This work was supported by the Natural Sciences and Engineering Council of Canada and the Ontario Ministry of Research and Innovation.

세포 배양 1. 준비 <ol><li> 인간 세포의 시판 주식을 구입합니다. 참고 :이 프로토콜은 HCT116의 대장 암 및 기본 인간의 신장 근위 관 상피 세포 (HRPTEC)를 사용합니다. </li><li> 둘 베코의 수정 독수리 중간 (DMEM) 7.5 % 태아 소 혈청 (FBS), 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신 (P / S)로 보충 / 높은 포도당 매체 HCT116의 문화를 500 ml의 배지를 확인합니다. </li><li> 5 % FBS, 1 % 상피 세포 성장 보충제로 보충 상피 세포 매체와 1 % P / S : 500 ml의 HRPTEC의 문화 매체합니다. </li><li> 140 mM의 NaCl을, 3 밀리미터의 KCl, 10 mM의 나 2 HPO 4, 15 mM의 KH 2 PO 4 : 1 배 인산염 완충 식염수 (PBS)의 500 ml의를 준비합니다. 7.4으로 산도를 조정하고 121 ℃에서 40 분간 고압 증기 멸균에 의해 소독. </li></ol> 세포 배양 2. 개시 <ol><li> 조심스럽게 t을 방해하지 않고 80-90% 합류 요리에서 매체를 대기음그는 세포. </li><li> 배양 접시 당 1X PBS의 나누어지는 3 ~ 5 ㎖를 부드럽게 코팅 접시의 표면적을 각 플라스크 바위, 조심스럽게 1X PBS를 대기음. 두 번째 1X PBS 세척을 반복합니다. </li><li> (3) 각각의 배양 접시에 0.05 % 트립신 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA)의 용액 부드럽게 고르게 코팅 트립신 EDTA로 세포를 록 나누어. 2 ~ 3 분 동안 37 ° C에서 품어. </li><li> 90 초 동안 4,000 XG에 15 ML의 원심 분리기 튜브와 원심 분리기로 분리 된 세포를 전송합니다. </li><li> 완전 DMEM 1 ㎖에 재현 탁 된 세포 펠렛. </li><li> 혈구를 사용하여 세포를 계산합니다. 2 cm 당 약 2,500-5,000 세포의 초기 접종 농도를 달성하기 위해 요구되는 개수 비 발열 폴리스티렌 100mm 세포 배양 접시 계산한다. </li><li> 단계 30-45 분 동안 37 ° C의 수조에서 1.2 또는 1.3으로 만든 전 따뜻한 전체 세포 배양 배지. </li><li> 70 % 에탄올로 세포 배지 병 및 바이알의 오염을 제거. 앞으로 모든이 시점에서조작은 무균 적으로 수행해야합니다. </li><li> 분취 단계 2.6에서 언급 파종 밀도에서 냉동 된 세포의 전체 볼륨을 사용하기 위해 필요한만큼 100mm 세포 배양 접시에 완전 DMEM 6 용액. </li><li> 100 밀리미터 문화 요리의 각 단계 2.6에서 계산 된 세포 현탁액의 볼륨을 전송합니다. 균일 판의 표면 위에 세포를 분산 수동 각 플레이트 락. </li><li> 5 % CO 2 분위기에서 37 ° C에서 인큐베이터에서 시드 100mm 세포 배양 접시를 놓습니다. 세포가 다음 단계 전에 적어도 24 시간을 배양 할 수 있습니다. </li></ol> 3. 계대 배양 <ol><li> 세포 생장의 비율 (접시의 면적 % 셀)을 결정하기 위해 현미경 각 세포 배양 접시보기. 인큐베이터 및 사전 따뜻한 전체 매체와 1X PBS로 세포를 돌려줍니다. 세포가 80-100% 합류하는 경우 다음 단계로 진행합니다. </li><li> 조심스럽게을 방해하지 않고 보낸 매체를 대기음각각의 배양 접시에 세포. </li><li> 배양 접시 당 1X PBS의 나누어지는 3 ~ 5 ㎖를 부드럽게 코팅 접시의 표면적을 각 플라스크 바위, 조심스럽게 1X PBS를 대기음. 