Name: analysis of cap-binding proteins in human cells exposed to physiological oxygen conditions
Uploaded: 2016-12-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 40 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Cap-binding Proteins in Human Cells Exposed to Physiological Oxygen Conditions at JoVE.com

This work was supported by the Natural Sciences and Engineering Council of Canada and the Ontario Ministry of Research and Innovation.

1. Preparativos para el cultivo celular <ol><li> Comprar acciones disponibles en el mercado de las células humanas. NOTA: Este protocolo utiliza el carcinoma colorrectal y HCT116 células humanas primarias epiteliales tubulares renales proximales (HRPTEC). </li><li> Hacer 500 ml de medio para el cultivo de HCT116: de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) media / alta de glucosa suplementado con 7,5% de suero bovino fetal (FBS) y 1% de penicilina / estreptomicina (P / S). </li><li> Hacer 500 ml de medio para el cultivo de HRPTEC: medio celular epitelial suplementado con 5% FBS, 1% de suplemento de crecimiento de células epiteliales, y 1% P / S. </li><li> Preparar 500 ml de 1x solución salina tamponada con fosfato (PBS): NaCl 140 mM, KCl 3 mM, 10 mM de Na 2 HPO 4, 15 mM KH 2 PO 4. Ajustar el pH a 7,4 y esterilizar en autoclave durante 40 minutos a 121 ° C. </li></ol> 2. Inicio de cultivo de células <ol><li> aspirar cuidadosamente el medio de un plato confluente 80-90% sin molestar tél células. </li><li> Alícuotas de 3-5 ml de PBS 1x por placa de cultivo, agite con cuidado cada matraz para recubrir la superficie del plato, y con cuidado aspirar el PBS 1x. Repita este procedimiento para un segundo lavado 1x PBS. </li><li> Alícuota 3 ml de ácido etilendiaminotetraacético tripsina 0,05% (EDTA) en cada placa de cultivo y suavemente roca para cubrir uniformemente las células con tripsina-EDTA. Se incuba a 37 ° C durante 2-3 min. </li><li> La transferencia de las células separadas en un tubo de centrífuga de 15 ml y se centrifuga a 4.000 g durante 90 seg. </li><li> Resuspender el sedimento celular en 1 ml de DMEM completo. </li><li> Recuento de células utilizando un hemocitómetro. Calcula cuántos apirógeno y poliestireno de 100 mm de cultivo celular platos se requiere para alcanzar una densidad inicial de siembra de aproximadamente 2.500-5.000 células por cm2. </li><li> Pre-caliente medio de cultivo celular completo realizado en los pasos 1.2 o 1.3 en un baño de agua a 37 ° C durante 30-45 minutos. </li><li> Descontaminar la botella medio y vial de células con 70% de etanol. A partir de este punto en adelante todolas operaciones deben llevarse a cabo de forma aséptica. </li><li> Alícuota de 6 ml de DMEM completo en tantas placas de cultivo celular de 100 mm necesarios para utilizar todo el volumen de las células congeladas dentro de la densidad de siembra mencionado en el paso 2.6. </li><li> Transferir el volumen de suspensión celular calculada en el paso 2.6 para cada una de las placas de 100 mm de cultivo. Roca cada placa manualmente para distribuir uniformemente las células sobre la superficie de la placa. </li><li> Coloque la cabeza de serie placa de cultivo celular 100 mm en la incubadora a 37 ° C en una atmósfera de 5% de CO 2. Permitir que las células se incuban al menos 24 horas antes de que los próximos pasos. </li></ol> 3. El subcultivo <ol><li> Ver cada placa de cultivo de células bajo un microscopio para determinar el porcentaje de confluencia celular (% de células que cubren el área del plato). Volver a las células de la incubadora y medio completo de pre-calentamiento y 1x PBS. Proceder al siguiente paso si las células son 80-100% de confluencia. </li><li> aspirar con cuidado el medio gastado sin perturbar elcélulas en cada placa de cultivo. </li><li> Alícuotas de 3-5 ml de PBS 1x por placa de cultivo, agite con cuidado cada matraz para recubrir la superficie del plato, y con cuidado aspirar el PBS 1x. Repita este procedimiento para un segundo lavado 1x PBS. </li><li> Alícuota de 3 ml de 0,05% tripsina-EDTA en cada placa de cultivo y cuidado de roca para cubrir uniformemente las células con tripsina-EDTA. Se incuba a 37 ° C durante 2-3 min. </li><li> Durante esta incubación, se requiere alícuota de 10 ml de medio completo en placas de cultivo como muchos para obtener la densidad de células de 2.500-5.000 células por cm 2. </li><li> Cuando las células se han separado de la placa, añadir rápidamente 3 ml de inhibidor de tripsina 1x definido y agitar suavemente el plato para 1 min para asegurar que toda la tripsina-EDTA ha sido neutralizado. </li><li> La transferencia de las células separadas en un tubo de centrífuga estéril de 15 ml y dejar de lado. Añadir 3 ml de 1x PBS al plato para recoger las células restantes, y la transferencia de que para el mismo tubo de centrífuga de 15 ml. </li><li> Sedimentar las células por centrifugación 150 xgdurante 5 min. </li><li> Aspirar el sobrenadante y resuspender el sedimento celular en 3 ml de medio completo. </li><li> Recuento de células utilizando un hemocitómetro y sembrar placas de cultivo de 150 mm que contenían 15 ml de medio completo para obtener una densidad celular de 2.500-5.000 células por cm 2. Use dos de 150 mm para cada ensayo de fijación de límites máximos. NOTA: la difusión de oxígeno a las células a través de medios líquidos depende en el volumen 36. Se recomienda mantener el volumen de los medios de comunicación consistentes entre los experimentos si se utilizan células adherentes o células en suspensión. Los medios pueden ser pre-condicionadas (se incubaron en la estación de trabajo durante 24 horas como se comenta en la discusión) para evitar estas variabilidades en la difusión. </li><li> Colocar las cápsulas cabeza de serie de la cultura en la incubadora a 37 ° C en una atmósfera de CO2 al 5%. Permitir que las células se incuban al menos 24 horas antes de proceder a los pasos siguientes. </li></ol> 4. La exposición Physioxic <ol><li> Ver las células bajo el microscopio. para best resultados, aseguran que las células son 70-80% de confluencia para una exposición de 24 horas, el 50-60% de confluencia para una exposición de 48 horas, y el 40-50% de confluencia para una exposición de 72 horas. </li><li> Colocar las células en una estación de trabajo hipoxia durante el tiempo deseado (24, 48, o 72 hr dependiendo del experimento). </li><li> Ajuste la estación de trabajo al physioxia apropiado. NOTA: Por ejemplo, un ajuste de 3% de O2 estaría acompañada de 5% de CO2 y 92% de N2. NOTA: Si se desean las fluctuaciones de oxígeno dentro de un rango dinámico más de una línea de tiempo específico, el programa de la programación en el instrumento o ajustar manualmente los ajustes de oxígeno en los intervalos deseados. </li><li> Ajuste la humedad relativa al 60%. La atmósfera de trabajo es muy secas, no obstante, los medios de comunicación y se evapore notablemente durante los experimentos de largo (&gt; 48 h). Mantenga una reserva de medios de comunicación en un frasco de cultivo de células dentro de la estación de trabajo (de modo que los medios de comunicación se equilibra con la atmósfera estación de trabajo) para reponer los medios de comunicación en la dis cultivo celularél es. NOTA: Cualquier solución que interactuar con las células antes de la lisis (por ejemplo, PBS y tripsina-EDTA) se debe preacondicionarse durante 24 h antes de su uso dentro de la estación de trabajo hipoxia de modo que el oxígeno disuelto se equilibra con el oxígeno atmosférico 36. </li><li> Mantener las células dentro de la estación de trabajo hasta que la lisis. </li></ol> 5. Los tampones se preparan para el análisis del cabo de unión <ol><li> Preparar tamponada con Tris 1x solución salina (TBS). <ol><li> En 800 ml de H2O destilada, se disuelven 8,76 g de NaCl y 6,05 g de Tris Base. </li><li> Se lleva la solución a un pH final de 7,4 usando HCl 1 