosis, aging, mitochondrial encephalomyopathies and drug toxicity. Given this, technologies to measure cardiac mitochondrial function are in demand. One technique that employs an integrative approach to measure mitochondrial function is respirometric oxidative phosphorylation (OXPHOS) analysis.
The principle of respirometric OXPHOS assessment is centered around measuring oxygen concentration utilizing a Clark electrode. As the permeabilized fiber bundle consumes oxygen, oxygen concentration in the closed chamber declines. Using selected substrate-inhibitor-uncoupler titration protocols, electrons are provided to specific sites of the electron transport chain, allowing evaluation of mitochondrial function. Prior to respirometric analysis of mitochondrial function, mechanical and chemical preparatory techniques are utilized to permeabilize the sarcolemma of muscle fibers. Chemical permeabilization employs saponin to selectively perforate the cell membrane while maintaining cellular architecture.
This paper thoroughly describes the steps involved in preparing saponin-skinned cardiac fibers for oxygen consumption measurements to evaluate mitochondrial OXPHOS. Additionally, troubleshooting advice as well as specific substrates, inhibitors and uncouplers that may be used to determine mitochondria function at specific sites of the electron transport chain are provided. Importantly, the described protocol may be easily applied to cardiac and skeletal tissue of various animal models and human samples.

Saponin-permeabilized fiber preparation in conjunction with respirometric oxidative phosphorylation analysis provides integrative assessment of mitochondrial function. Mitochondrial respiration in physiological and pathological states can reflect various regulatory influences including mitochondrial interactions, morphology and biochemistry.

Avaliação fosforilação oxidativa respirométrico em saponina-fibras cardíacas permeabilizadas

Investigation of mitochondrial function represents an important parameter of cardiac physiology as mitochondria are involved in energy metabolism, ...

Biologia

Intra-cardiac Side-Firing Light Catheter for Monitoring Cellular Metabolism using Transmural Absorbance Spectroscopy of Perfused Mammalian Hearts

Absorbance spectroscopy of cardiac muscle provides non-destructive assessment of cytosolic and mitochondrial oxygenation via myoglobin and cytochrome absorbance respectively. In addition, numerous aspects of the mitochondrial metabolic status such as membrane potential and substrate entry can also be estimated. To perform cardiac wall transmission optical spectroscopy, a commercially available side-firing optical fiber catheter is placed in the left ventricle of the isolated perfused heart as a light source. Light passing through the heart wall is collected with an external optical fiber to perform optical spectroscopy of the heart in near real- time. The transmission approach avoids numerous surface scattering interference occurring in widely used reflection approaches. Changes in transmural absorbance spectra were deconvolved using a library of chromophore reference spectra, providing quantitative measures of all the known cardiac chromophores simultaneously. This spectral deconvolution approach eliminated intrinsic errors that may result from using common dual wavelength methods applied to overlapping absorbance spectra, as well as provided a quantitative evaluation of the goodness of fit. A custom program was designed for data acquisition and analysis, which permitted the investigator to monitor the metabolic state of the preparation during the experiment. These relatively simple additions to the standard heart perfusion system provide a unique insight into the metabolic state of the heart wall in addition to conventional measures of contraction, perfusion, and substrate/oxygen extraction.

Here we introduce a method for using an intra-ventricle optical catheter in perfused hearts to perform absorbance spectroscopy across the heart wall. The data obtained provides robust information on tissue oxygen tension as well as substrate utilization and membrane potential simultaneously with cardiac performance measures in this ubiquitous preparation.

Cateter de luz de queima lateral intra-cardíaco para monitoramento do metabolismo celular usando espectroscopia de absorvência transmural de corações de mamíferos perfused

Absorbance spectroscopy of cardiac muscle provides non-destructive assessment of cytosolic and mitochondrial oxygenation via myoglobin and cytochrome ...

Biochemical Titration of Glycogen In vitro

Glycogen is the main energetic polymer of glucose in vertebrate animals and plays a crucial role in whole body metabolism as well as in cellular metabolism. Many methods to detect glycogen already exist but only a few are quantitative. We describe here a method using the Abcam Glycogen assay kit, which is based on specific degradation of glycogen to glucose by glucoamylase. Glucose is then specifically oxidized to a product that reacts with the OxiRed probe to produce fluorescence. Titration is accurate, sensitive and can be achieved on cell extracts or tissue sections. However, in contrast to other techniques, it does not give information about the distribution of glycogen in the cell. As an example of this technique, we describe here the titration of glycogen in two cell lines, Chinese hamster lung fibroblast CCL39 and human colon carcinoma LS174, incubated in normoxia (21% O2) versus hypoxia (1% O2). We hypothesized that hypoxia is a signal that prepares cells to synthesize and store glycogen in order to survive1.

Biochemical Titration of Glycogen In vitro

We describe here an accurate, reproducible and convenient biochemical method for titration of glycogen in vitro. This technique uses the Abcam Glycogen assay kit and is based on successive hydrolysis of glycogen to glucose and glucose titration by fluorescence.

Titulação Bioquímica de glicogênio<em&gt; In vitro</em

Glycogen is the main energetic polymer of glucose in vertebrate animals and plays a crucial role in whole body metabolism as well as in cellular ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

Análise da Global RNA Síntese no nível da célula única seguinte hipóxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

Análise de proteínas Cap-ligação em células humanas expostas a condições de oxigênio fisiológicos

Resumo

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Medição de níveis de mRNA ao longo do tempo durante a levedura s. cerevisiae hipóxica resposta

Rastreamento de Sinalização Hipóxico dentro agregados celulares Encapsulated

Análise de Proteomic do macrófago humano polarização sob um ambiente de baixo oxigênio

Ensaios Independentes de Oxigênio para Medir a Função Mitocondrial em Mamíferos

Ensaios Independentes de Oxigênio para Medir a Função Mitocondrial em Mamíferos

Ensaios Independentes de Oxigênio para Medir a Função Mitocondrial em Mamíferos

Avaliação fosforilação oxidativa respirométrico em saponina-fibras cardíacas permeabilizadas

Cateter de luz de queima lateral intra-cardíaco para monitoramento do metabolismo celular usando espectroscopia de absorvência transmural de corações de mamíferos perfused

Titulação Bioquímica de glicogênio

Análise da Global RNA Síntese no nível da célula única seguinte hipóxia