두 번째 1X PBS 세척을 반복합니다. </li><li> 나누어지는 3 각 배양 접시에 0.05 % 트립신 EDTA ml의 부드럽게는 바위 고르게 코트 트립신 EDTA로 세포에. 2 ~ 3 분 동안 37 ° C에서 품어. </li><li> 이 인큐베이션 동안 분취 많은 배양 접시에 완전 배지 10 ㎖를 2 cm 당 2,500-5,000 세포의 세포 밀도를 얻기 위해 요구된다. </li><li> 세포를 플레이트로부터 분리되면 빠르게 정의 1X 트립신 억제제 3를 가하여 가볍게 트립신 EDTA 전부가 중화되었는지 확인 1 분 동안 요리 소용돌이 친다. </li><li> 멸균 15 ㎖의 원심 분리 관으로 분리 된 세포를 전송하고 따로 설정합니다. 남아있는 세포를 수집, 같은 15ml의 원심 분리기 튜브에 그것을 전송 접시에 PBS 1X 3 ㎖를 추가합니다. </li><li> 150 × g으로 원심 분리하여 세포를 펠렛5 분. </li><li> 뜨는을 대기음 및 전체 매체의 3 ml의 세포 펠렛을 resuspend. </li><li> 혈구 계를 사용하여 세포를 세어 2 cm 당 2,500-5,000 세포의 세포 밀도를 얻을 완전 배지 15ml를 함유 150mm 배양 접시 시드. 각각의 캡 결합 분석을 위해 두 개의 150mm를 사용합니다. 참고 : 액체 매체를 통해 세포에 산소 확산 볼륨 (36)에 따라 달라집니다. 서스펜션 부착 세포 또는 세포가 사용되는지 여부를 실험과 일치하는 미디어의 볼륨을 유지하도록 권장한다. 미디어 확산에 이러한 가변성을 피하기 위해 (토론에서 논의 된 바와 같이 24 시간 동안 워크 스테이션에서 배양) 미리 조절 될 수있다. </li><li> 5 % CO 2 분위기에서 37 ° C에서 인큐베이터에서 시드 배양 접시를 놓습니다. 세포가 다음 단계로 진행하기 전에 적어도 24 시간을 배양 할 수 있습니다. </li></ol> 4. Physioxic 노출 <ol><li> 현미경으로 세포를 볼 수 있습니다. 포브스t 결과, 세포는 24 시간 노출 70-80 %의 합류, 48 시간 노출 50 ~ 60 %의 합류 및 72 시간 노출에 대한 40~50% 합류를되어 있는지 확인하십시오. </li><li> 원하는 시간 (24, 48, 또는 실험에 따라 72 시간)에 대한 저산소증 워크 스테이션에 세포를 놓습니다. </li><li> 해당 physioxia에 워크 스테이션을 설정합니다. 참고 : 예를 들어, 3 % O 2 설정이 5 % CO 2 및 92 % N이 수반 될 것이다. 참고 : 동적 범위 내에서 산소 변동이 악기로 특정 타임 라인, 프로그램 일정을 통해 원하는 또는 수동으로 원하는 간격으로 산소 설정을 조정하는 경우. </li><li> 60 %의 습도를 설정합니다. 워크 스테이션의 분위기는 그럼에도 불구하고 매우 건조하고, 미디어는 눈에 띄게 긴 실험 (&gt; 48 시간) 동안 증발됩니다. (미디어 스테이션 분위기로 평형화되도록) 세포 배양 DIS에 용지를 보충하기 위해 워크 스테이션 내에서 세포 배양 플라스크 내의 미디어 보유 유지HES. 참고 : 용존 산소가 대기 중 산소 36 평형을하도록 (예 : PBS와 트립신 EDTA)를 용해하기 전에 세포와 상호 작용하는 모든 솔루션은 저산소증 워크 스테이션에서 사용하기 전에 24 시간 동안 미리 조절해야합니다. </li><li> 용해 될 때까지 워크 스테이션 내에서 세포를 유지합니다. </li></ol> 캡 결합 분석 5. 준비 버퍼 <ol><li> 1X TBS 버퍼 (TBS)을 준비합니다. <ol><li> DH 2 O의 800 ㎖에, 8.76 g의 NaCl 및 6.05 g 트리스베이스를 해산. </li><li> 1 M 염산을 사용하여 7.4의 최종 pH의 용액을 준비한다. </li><li> DH 2 O를 사용하여 1 L로 최종 볼륨을 가져와 </li></ol></li><li> 비 변성 용해 버퍼를 준비한다. 