M. </li><li> Llevar el volumen final a 1 L con dH 2 O. </li></ol></li><li> Preparar tampón de lisis no desnaturalizante. Preparar lisis amortiguar el día del ensayo de unión de topes. Hacer buffer de lisis adicional para lavar las perlas de agarosa en blanco y el γ-amino-fenil-m 7 GTP perlas de agarosa vinculados-C10 (pasos 7.9 y 7.13). <ol><li> En 7 ml de H2O destilada, añadir 160 l de NaCl 5 Ml, NaF mM 160 l 1 M Tris-HCl pH 7,4, 40 l 200, 40 l 1 M MgCl 2, y ortovanadato de sodio 40 l 1 mM. </li><li> Añadir 40 l de Igepal a la solución de 7 ml. Cortar la punta de la pipeta para ayudar a recuperar Igepal ya que es extremadamente viscoso. </li><li> Mezclar pipeteando arriba y abajo, o vórtice, la solución de 7 ml hasta que todo el Igepal se ha disuelto. </li><li> Elevar el volumen final de la solución a 8 ml y mantener en hielo. </li></ol></li><li> Preparar 4x dodecil sulfato de sodio (SDS) -PAGE tampón de muestra. <ol><li> En un vaso de precipitados, se combinan 16 ml 1 M Tris-HCl pH 6,8, 12,64 ml de glicerol, y 8 ml de ditiotreitol (DTT). </li><li> Añadir 3,2 g de SDS y 0,16 g de azul de bromofenol. Permitir que el polvo se disuelva completamente mediante la mezcla con una barra de agitación magnética. </li><li> Alícuota de 1,5 ml tubos de microcentrífuga y se almacena a -20 ° C. </li></ol></li></ol> 6. Lisis Celular <ol><li> Preparar la desnaturalización no tampón de lisis y mantener en hielo el día de THe cap-ensayo de unión. </li><li> 1x PBS pre-calentamiento y tripsina en un baño de agua a 37 ° durante 30 minutos. </li><li> Alícuotas de 980 l de tampón de lisis en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml para cada ensayo de fijación de límites máximos que se realizan. </li><li> Añadir 10 l de 4- (2-aminoetil) bencenosulfonilo fluoruro y 10 l de 100x cóctel inhibidor de proteasa a los 980 l de tampón de lisis. Mantener en hielo. </li><li> Desechar los medios de comunicación de cada plato de 150 mm en un contenedor de residuos dentro de la estación de trabajo de la hipoxia. </li><li> Se lavan las células con 3-4 ml de PBS 1x cálida y desechar todo el líquido. </li><li> Añadir 1 ml de tibia 0,05% de tripsina-EDTA a cada placa y dejar reposar durante 2 minutos o hasta que las células ya no se adhieren a la placa. </li><li> Con una pipeta, transferir las células de una placa a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Repita según sea necesario de manera que cada placa de células se transfirió a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml separado. </li><li> Centrifugar los tubos de microcentrífuga de 1,5 ml a 6.000 xg durante 90 seg to sedimentar las células. </li><li> Aspirar el tripsina usando una pipeta sin perturbar el sedimento. Si el sedimento es perturbado, volver a centrifugar el tubo de microcentrífuga de 1,5 ml a 6000 xg durante 90 seg. </li><li> Se lavan las células con PBS 1x caliente suavemente pipeteando 200 l de PBS en el tubo justo por encima de la pastilla. Re-centrifugadora si se altera el sedimento. </li><li> Aspirar el PBS sin perturbar el sedimento. </li><li> Pipeta 500 l de 1 ml de solución tampón de lisis preparados en el primer precipitado celular. Resuspender el precipitado en su totalidad por pipeteando arriba y abajo. </li><li> Se combinan las células resuspendidas con el segundo sedimento celular y resuspender el segundo precipitado pipeteando arriba y abajo. Repita este proceso hasta que todos los gránulos se han combinado y se resuspendieron para cada muestra. </li><li> Combinar el lisado con los restantes 500 l de tampón de lisis en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. </li><li> Extraer muestras de la estación de trabajo de la hipoxia. NOTA: Después de la adición de tampón de lisis, unaetapas posteriores ll se han de realizar en el aire ambiente como la estación de trabajo hipoxia se establece en 37 ° C y los pasos siguientes se van a realizar en frío (4 ° C o en hielo). </li><li> Lisar las células utilizando agitación suave mediante la rotación de las muestras a 4 ° C durante 1,5-2 horas. </li><li> Centrifugar las células lisadas a 12.000 xg durante 15 min a 4 ° C para eliminar los desechos celulares. </li><li> Transferir el lisado a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y desechar el sedimento. </li><li> Reservar una parte (5 a 10%) del sobrenadante a ser utilizado como todo un control de entrada de lisado de células para el futuro análisis de transferencia Western. </li></ol> 7. Ensayo de unión a Cap- <ol><li> Para cada muestra, la transferencia de 50 l de la suspensión de control de cuentas de agarosa en blanco y 50 l de la suspensión de perlas vinculado-C10 γ-aminofenil-m 7 GTP de agarosa para separar tubos de 1,5 ml de microcentrífuga. Con unas tijeras para retirar la punta de la pipeta para facilitar la recogida de la suspensión de perlas. </li><li> Se precipitan los talones By centrifugación de la suspensión a 500 x g durante 30 seg. </li><li> Eliminar el sobrenadante cuidadosamente y volver a suspender las perlas en 500 l de TBS. </li><li> Repita los pasos 7.2 y 7.3. Sedimentar las perlas a 500 xg durante 30 segundos y retirar el sobrenadante. </li><li> Transferir el sobrenadante que contiene el lisado de la etapa 6.19 al tubo de microcentrífuga de 1,5 ml que contiene las perlas de agarosa en blanco. NOTA: Las perlas de agarosa en blanco actúan como una etapa de pre-compensación para eliminar las proteínas del lisado que interactúan de forma no específica con la perla. </li><li> Incubar durante 10 min a 4 ° C con agitación suave. </li><li> Sedimentar las perlas de agarosa en blanco por centrifugación a 500 xg durante 30 seg. </li><li> Transferir el lisado al tubo de microcentrífuga de 1,5 ml que contiene las γ-amino-fenil-m 7 GTP perlas de agarosa C10-linked. </li><li> Se lavan las perlas de agarosa en blanco resuspendiendo las perlas en 500 l de tampón de lisis, la granulación las perlas por centrifugación a 500 xg durante 30 seg, y descartar el supernatante. Repita esto cuatro veces para un total de cinco lavados. </li><li> Volver a suspender las perlas de agarosa en blanco en tampón de muestra 1x SDS-PAGE, y hervir los granos por 90 segundos a 95 ° C. Almacenar a -20 ° C para el futuro análisis de Western blot para observar si la proteína de interés se une de forma no específica a la perla. </li><li> Incubar el lisado con las perlas de enlaces-C10 γ-aminofenil-m 7 GTP de agarosa con agitación suave durante 1 hora a 4 ° C para capturar proteínas de unión a la tapa. </li><li> Sedimentar las γ-aminofenil-m 7 GTP perlas de agarosa C10 ligado por centrifugación a 500 xg durante 30 seg. Descartar el sobrenadante. </li><li> Lavar las γ-aminofenil-m 7 GTP perlas de agarosa C10 ligado repitiendo el paso 7.9. </li><li> Volver a suspender las perlas en 600 l de tampón de lisis. </li><li> Añadir GTP a una concentración final de 1 mM. </li><li> Se incuban las γ-amino-fenil-m 7 GTP perlas de agarosa C10 ligado + 1 mM de GTP con agitación suave durante 1 hora a 4 ° C. Nota: Estese disociar las proteínas que interactúan de forma no específica con m 7 GTP (es decir, también interactuar con GTP no metilado). </li><li> Sedimentar las γ-aminofenil-m 7 GTP perlas de agarosa C10 ligado por centrifugación a 500 xg durante 30 seg. </li><li> Transferir el sobrenadante a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y añadir 200 l de tampón de muestra 4x SDS-PAGE (50 mM Tris-HCl, 100 mM de DTT, 2% SDS, 0,1% de azul de bromofenol, y 10% de glicerol). Almacenar la muestra de control de GTP a -20 ° C para el futuro análisis de Western blot 37. Lavar las perlas repitiendo el paso 7.9. </li><li> Resuspender las perlas en tampón 1x de muestra de SDS-PAGE (50 mM Tris-HCl, 100 mM de DTT, 2% SDS, 0,1% de azul de bromofenol, y 10% de glicerol), y hierven a 95 ° C durante 90 seg. Almacenar la fracción m 7 GTP a -20 ° C para el futuro análisis de Western blot 37. </li></ol>