캡 결합 분석의 일을 버퍼에 용해 준비합니다. 빈 아가로 오스 비즈와 γ 아미노 페닐-m 7 GTP 아가로 오스 C10 연결된 구슬 (7.9 및 7.13 단계) 씻어 추가 용해 버퍼를 확인합니다. <ol><li> DH 2 O 7 ㎖에 160 ㎕의 5 M NAC를 추가L, 160 ㎕의 1 M 트리스 -HCl pH 7.4의 40 ㎕의 200 mM의 NaF로부터 40 ㎕를 1 M의 MgCl 2, 40 ㎕의 1 mM의 나트륨 오르토 바나 데이트. </li><li> 7 ml의 용액에이게 팔의 40 μl를 추가합니다. 그것은 매우 점성으로이게 팔을 검색 할 수 있도록 피펫의 끝을 잘라. </li><li> 이게 팔이 모두 용해 될 때까지 최대 피펫 아래로, 또는 소용돌이에 의해 7 ml의 솔루션을 섞는다. </li><li> (8) 용액에 용액의 최종 부피를 올리고 얼음에 보관. </li></ol></li><li> 배 나트륨 도데 실 설페이트 (SDS) -page 샘플 버퍼를 준비합니다. <ol><li> 비이커에서 16 ml의 1 M 트리스 - 염산의 pH 6.8, 12.64 ml의 글리세롤, 8 ml의 디티 오 트레이 톨 (DTT)를 결합합니다. </li><li> SDS 3.2 g 및 브로 모 페놀 블루의 0.16 g을 추가합니다. 분말이 완전히 자기 교반 막대와 혼합하여 용해 할 수 있습니다. </li><li> -20 ° C에서 1.5 ml의의 microcentrifuge 튜브로 나누어지는 및 저장. </li></ol></li></ol> 6. 세포 용해 <ol><li> 비 변성 용해 버퍼를 준비하고 얼음에 일의 일을 계속전자의 캡 결합 분석을. </li><li> 30 분 동안 37 ° C를 물을 욕조에 1X PBS 사전 따뜻하고 트립신. </li><li> 각각의 캡 결합 분석을위한 1.5 ml의 microcentrifuge 관에 용해 버퍼의 나누어지는 980 μl를 수행된다. </li><li> 용해 완충액 980 μL에 4- (2- 아미노 에틸) 벤젠 설 포닐 플루오 라이드 하이드로 클로라이드 10 μL 및 100X 프로테아제 저해제 칵테일의 10 μL를 추가한다. 얼음에 보관하십시오. </li><li> 저산소증 워크 스테이션 내에서 폐기물 용기에 각각 150mm 접시에서 미디어를 폐기하십시오. </li><li> 따뜻한 1X PBS의 3-4 ml의 세포를 세척하고 액체를 모두 폐기합니다. </li><li> 각각의 접시에 따뜻한 0.05 % 트립신 EDTA 1 ㎖를 추가하고 2 분 동안 또는 세포가 더 이상 판에 부착 될 때까지 앉아 보자. </li><li> 피펫을 사용하여, 1.5 ml의 microcentrifuge 관 한 판의 세포를 전송합니다. 세포의 각 플레이트는 별도의 1.5 ML의 microcentrifuge 관에 전송되도록 필요에 따라 반복합니다. </li><li> 90 초 t 6,000 XG에 1.5 ml의의 microcentrifuge 튜브를 원심 분리기오 세포 펠렛. </li><li> 펠렛을 방해하지 않고 피펫을 사용하여 트립신을 대기음. 펠렛은 90 초 동안 6,000 XG에서 다시 원심 분리기 1.5 ML의 microcentrifuge 관을 방해합니다. </li><li> 부드럽게 단지 펠렛 위의 튜브에 PBS 200 μl를 피펫 팅하여 따뜻한 1X PBS로 세포를 씻으십시오. 다시 원심 분리기 펠렛을 방해합니다. </li><li> 펠렛을 방해하지 않고 PBS를 대기음. </li><li> 1 ml의 피펫으로부터 500 μL가 첫번째 세포 펠렛에 용해 완충 용액을 준비했다. 로 pipetting 아래로 완전히 펠렛을 재현 탁. </li><li> 두 번째 세포 펠렛으로 재현 탁 세포를 결합하고로 pipetting 아래로 두 번째 펠렛을 재현 탁. 