<ol>
	<li>Holcik, M., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+control+in+stress+and+apoptosis.">Translational control in stress and apoptosis.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (4), 318-327 (2005).</li><li>Sonenberg, N., Hinnebusch, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+translation+initiation+in+eukaryotes:+mechanisms+and+biological+targets.">Regulation of translation initiation in eukaryotes: mechanisms and biological targets.</a> Cell. 136 (4), 731-745 (2009).</li><li>Gingras, A. C., Raught, B., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=eIF4+initiation+factors:+effectors+of+mRNA+recruitment+to+ribosomes+and+regulators+of+translation.">eIF4 initiation factors: effectors of mRNA recruitment to ribosomes and regulators of translation.</a> Annu Rev Biochem. 68, 913-963 (1999).</li><li>Weingarten-Gabbay, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+genetics.+Systematic+discovery+of+cap-independent+translation+sequences+in+human+and+viral+genomes.">Comparative genetics. Systematic discovery of cap-independent translation sequences in human and viral genomes.</a> Science. 351 (6270), (2016).</li><li>Andreev, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+and+glucose+deprivation+induces+widespread+alterations+in+mRNA+translation+within+20+minutes.">Oxygen and glucose deprivation induces widespread alterations in mRNA translation within 20 minutes.</a> Genome Biol. 16, 90 (2015).</li><li>Ho, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+Reprogramming+of+Translation+Efficiencies+on+Oxygen+Stimulus.">Systemic Reprogramming of Translation Efficiencies on Oxygen Stimulus.</a> Cell Rep. 14 (6), 1293-1300 (2016).</li><li>Shatsky, I. N., Dmitriev, S. E., Andreev, D. E., Terenin, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome-wide+studies+uncover+the+diversity+of+modes+of+mRNA+recruitment+to+eukaryotic+ribosomes.">Transcriptome-wide studies uncover the diversity of modes of mRNA recruitment to eukaryotic ribosomes.</a> Crit Rev Biochem Mol Biol. 49 (2), 164-177 (2014).</li><li>Ho, J. J., Lee, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Cap+for+Every+Occasion:+Alternative+eIF4F+Complexes.">A Cap for Every Occasion: Alternative eIF4F Complexes.</a> Trends Biochem Sci. , (2016).</li><li>Lin, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PHAS-I+as+a+link+between+mitogen-activated+protein+kinase+and+translation+initiation.">PHAS-I as a link between mitogen-activated protein kinase and translation initiation.</a> Science. 266 (5185), 653-656 (1994).</li><li>Richter, J. D., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+cap-dependent+translation+by+eIF4E+inhibitory+proteins.">Regulation of cap-dependent translation by eIF4E inhibitory proteins.</a> Nature. 433 (7025), 477-480 (2005).</li><li>Tee, A. R., Tee, J. A., Blenis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+the+interaction+of+the+mammalian+eIF4E-related+protein+4EHP+with+4E-BP1.">Characterizing the interaction of the mammalian eIF4E-related protein 4EHP with 4E-BP1.</a> FEBS Lett. 564 (1-2), 58-62 (2004).</li><li>Rom, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+characterization+of+4EHP,+a+novel+mammalian+eIF4E-related+cap-binding+protein.">Cloning and characterization of 4EHP, a novel mammalian eIF4E-related cap-binding protein.</a> J Biol Chem. 273 (21), 13104-13109 (1998).</li><li>Uniacke, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+oxygen-regulated+switch+in+the+protein+synthesis+machinery.">An oxygen-regulated switch in the protein synthesis machinery.</a> Nature. 486 (7401), 126-129 (2012).</li><li>Morita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+4EHP-GIGYF2+translational+repressor+complex+is+essential+for+mammalian+development.">A novel 4EHP-GIGYF2 translational repressor complex is essential for mammalian development.</a> Mol Cell Biol. 32 (17), 3585-3593 (2012).</li><li>Webb, N. R., Chari, R. V., DePillis, G., Kozarich, J. W., Rhoads, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+the+messenger+RNA+cap-binding+protein+using+a+new+affinity+medium.">Purification of the messenger RNA cap-binding protein using a new affinity medium.</a> Biochemistry. 23 (2), 177-181 (1984).</li><li>Kiriakidou, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+mRNA+m7G+cap+binding-like+motif+within+human+Ago2+represses+translation.">An mRNA m7G cap binding-like motif within human Ago2 represses translation.</a> Cell. 129 (6), 1141-1151 (2007).</li><li>Mazza, C., Segref, A., Mattaj, I. W., Cusack, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+induced+fit+recognition+of+an+m(7)GpppG+cap+analogue+by+the+human+nuclear+cap-binding+complex.">Large-scale induced fit recognition of an m(7)GpppG cap analogue by the human nuclear cap-binding complex.</a> EMBO J. 21 (20), 5548-5557 (2002).</li><li>Nojima, T., Hirose, T., Kimura, H., Hagiwara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interaction+between+cap-binding+complex+and+RNA+export+factor+is+required+for+intronless+mRNA+export.">The interaction between cap-binding complex and RNA export factor is required for intronless mRNA export.</a> J Biol Chem. 282 (21), 15645-15651 (2007).</li><li>Pabis, M., Neufeld, N., Shav-Tal, Y., Neugebauer, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+properties+and+dynamic+localization+of+an+alternative+isoform+of+the+cap-binding+complex+subunit+CBP20.">Binding properties and dynamic localization of an alternative isoform of the cap-binding complex subunit CBP20.</a> Nucleus. 1 (5), 412-421 (2010).</li><li>Ruud, K. A., Kuhlow, C., Goss, D. J., Browning, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+a+novel+cap-binding+protein+from+Arabidopsis+thaliana.">Identification and characterization of a novel cap-binding protein from Arabidopsis thaliana.</a> J Biol Chem. 273 (17), 10325-10330 (1998).</li><li>Ptushkina, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+second+eIF4E+protein+in+Schizosaccharomyces+pombe+has+distinct+eIF4G-binding+properties.">A second eIF4E protein in Schizosaccharomyces pombe has distinct eIF4G-binding properties.</a> Nucleic Acids Res. 29 (22), 4561-4569 (2001).</li><li>Cho, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+paradigm+for+translational+control:+inhibition+via+5'-3'+mRNA+tethering+by+Bicoid+and+the+eIF4E+cognate+4EHP.">A new paradigm for translational control: inhibition via 5'-3' mRNA tethering by Bicoid and the eIF4E cognate 4EHP.</a> Cell. 121 (3), 411-423 (2005).</li><li>Dinkova, T. D., Keiper, B. D., Korneeva, N. L., Aamodt, E. J., Rhoads, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translation+of+a+small+subset+of+Caenorhabditis+elegans+mRNAs+is+dependent+on+a+specific+eukaryotic+translation+initiation+factor+4E+isoform.">Translation of a small subset of Caenorhabditis elegans mRNAs is dependent on a specific eukaryotic translation initiation factor 4E isoform.</a> Mol Cell Biol. 25 (1), 100-113 (2005).</li><li>Timpano, S., Uniacke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Cells+Cultured+Under+Physiological+Oxygen+Utilize+Two+Cap-binding+Proteins+to+Recruit+Distinct+mRNAs+for+Translation.">Human Cells Cultured Under Physiological Oxygen Utilize Two Cap-binding Proteins to Recruit Distinct mRNAs for Translation.</a> J Biol Chem. , (2016).</li><li>Dings, J., Meixensberger, J., Jager, A., Roosen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+experience+with+118+brain+tissue+oxygen+partial+pressure+catheter+probes.">Clinical experience with 118 brain tissue oxygen partial pressure catheter probes.</a> Neurosurgery. 43 (5), 1082-1095 (1998).</li><li>Le, Q. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+evaluation+of+tumor+oxygenation+and+gene+expression+in+patients+with+early+stage+non-small+cell+lung+cancers.">An evaluation of tumor oxygenation and gene expression in patients with early stage non-small cell lung cancers.</a> Clin Cancer Res. 12 (5), 1507-1514 (2006).</li><li>Muller, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+desflurane+and+isoflurane+on+intestinal+tissue+oxygen+pressure+during+colorectal+surgery.">Effects of desflurane and isoflurane on intestinal tissue oxygen pressure during colorectal surgery.</a> Anaesthesia. 57 (2), 110-115 (2002).</li><li>Brooks, A. J., Eastwood, J., Beckingham, I. J., Girling, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+tissue+partial+pressure+of+oxygen+and+carbon+dioxide+during+partial+hepatectomy.">Liver tissue partial pressure of oxygen and carbon dioxide during partial hepatectomy.</a> Br J Anaesth. 92 (5), 735-737 (2004).</li><li>Muller, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Renocortical+tissue+oxygen+pressure+measurements+in+patients+undergoing+living+donor+kidney+transplantation.">Renocortical tissue oxygen pressure measurements in patients undergoing living donor kidney transplantation.</a> Anesth Analg. 87 (2), 474-476 (1998).</li><li>Richardson, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+skeletal+muscle+intracellular+oxygenation:+the+impact+of+ambient+oxygen+availability.">Human skeletal muscle intracellular oxygenation: the impact of ambient oxygen availability.</a> J Physiol. 571 (Pt 2), 415-424 (2006).</li><li>Harrison, J. S., Rameshwar, P., Chang, V., Bandari, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+saturation+in+the+bone+marrow+of+healthy+volunteers.">Oxygen saturation in the bone marrow of healthy volunteers.</a> Blood. 99 (1), 394 (2002).</li><li>Gleadle, J., Ratcliffe, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Hypoxia. , (2001).</li><li>Gluckman, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+reconstitution+in+a+patient+with+Fanconi's+anemia+by+means+of+umbilical-cord+blood+from+an+HLA-identical+sibling.">Hematopoietic reconstitution in a patient with Fanconi's anemia by means of umbilical-cord blood from an HLA-identical sibling.</a> N Engl J Med. 321 (17), 1174-1178 (1989).</li><li>Parrinello, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+sensitivity+severely+limits+the+replicative+lifespan+of+murine+fibroblasts.">Oxygen sensitivity severely limits the replicative lifespan of murine fibroblasts.</a> Nat Cell Biol. 5 (8), 741-747 (2003).</li><li>Jewell, U. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+HIF-1alpha+in+response+to+hypoxia+is+instantaneous.">Induction of HIF-1alpha in response to hypoxia is instantaneous.</a> FASEB J. 15 (7), 1312-1314 (2001).</li><li>Newby, D., Marks, L., Lyall, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissolved+oxygen+concentration+in+culture+medium:+assumptions+and+pitfalls.">Dissolved oxygen concentration in culture medium: assumptions and pitfalls.</a> Placenta. 26 (4), 353-357 (2005).</li><li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets:+procedure+and+some+applications.">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (9), 4350-4354 (1979).</li><li>Haghighat, A., Mader, S., Pause, A., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repression+of+cap-dependent+translation+by+4E-binding+protein+1:+competition+with+p220+for+binding+to+eukaryotic+initiation+factor-4E.">Repression of cap-dependent translation by 4E-binding protein 1: competition with p220 for binding to eukaryotic initiation factor-4E.</a> EMBO J. 14 (22), 5701-5709 (1995).</li><li>Pyronnet, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+eukaryotic+translation+initiation+factor+4G+(eIF4G)+recruits+mnk1+to+phosphorylate+eIF4E.">Human eukaryotic translation initiation factor 4G (eIF4G) recruits mnk1 to phosphorylate eIF4E.</a> EMBO J. 18 (1), 270-279 (1999).</li><li>Okumura, F., Zou, W., Zhang, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ISG15+modification+of+the+eIF4E+cognate+4EHP+enhances+cap+structure-binding+activity+of+4EHP.">ISG15 modification of the eIF4E cognate 4EHP enhances cap structure-binding activity of 4EHP.</a> Genes Dev. 21 (3), 255-260 (2007).</li><li>Kedersha, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+that+ternary+complex+(eIF2-GTP-tRNA(i)(Met))-deficient+preinitiation+complexes+are+core+constituents+of+mammalian+stress+granules.">Evidence that ternary complex (eIF2-GTP-tRNA(i)(Met))-deficient preinitiation complexes are core constituents of mammalian stress granules.</a> Mol Biol Cell. 13 (1), 195-210 (2002).</li><li>Gu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+the+structure,+mechanism,+and+regulation+of+scavenger+mRNA+decapping+activity.">Insights into the structure, mechanism, and regulation of scavenger mRNA decapping activity.</a> Mol Cell. 14 (1), 67-80 (2004).</li><li>Szczepaniak, S. A., Zuberek, J., Darzynkiewicz, E., Kufel, J., Jemielity, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affinity+resins+containing+enzymatically+resistant+mRNA+cap+analogs--a+new+tool+for+the+analysis+of+cap-binding+proteins.">Affinity resins containing enzymatically resistant mRNA cap analogs--a new tool for the analysis of cap-binding proteins.</a> RNA. 18 (7), 1421-1432 (2012).</li><li>Joshi, B., Cameron, A., Jagus, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+mammalian+eIF4E-family+members.">Characterization of mammalian eIF4E-family members.</a> Eur J Biochem. 271 (11), 2189-2203 (2004).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