모든 펠릿이 결합 된 각각의 샘플에 대한 재현 탁 될 때까지이 과정을 반복합니다. </li><li> 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브에 용해 버퍼의 나머지 500 μL와 해물을 결합한다. </li><li> 저산소증 워크 스테이션에서 샘플을 제거합니다. 주 : 용해 완충액을 첨가 후,LL 후속 단계는 저산소증 워크 스테이션은 37 ° C로 설정하고, 다음 단계 냉 (4 ℃ 또는 빙상에서) 수행 될 수있는 바와 같이 대기에서 수행되어야한다. </li><li> 를 Lyse 1.5-2 시간 동안 39 ° C에서 샘플들을 회전시킴으로써 교반과를 이용하여 세포. </li><li> 세포 파편을 제거하기 위해 4 ° C에서 15 분 동안 12,000 XG에서 분해 된 세포를 원심 분리기. </li><li> 새로운 1.5 ML의 microcentrifuge 관에 해물을 전송하고 펠렛을 폐기합니다. </li><li> 상층 액의 일부 (~ 10 %)가 미래 웨스턴 블롯 분석을 위해 전체 세포 용 해물 입력 제어로서 사용되는 예비. </li></ol> 7. 캡 결합 분석 <ol><li> 각 샘플에 대해, 1.5 ml의 마이크로 원심 분리 튜브를 블랭크 아가 로스 비드 제어 슬러리의 50 μL와 γ 아미노 - m 7 GTP 아가 C10 결합 비드 슬러리의 50 μl를 옮긴다. 비드 슬러리의 수집을 용이하게하기 위해 피펫의 팁을 제거하기 위해 가위를 사용합니다. </li><li> 구슬의 B 펠렛Y는 30 초 동안 500 XG에 슬러리를 원심. </li><li> 조심스럽게 상층 액을 제거하고 TBS의 500 μL의 비드를 재현 탁. </li><li> 반복 7.2 및 7.3 단계를 반복합니다. 30 초 동안 500 XG에 구슬을 펠렛과 뜨는을 제거합니다. </li><li> 빈 아가 로스 비드를 함유하는 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브에 6.19 단계에서 용 해물을 포함하는 상등액을 전송. 주 : 빈 아가 로스 비드 비특이적 비드와 상호 작용 해물로부터 단백질을 제거하기 전 지우기 단계로서 작용한다. </li><li> 부드러운 교반과 함께 4 ° C에서 10 분 동안 품어. </li><li> 30 초 동안 500 XG에 원심 분리하여 빈 아가 로스 비드 펠렛. </li><li> γ 아미노 - m 7 GTP 아가 C10 결합 된 비드를 함유하는 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브에 해물을 전송. </li><li> , 용해 완충액 500 μL의 비드를 재현 탁 30 초 동안 500 XG에 원심 분리하여 구슬을 펠렛 및 superna을 버리고 빈 아가로 오스 구슬을 씻으십시오중대장. 오 세척 총이 네 번 반복합니다. </li><li> 1X SDS-PAGE 샘플 버퍼에 빈 아가 로스 비드를 재현 탁하고, 95 ℃에서 90 초 동안 비드를 끓인다. 미래의 웨스턴 블롯 분석을 위해 -20 ° C에서 보관 관심의 단백질이 구슬 비 - 특이 적으로 결합 여부를 관찰합니다. </li><li> 캡 - 결합 단백질을 캡처 4 ° C에서 1 시간 동안 교반과 함께 γ 아미노 페닐-m 7 GTP 아가로 오스 C10 연결된 구슬과 해물을 품어. </li><li> 30 초 동안 500 XG에 원심 분리하여 γ 아미노 페닐-m 7 GTP 아가로 오스 C10 연결된 구슬 펠렛. 상층 액을 버린다. </li><li> 단계 7.9을 반복하여 γ 아미노 페닐-m 7 GTP 아가로 오스 C10 연결된 구슬을 씻으십시오. </li><li> 용해 완충액 600 μL의 비드를 재현 탁. </li><li> 최종 농도 1 mM GTP에 추가. </li><li> 4 ℃에서 1 시간 동안 교반과 함께 γ 아미노 페닐-m 7 GTP 아가로 오스 C10 연결된 구슬 + 1 ㎜ GTP를 품어. 