El análisis de proteínas de unión a la tapa-en células humanas expuestas a condiciones de oxígeno fisiológicas pueden permitir la identificación de nuevos factores de iniciación de traducción regulada de oxígeno. La afinidad de estos factores para la tapa 5 &#39;del mRNA u otras proteínas de tapa asociada se puede medir por la fuerza de su asociación a la m 7 GTP ligada perlas de agarosa. Una advertencia de esta técnica es que mide el potencial de unión de topes de proteínas post-lisis, pero se...

Control de la traducción está emergiendo como un paso igualmente importante para la regulación transcripcional de la expresión génica, especialmente durante los períodos de estrés celular 1. Un punto central de control de la traducción está en la etapa limitante de la velocidad de iniciación, donde los primeros pasos de la síntesis de proteínas implican la unión del factor de iniciación eucariota 4E (eIF4E) a la 7-metilguanosina (m 7 GTP) 5 &#39;cap de mRNAs 2 . eIF4E es parte de un complejo trimérico llamado eIF4F que incluye eIF4A, una helicasa de ARN, y eIF4G, una proteína de andamiaje necesario para la contratación de otros factores de traducción y los ribosomas 40S 3. En condiciones fisiológicas normales, la gran mayoría de los ARNm se traducen a través de un mecanismo dependiente de la cubierta, pero en períodos de estrés celular aproximadamente el 10% de los ARNm humanos contiene 5 &#39;UTRs que podrían permitir la traducción independiente de caperuza intiation 1,4. traducción dependiente de la cubierta ha sido históricamente sinónimoous con eIF4F, sin embargo, las variaciones de tensión específica de eIF4F se han convertido en un tema de tendencia 5-8. Diversos estreses celulares causan actividad de eIF4E a ser reprimida a través del objetivo de mamíferos de la rapamicina complejo 1 (mTORC1). Esta quinasa se deteriora bajo tensión, lo que resulta en el aumento de la actividad de uno de sus objetivos, la proteína de unión a 4E (4E-BP). No fosforilada 4E-BP se une a eIF4E y bloquea su capacidad para interactuar con eIF4G haciendo que la represión de la traducción dependiente de cap-9,10. Curiosamente, un homólogo de eIF4E llamado eIF4E2 (o 4EHP) tiene una afinidad mucho menor para 4E-BP 11, tal vez lo que le permite evadir la represión mediada por el estrés. De hecho, caracterizada inicialmente como un represor de la traducción debido a su falta de interacción con eIF4G 12, eIF4E2 inicia la traducción de centenares de ARNm que contienen elementos de respuesta a la hipoxia de ARN en su 3 &#39;UTR durante el estrés hipóxico 6,13. Esta i activacións logrado a través de interacciones con proteínas motivo 4, y el factor inducible por hipoxia (HIF) 2α eIF4G3, ARN de unión para constituir un complejo eIF4F hipóxica, o eIF4F H 6,13. Como un represor en condiciones normales, eIF4E2 une con GIGYF2 y ZNF598 14. Estos complejos fueron, en parte, identificados a través de 7 m resinas de afinidad GTP vinculados-agarosa. Este método clásico 15 es estándar en el campo de la traducción y los ensayos es mejor y más comúnmente utilizado la técnica para aislar los complejos de unión de capuchón en la tracción y la unión in vitro 16-19. A medida que la maquinaria de traducción dependiente de la cubierta está emergiendo como flexible y adaptable con las piezas de cambio inter 6-8,13, este método es una herramienta poderosa para identificar rápidamente nuevas proteínas de unión con forma de capuchones que intervienen en la respuesta al estrés. Por otra parte, las variaciones en eIF4F podría tener amplias implicaciones como varios sistemas modelo eucariotas parecen usar un homólogo de eIF4E2 de las respuestas de estrés talescomo A. thaliana 20, S. pombe 21, 22 D. melanogaster y C. elegans 23. La evidencia sugiere que las variaciones en eIF4F no pueden limitarse estrictamente a condiciones de estrés, pero estar implicados en la fisiología normal 24. El suministro de oxígeno a los tejidos en los extremos (capilares) o dentro de los tejidos (medido a través de microelectrodos) varía desde 2 hasta 6% en el cerebro 25, 3-12% en los pulmones 26, 3,5 a 6% en el intestino 27, 4% en el hígado 28, 7-12% en el riñón 29, 4% en el músculo 30, y 6-7% en la médula ósea 31. Las células y las mitocondrias contienen menos de 1,3% de oxígeno 32. Estos valores son mucho más cerca de la hipoxia que el aire ambiente donde las células son cultivadas de forma rutinaria. Esto sugiere que lo que se pensaba anteriormente de procesos celulares como la hipoxia-específicos pueden ser relevantes en un entorno fisiológico. Curiosamente, eIF4F y eIF4F H </sup&gt; participar activamente en la iniciación de la traducción de piscinas o clases de ARNm distintos en varios diferentes líneas celulares humanas expuestas al oxígeno fisiológica o &quot;physioxia&quot; 24. Bajos niveles de oxígeno también impulsa el correcto desarrollo fetal y 33 células por lo general tienen mayores tasas de proliferación, mayor esperanza de vida, menos daño en el ADN y las respuestas al estrés en general menos de 34 physioxia. Por lo tanto, eIF4F H es probablemente un factor clave en la expresión de genes de selección en condiciones fisiológicas. A continuación, ofrecemos un protocolo para cultivar células en condiciones fijas de oxígeno fisiológicas o en un rango de fluctuación dinámica que es probable que sea más representativo de los microambientes de tejido. Una ventaja de este método es que las células se lisan dentro de la estación de trabajo de la hipoxia. No es a menudo claro cómo se lleva a cabo la transición del cultivo de células hipóxicas a la lisis celular en otros protocolos. Las células se quitan a menudo por primera vez de una pequeña incubadora hipoxia serlisis de proa, pero esta exposición al oxígeno podría afectar a las vías bioquímicas como la respuesta celular al oxígeno es rápida (una o dos min) 35. Ciertas proteínas de unión con forma de capuchones requieren la interacción con una segunda base o pueden hidrolizar el GTP m 7, por lo tanto, algunos interactores cap pueden pasarse por alto en el proceso de purificación. Agarosa ligada a los análogos de tapa enzimáticamente resistentes puede sustituirse en este protocolo. La exploración de la actividad y la composición de eIF4F H y otras variaciones de eIF4F a través del método descrito aquí arrojará luz sobre los genes de expresión intrincados mecanismos que utilizan las células en condiciones fisiológicas o las respuestas al estrés.

<table><tbody><tr><td>&amp;gamma;-aminophenyl-m&lt;sup&gt;7&lt;/sup&gt;GTP agarose C&lt;sub&gt;10&lt;/sub&gt;-linked beads</td><td>Jena Bioscience</td><td>AC-1555</td><td>Agarose-linked m&lt;sup&gt;7&lt;/sup&gt;GTP</td></tr><tr><td>100 mm culture dish</td><td>Corning</td><td>877222</td><td>10-cm culture dish</td></tr><tr><td>150 mm culture dish</td><td>Thermofisher</td><td>130183</td><td>15 cm culture dish</td></tr><tr><td>AEBSF Hydrochloride</td><td>ACROS Organics</td><td>A0356829</td><td>AEBSF</td></tr><tr><td>Agarose Beads</td><td>Jena Bioscience&amp;nbsp;</td><td>AC-0015</td><td>Agarose bead control</td></tr><tr><td>Bromophenol Blue</td><td>Fisher</td><td>BP112-25</td><td>Component of SDS-PAGE loading buffer</td></tr><tr><td>1.5 ml Centrifuge Tubes</td><td>FroggaBio</td><td>1210-00S</td><td>Used to centrifuge small volumes</td></tr><tr><td>15 ml Conical Centrifuge Tubes</td><td>Fisher</td><td>1495970C</td><td>Used in culturing primary cells</td></tr><tr><td>Defined trypsin inhibitor</td><td>Fisher</td><td>R007100</td><td>DTI</td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Fisher</td><td>BP172-25</td><td>DTT</td></tr><tr><td>Epithelial cell medium (complete kit)</td><td>ScienCell</td><td>4101</td><td>Includes serum and growth factor supplements)</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Fisher</td><td>BP229-1</td><td>Component of SDS-PAGE loading buffer</td></tr><tr><td>100 mM Guanosine 5&#039;-triphosphate, 1 ml</td><td>Jena Bioscience</td><td>272076-0251M</td><td>GTP</td></tr><tr><td>HCT116 colorectal carcinoma</td><td>ATCC</td><td>CCL-247</td><td>Human cancer cell line</td></tr><tr><td>Human renal proximal tubular epithelial cells</td><td>ATCC</td><td>PCS-400-010</td><td>HRPTEC</td></tr><tr><td>Hyclone DMEM/High Glucose</td><td>GE Life Sciences</td><td>SH30022.01</td><td>Standard media for human cell culture</td></tr><tr><td>Hyclone Penicillin-Streptomycin solution</td><td>GE Life Sciences</td><td>SV30010</td><td>Antibiotic component of DMEM</td></tr><tr><td>H35 HypOxystation</td><td>Hypoxygen</td><td>N/A</td><td>Hypoxia workstation</td></tr><tr><td>Igepal CA-630</td><td>MP Biomedicals</td><td>2198596</td><td>Detergent component of lysis buffer</td></tr><tr><td>Monopotassium phosphate</td><td>Fisher</td><td>P288-500</td><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>Fisher</td><td>P217-500</td><td>KCl</td></tr><tr><td>Magnesium chloride</td><td>Fisher</td><td>M33-500</td><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Fisher</td><td>BP358-10</td><td>NaCl</td></tr><tr><td>Sodium fluoride</td><td>Fisher</td><td>5299-100</td><td>NaF (phosphatase inhibitor component of lysis buffer)</td></tr><tr><td>Disodium phosphate</td><td>Fisher</td><td>5369-500</td><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>Premium Grade Fetal Bovine Serum</td><td>Seradigm</td><td>1500-500</td><td>FBS</td></tr><tr><td>Protease Inhibitor Cocktail (100x)</td><td>Cell Signalling</td><td>58715</td><td>Component of lysis buffer</td></tr><tr><td>Sodium Dodecyl Sulfate</td><td>Fisher</td><td>BP166-100</td><td>SDS</td></tr><tr><td>Sodium Orthovanadate</td><td>Sigma</td><td>56508</td><td>Na&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;VO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Fisher</td><td>BP152-5</td><td>Component of buffers</td></tr><tr><td>0.05% Trypsin-EDTA (1x)</td><td>Life Technologies</td><td>2500-067</td><td>Trypsin used to detach adherent cells</td></tr></tbody></table>

analysis of cap-binding proteins in human cells exposed to physiological oxygen conditions

Translational control is a focal point of gene regulation, especially during periods of cellular stress. Cap-dependent translation via the eIF4F complex is by far the most common pathway to initiate protein synthesis in eukaryotic cells, but stress-specific variations of this complex are now emerging. Purifying cap-binding proteins with an affinity resin composed of Agarose-linked m7GTP (a 5' mRNA cap analog) is a useful tool to identify factors involved in the regulation of translation initiation. Hypoxia (low oxygen) is a cellular stress encountered during fetal development and tumor progression, and is highly dependent on translation regulation. Furthermore, it was recently reported that human adult organs have a lower oxygen content (physioxia 1-9% oxygen) that is closer to hypoxia than the ambient air where cells are routinely cultured. With the ongoing characterization of a hypoxic eIF4F complex (eIF4FH), there is increasing interest in understanding oxygen-dependent translation initiation through the 5' mRNA cap. We have recently developed a human cell culture method to analyze cap-binding proteins that are regulated by oxygen availability. This protocol emphasizes that cell culture and lysis be performed in a hypoxia workstation to eliminate exposure to oxygen. Cells must be incubated for at least 24 hr for the liquid media to equilibrate with the atmosphere within the workstation. To avoid this limitation, pre-conditioned media (de-oxygenated) can be added to cells if shorter time points are required. Certain cap-binding proteins require interactions with a second base or can hydrolyze the m7GTP, therefore some cap interactors may be missed in the purification process. Agarose-linked to enzymatically resistant cap analogs may be substituted in this protocol. This method allows the user to identify novel oxygen-regulated translation factors involved in cap-dependent translation.

Análisis de Capacidad del casquillo de unión en respuesta al oxígeno de eIF4E y eIF4E2 en un m 7 GTP columna de afinidad Las figuras 1 y 2 representan transferencias Western de m 7 GTP afinidad purificación típica de las dos principales proteínas de unión del casquillo en respuesta a las fluctuaciones de oxígeno en dos líneas celulares humanas: células primarias hu...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Cap-binding Proteins in Human Cells Exposed to Physiological Oxygen Conditions at JoVE.com

Analysis of Cap-binding Proteins in Human Cells Exposed to Physiological Oxygen Conditions

Here, we present human cell culture protocols to analyze translation initiation factors that bind the 5' cap of mRNA during physiological oxygen conditions. This method utilizes an Agarose-linked m7GTP cap analog and is suitable to investigate cap-binding factors and their interacting partners.

Análisis de proteínas Cap-unión en células humanas expuestas a condiciones de oxígeno fisiológicas

Translational control is a focal point of gene regulation, especially during periods of cellular stress. Cap-dependent translation via the eIF4F complex ...

analysis-cap-binding-proteins-human-cells-exposed-to-physiological

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Genetics

7.7K vistas.  University of Guelph. Here, we present human cell culture protocols to analyze translation initiation factors that bind the 5' cap of mRNA during physiological oxygen conditions. This method utilizes an Agarose-linked m7GTP cap analog and is suitable to investigate cap-binding factors and their interacting partners.

Video: Analysis of Cap-binding Proteins in Human Cells Exposed to Physiological Oxygen Conditions

Measuring mRNA Levels Over Time During the Yeast S. cerevisiae Hypoxic Response

Complex changes in gene expression typically mediate a large portion of a cellular response. Each gene may change expression with unique kinetics as the gene is regulated by the particular timing of one of many stimuli, signaling pathways or secondary effects. In order to capture the entire gene expression response to hypoxia in the yeast S. cerevisiae, RNA-seq analysis was used to monitor the mRNA levels of all genes at specific times after exposure to hypoxia. Hypoxia was established by growing cells in ~100% N2 gas. Importantly, unlike other hypoxic studies, ergosterol and unsaturated fatty acids were not added to the media because these metabolites affect gene expression. Time points were chosen in the range of 0 - 4 h after hypoxia because that period captures the major changes in gene expression. At each time point, mid-log hypoxic cells were quickly filtered and frozen, limiting exposure to O2 and concomitant changes in gene expression. Total RNA was extracted from cells and used to enrich for mRNA, which was then converted to cDNA. From this cDNA, multiplex libraries were created and eight or more samples were sequenced in one lane of a next-generation sequencer. A post-sequencing pipeline is described, which includes quality base trimming, read mapping and determining the number of reads per gene. DESeq2 within the R statistical environment was used to identify genes that change significantly at any one of the hypoxic time points. Analysis of three biological replicates revealed high reproducibility, genes of differing kinetics and a large number of expected O2-regulated genes. These methods can be used to study how the cells of various organisms respond to hypoxia over time and adapted to study gene expression during other cellular responses.