참고 :이를비특이적 m 7 GTP와 상호 작용하는 단백질을 해제한다 (즉,도 비 메틸화 GTP와 상호 작용). </li><li> 30 초 동안 500 XG에 원심 분리하여 γ 아미노 페닐-m 7 GTP 아가로 오스 C10 연결된 구슬 펠렛. </li><li> 새로운 1.5 ㎖의 마이크로 원심 튜브에 상청을 전송 및 4X SDS-PAGE 샘플 완충액 (50 mM Tris-HCl, 100 mM의 DTT, 2 % SDS, 블루 0.1 % 브로 모 페놀 및 10 % 글리세롤) 200 μL를 추가한다. 미래의 웨스턴 블롯 분석 37 -20 ° C에서 GTP 제어 샘플을 저장합니다. 단계 7.9를 반복하여 구슬을 씻으십시오. </li><li> 90 초 동안 95 ℃에서 1X SDS-PAGE 샘플 완충액 (50 mM Tris-HCl, 100 mM의 DTT, 2 % SDS, 블루 0.1 % 브로 모 페놀 및 10 % 글리세롤) 및 종기에 비드를 재현 탁. 미래의 웨스턴 블롯 분석 37 -20 ° C에서 m 7 GTP 결합 된 부분을 저장합니다. </li></ol>

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A., Zuberek, J., Darzynkiewicz, E., Kufel, J., Jemielity, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affinity+resins+containing+enzymatically+resistant+mRNA+cap+analogs--a+new+tool+for+the+analysis+of+cap-binding+proteins.">Affinity resins containing enzymatically resistant mRNA cap analogs--a new tool for the analysis of cap-binding proteins.</a> RNA. 18 (7), 1421-1432 (2012).</li><li>Joshi, B., Cameron, A., Jagus, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+mammalian+eIF4E-family+members.">Characterization of mammalian eIF4E-family members.</a> Eur J Biochem. 271 (11), 2189-2203 (2004).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

생리 산소 조건에 노출 된 인간 세포 캡 결합 단백질의 분석은 신규 산소 조절 번역 개시 인자의 확인을 허용 할 수있다. mRNA의 캡 또는 다른 관련 단백질의 5 &#39;캡 이러한 요소의 선호도가 7 m 그들의 관계의 강도에 의해 측정 될 수 아가 로스 비드 GTP 결합. 이 기술의 한 가지주의는 단백질 분해 이후의 캡 결합 전위를 측정하지만,이 단백질 - 단백질 상호 작용과 번역 후 변형 (PTMS)을 유지...

번역 컨트롤은 특히 세포 스트레스 일의 기간 동안, 유전자 발현의 전사 조절에 동등하게 중요한 단계로 부상하고있다. 번역 제어의 초점은 단백질 합성의 첫 번째 단계는 7 methylguanosine에 진핵 개시 인자 4E (eIF4E에)의 결합을 포함 개시의 속도 제한 단계 (m 7 GTP)의 mRNA 2의 5 &#39;캡에있다 . 의 eIF4E는 eIF4A, RNA 헬리 카제 및 eIF4G, 다른 번역 요인과 40S는 3 리보솜의 채용에 필요한 비계 단백질을 포함 eIF4F라는 이름의 삼량 체 복합체의 일부입니다. 정상적인 생리 조건에서의 mRNA의 대부분은 모자에 의존하는 메커니즘을 통해 번역되어 있지만, 세포 스트레스의 기간에 따라 인간의 mRNA의 약 10 %는 1,4 intiation 모자 독립적 인 번역을 허용 할 수있는 5 &#39;의 UTRs가 포함되어 있습니다. 