Measuring mRNA Levels Over Time During the Yeast S. cerevisiae Hypoxic Response

Here, we present a protocol using RNA-seq to monitor mRNA levels over time during the hypoxic response of S. cerevisiae cells. This method can be adapted to analyze gene expression during any cellular response.

Medición de los niveles de mRNA con el tiempo durante la levadura S. cerevisiae por respuesta hipóxica

Complex changes in gene expression typically mediate a large portion of a cellular response. Each gene may change expression with unique kinetics as the ...

Investigación

Genética

Tracking Hypoxic Signaling within Encapsulated Cell Aggregates

In Diabetes mellitus type 1, autoimmune destruction of the pancreatic &beta;-cells results in loss of insulin production and potentially lethal hyperglycemia. As an alternative treatment option to exogenous insulin injection, transplantation of functional pancreatic tissue has been explored1,2. This approach offers the promise of a more natural, long-term restoration of normoglycemia. Protection of the donor tissue from the host's immune system is required to prevent rejection and encapsulation is a method used to help achieve this aim.
Biologically-derived materials, such as alginate3 and agarose4, have been the traditional choice for capsule construction but may induce inflammation or fibrotic overgrowth5 which can impede nutrient and oxygen transport. Alternatively, synthetic poly(ethylene glycol) (PEG)-based hydrogels are non-degrading, easily functionalized, available at high purity, have controllable pore size, and are extremely biocompatible,6,7,8. As an additional benefit, PEG hydrogels may be formed rapidly in a simple photo-crosslinking reaction that does not require application of non-physiological temperatures6,7. Such a procedure is described here. In the crosslinking reaction, UV degradation of the photoinitiator, 1-[4-(2-Hydroxyethoxy)-phenyl]-2-hydroxy-2-methyl-1-propane-1-one (Irgacure 2959), produces free radicals which attack the vinyl carbon-carbon double bonds of dimethacrylated PEG (PEGDM) inducing crosslinking at the chain ends. Crosslinking can be achieved within 10 minutes. PEG hydrogels constructed in such a manner have been shown to favorably support cells7,9, and the low photoinitiator concentration and brief exposure to UV irradiation is not detrimental to viability and function of the encapsulated tissue10. While we methacrylate our PEG with the method described below, PEGDM can also be directly purchased from vendors such as Sigma.
An inherent consequence of encapsulation is isolation of the cells from a vascular network. Supply of nutrients, notably oxygen, is therefore reduced and limited by diffusion. This reduced oxygen availability may especially impact &beta;-cells whose insulin secretory function is highly dependent on oxygen11-13. Capsule composition and geometry will also impact diffusion rates and lengths for oxygen. Therefore, we also describe a technique for identifying hypoxic cells within our PEG capsules. Infection of the cells with a recombinant adenovirus allows for a fluorescent signal to be produced when intracellular hypoxia-inducible factor (HIF) pathways are activated14. As HIFs are the primary regulators of the transcriptional response to hypoxia, they represent an ideal target marker for detection of hypoxic signaling15. This approach allows for easy and rapid detection of hypoxic cells. Briefly, the adenovirus has the sequence for a red fluorescent protein (Ds Red DR from Clontech) under the control of a hypoxia-responsive element (HRE) trimer. Stabilization of HIF-1 by low oxygen conditions will drive transcription of the fluorescent protein (Figure 1). Additional details on the construction of this virus have been published previously15. The virus is stored in 10% glycerol at -80&deg; C as many 150 &mu;L aliquots in 1.5 mL centrifuge tubes at a concentration of 3.4 x 1010 pfu/mL. 
Previous studies in our lab have shown that MIN6 cells encapsulated as aggregates maintain their viability throughout 4 weeks of culture in 20% oxygen. MIN6 aggregates cultured at 2 or 1% oxygen showed both signs of necrotic cells (still about 85-90% viable) by staining with ethidium bromide as well as morphological changes relative to cells in 20% oxygen. The smooth spherical shape of the aggregates displayed at 20% was lost and aggregates appeared more like disorganized groups of cells. While the low oxygen stress does not cause a pronounced drop in viability, it is clearly impacting MIN6 aggregation and function as measured by glucose-stimulated insulin secretion15. Western blot analysis of encapsulated cells in 20% and 1% oxygen also showed a significant increase in HIF-1&alpha; for cells cultured in the low oxygen conditions which correlates with the expression of the DsRed DR protein.

A method for photo-encapsulation of cells in a crosslinked PEG hydrogel is described. Hypoxic signaling within encapsulated murine insulinoma (MIN6) aggregates is tracked using a fluorescent marker system. This system allows serial examination of cells within a hydrogel scaffold and correlation of hypoxic signaling with changes in cell phenotype.

Seguimiento de señalización dentro de los agregados de células hipóxicas encapsulado

In Diabetes mellitus type 1, autoimmune destruction of the pancreatic &beta;-cells results in loss of insulin production and potentially lethal ...

Bioingeniería

Proteomic Analysis of Human Macrophage Polarization Under a Low Oxygen Environment

Macrophages are innate immune cells involved in a number of physiological functions ranging from responses to infectious pathogens to tissue homeostasis. The various functions of these cells are related to their activation states, which is also called polarization. The precise molecular description of these various polarizations is a priority in the field of macrophage biology. It is currently acknowledged that a multidimensional approach is necessary to describe how polarization is controlled by environmental signals. In this report, we describe a protocol designed to obtain the proteomic signature of various polarizations in human macrophages. This protocol is based on a label-free quantification of macrophage protein expression obtained from in-gel fractionated and Lys C/trypsin-digested cellular lysis content. We also provide a protocol based on in-solution digestion and isoelectric focusing fractionation to use as an alternative. Because oxygen concentration is a relevant environmental parameter in tissues, we use this protocol to explore how atmospheric composition or a low oxygen environment affects the classification of macrophage polarization.

We present a protocol to obtain proteomic signatures of human macrophages and apply this to determination of the impact of a low oxygen environment on macrophage polarization.

Análisis proteómico de polarización macrófago humano bajo un ambiente de poco oxígeno

Macrophages are innate immune cells involved in a number of physiological functions ranging from responses to infectious pathogens to tissue homeostasis. ...

Bioquímica

Rastreo de isótopos estables y análisis de LC-MS para medir las actividades de DHODH y SDH

Oxygen-Independent Assays to Measure Mitochondrial Function in Mammals

The flow of electrons in the mitochondrial electron transport chain (ETC) supports multifaceted biosynthetic, bioenergetic, and signaling functions in mammalian cells. As oxygen (O2) is the most ubiquitous terminal electron acceptor for the mammalian ETC, the O2 consumption rate is frequently used as a proxy for mitochondrial function. However, emerging research demonstrates that this parameter is not always indicative of mitochondrial function, as fumarate can be employed as an alternative electron acceptor to sustain mitochondrial functions in hypoxia. This article compiles a series of protocols that allow researchers to measure mitochondrial function independently of the O2 consumption rate. These assays are particularly useful when studying mitochondrial function in hypoxic environments. Specifically, we describe methods to measure mitochondrial ATP production, de novo pyrimidine biosynthesis, NADH oxidation by complex I, and superoxide production. In combination with classical respirometry experiments, these orthogonal and economical assays will provide researchers with a more comprehensive assessment of mitochondrial function in their system of interest.

Autor destacado: Ensayos independientes del oxígeno para medir la función mitocondrial en mamíferos  

Here, we present a compilation of assays to directly measure mitochondrial function in mammalian cells independently of their ability to consume molecular oxygen.

Ensayos independientes del oxígeno para medir la función mitocondrial en mamíferos

The flow of electrons in the mitochondrial electron transport chain (ETC) supports multifaceted biosynthetic, bioenergetic, and signaling functions in ...

Respirometric Oxidative Phosphorylation Assessment in Saponin-permeabilized Cardiac Fibers

Investigation of mitochondrial function represents an important parameter of cardiac physiology as mitochondria are involved in energy metabolism, oxidative stress, apoptosis, aging, mitochondrial encephalomyopathies and drug toxicity. Given this, technologies to measure cardiac mitochondrial function are in demand. One technique that employs an integrative approach to measure mitochondrial function is respirometric oxidative phosphorylation (OXPHOS) analysis.
The principle of respirometric OXPHOS assessment is centered around measuring oxygen concentration utilizing a Clark electrode. As the permeabilized fiber bundle consumes oxygen, oxygen concentration in the closed chamber declines. Using selected substrate-inhibitor-uncoupler titration protocols, electrons are provided to specific sites of the electron transport chain, allowing evaluation of mitochondrial function. Prior to respirometric analysis of mitochondrial function, mechanical and chemical preparatory techniques are utilized to permeabilize the sarcolemma of muscle fibers. Chemical permeabilization employs saponin to selectively perforate the cell membrane while maintaining cellular architecture.
This paper thoroughly describes the steps involved in preparing saponin-skinned cardiac fibers for oxygen consumption measurements to evaluate mitochondrial OXPHOS. Additionally, troubleshooting advice as well as specific substrates, inhibitors and uncouplers that may be used to determine mitochondria function at specific sites of the electron transport chain are provided. Importantly, the described protocol may be easily applied to cardiac and skeletal tissue of various animal models and human samples.

Saponin-permeabilized fiber preparation in conjunction with respirometric oxidative phosphorylation analysis provides integrative assessment of mitochondrial function. Mitochondrial respiration in physiological and pathological states can reflect various regulatory influences including mitochondrial interactions, morphology and biochemistry.

Evaluación de respirometría la fosforilación oxidativa en saponina-permeabilized fibras cardíacas

Investigation of mitochondrial function represents an important parameter of cardiac physiology as mitochondria are involved in energy metabolism, ...

Biología

Intra-cardiac Side-Firing Light Catheter for Monitoring Cellular Metabolism using Transmural Absorbance Spectroscopy of Perfused Mammalian Hearts

Absorbance spectroscopy of cardiac muscle provides non-destructive assessment of cytosolic and mitochondrial oxygenation via myoglobin and cytochrome absorbance respectively. In addition, numerous aspects of the mitochondrial metabolic status such as membrane potential and substrate entry can also be estimated. To perform cardiac wall transmission optical spectroscopy, a commercially available side-firing optical fiber catheter is placed in the left ventricle of the isolated perfused heart as a light source. Light passing through the heart wall is collected with an external optical fiber to perform optical spectroscopy of the heart in near real- time. The transmission approach avoids numerous surface scattering interference occurring in widely used reflection approaches. Changes in transmural absorbance spectra were deconvolved using a library of chromophore reference spectra, providing quantitative measures of all the known cardiac chromophores simultaneously. This spectral deconvolution approach eliminated intrinsic errors that may result from using common dual wavelength methods applied to overlapping absorbance spectra, as well as provided a quantitative evaluation of the goodness of fit. A custom program was designed for data acquisition and analysis, which permitted the investigator to monitor the metabolic state of the preparation during the experiment. These relatively simple additions to the standard heart perfusion system provide a unique insight into the metabolic state of the heart wall in addition to conventional measures of contraction, perfusion, and substrate/oxygen extraction.

Here we introduce a method for using an intra-ventricle optical catheter in perfused hearts to perform absorbance spectroscopy across the heart wall. The data obtained provides robust information on tissue oxygen tension as well as substrate utilization and membrane potential simultaneously with cardiac performance measures in this ubiquitous preparation.

Catéter de luz intracardiaca para monitorear el metabolismo celular utilizando espectroscopia de absorbancia transmural de corazones de mamíferos perfundidos

Absorbance spectroscopy of cardiac muscle provides non-destructive assessment of cytosolic and mitochondrial oxygenation via myoglobin and cytochrome ...

Biochemical Titration of Glycogen In vitro

Glycogen is the main energetic polymer of glucose in vertebrate animals and plays a crucial role in whole body metabolism as well as in cellular metabolism. Many methods to detect glycogen already exist but only a few are quantitative. We describe here a method using the Abcam Glycogen assay kit, which is based on specific degradation of glycogen to glucose by glucoamylase. Glucose is then specifically oxidized to a product that reacts with the OxiRed probe to produce fluorescence. Titration is accurate, sensitive and can be achieved on cell extracts or tissue sections. However, in contrast to other techniques, it does not give information about the distribution of glycogen in the cell. As an example of this technique, we describe here the titration of glycogen in two cell lines, Chinese hamster lung fibroblast CCL39 and human colon carcinoma LS174, incubated in normoxia (21% O2) versus hypoxia (1% O2). We hypothesized that hypoxia is a signal that prepares cells to synthesize and store glycogen in order to survive1.

Biochemical Titration of Glycogen In vitro

We describe here an accurate, reproducible and convenient biochemical method for titration of glycogen in vitro. This technique uses the Abcam Glycogen assay kit and is based on successive hydrolysis of glycogen to glucose and glucose titration by fluorescence.

Titulación bioquímica de glucógeno<em&gt; In vitro</em

Glycogen is the main energetic polymer of glucose in vertebrate animals and plays a crucial role in whole body metabolism as well as in cellular ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

Análisis de RNA Global Síntesis en el nivel de células individuales siguiente Hipoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

Análisis de proteínas Cap-unión en células humanas expuestas a condiciones de oxígeno fisiológicas

Resumen

Explorar más videos

Capítulos en este video

Medición de los niveles de mRNA con el tiempo durante la levadura S. cerevisiae por respuesta hipóxica

Seguimiento de señalización dentro de los agregados de células hipóxicas encapsulado

Análisis proteómico de polarización macrófago humano bajo un ambiente de poco oxígeno

Ensayos independientes del oxígeno para medir la función mitocondrial en mamíferos

Ensayos independientes del oxígeno para medir la función mitocondrial en mamíferos

Ensayos independientes del oxígeno para medir la función mitocondrial en mamíferos

Evaluación de respirometría la fosforilación oxidativa en saponina-permeabilized fibras cardíacas

Catéter de luz intracardiaca para monitorear el metabolismo celular utilizando espectroscopia de absorbancia transmural de corazones de mamíferos perfundidos

Titulación bioquímica de glucógeno

Análisis de RNA Global Síntesis en el nivel de células individuales siguiente Hipoxia