모자 종속 번역은 역사적으로 동의어있다OU에 eIF4F으로, 그러나, eIF4F의 스트레스 별 변화는 추세 주제 5-8이되었다. 다양한 세포 응력의 eIF4E 활성이 라파 마이신 복합체 1 (mTORC1)의 포유 동물 표적을 통해 억압되도록. 이러한 키나아제의 목표 중 하나의 증가 된 활성을 초래 응력 하에서 손상되고, 제 (4E-BP) 단백질 4E는 바인딩. 비 인산화 4E-BP는의 eIF4E 및 블록 eIF4G 모자 종속 번역 9,10의 억압의 원인과 상호 작용하는 능력을 결합한다. 흥미롭게도, eIF4E2 (또는 4EHP)라는 이름의 eIF4E의 동족체는 아마도 스트레스 중재 억압을 회피 할 수 4E-BP (11)에 대한 훨씬 낮은 친 화성을 가지고있다. 사실, 처음으로 인해 eIF4G (12)과의 상호 작용의 부족에 번역의 리프레 특징, eIF4E2는 저산소 스트레스 6,13- 동안 그들의 3 &#39;UTR에서 RNA 저산소증 응답 요소를 포함 mRNA를 수백의 번역을 시작합니다. 이 활성화 난eIF4G3, RNA는 저산소 eIF4F 복합체, 또는 eIF4F H 6,13-을 구성하는 단백질 모티브 (4) 및 저산소증 유도 인자 (HIF) 2α 바인딩과의 상호 작용을 통해 달성 s의. 정상적인 조건에서 리프레으로 eIF4E2는 GIGYF2 및 ZNF598 (14)와 결합한다. 이 단지는 부분적으로 아가로 오스 연계 m 7 GTP 친 화성 수지를 통해 확인되었다. 이 고전적인 방법 (15)는 번역의 분야에서 표준과 최고의 가장 일반적으로 아래로 끌어 오기에 캡 결합 복합체를 분리하는 기술을 사용하고 체외에서 결합 분석 16-19입니다. 캡 - 의존적 번역 기계가 상호 변경 부 6-8,13와 같이 유연하고 적응력이 대두되고,이 방법은 급속 스트레스 반응에 관여하는 신규 한 캡 - 결합 단백질을 확인하기위한 강력한 도구이다. 여러 진핵 모델 시스템은 스트레스 반응 등을위한 eIF4E2의 동족체를 사용하여 나타나는 또한, eIF4F의 변화는 광범위한 영향을 미칠 수A. 장대 (20)로, S. Pombe 21 D. 22을 melanogaster의, 그리고 C. 23 엘레 간스. 증거 eIF4F 변동 엄격 조건을 강조하지만, 정상적인 생리 24에 관여 한정되지 않을 수 있음을 시사한다. (미소 전극을 통해 측정) (모세관 말단) 또는 조직 내에서 조직으로의 산소 공급은 뇌 25 2-6 %에서 다양 폐 26 3-12 %, 27 장, 4 %에서 3.5-6 %의 간 28 신장 29 7~12% 근육 30 4 %, 골수 31 6~7%. 세포와 미토콘드리아는 1.3 % 산소 32 이하를 포함한다. 이 값은 세포가 일상적으로 배양 주변 공기보다 저산소증에 훨씬 가깝다. 이것은 무엇을하는 것은 이전에 저산소증 특정 세포 과정은 생리 학적 환경에서 관련 될 수있는 것으로 생각하고 있음을 시사한다. 흥미롭게도, eIF4F 및 eIF4F H </suP&gt; 적극적으로 생리 학적 산소 또는 &quot;physioxia&quot;(24)에 노출 된 여러 가지 인간의 세포 라인에 독특한 풀 또는의 mRNA의 클래스의 번역 개시에 참여한다. 낮은 산소는 적절한 태아의 개발 (33)를 구동 세포는 일반적으로 높은 확산 속도, 긴 수명, 적은 DNA 손상과 physioxia (34) 덜 일반적인 스트레스 반응이 있습니다. 따라서, eIF4F H 가능성이 생리 학적 조건에서 선택 유전자의 발현에 중요한 요소이다. 여기, 우리는 고정 된 생리 학적 산소 조건에서 또는 조직의 미세 환경의 가능성이보다 잘 나타내는 동적 변동 범위 내에서 배양 세포에 대한 프로토콜을 제공합니다. 이 방법의 장점은 세포가 저산소 워크 스테이션 내에 용해된다는 것이다. 이 세포 용해에 저산소 세포 배양에서 전환 다른 프로토콜에서 수행되는 빈도를 명확하지 않다. 세포는 종종 첫 번째 작은 저산소증 인큐베이터에서 제거 할 수산소의 세포 응답 (하나 또는 두 개의 분) 35 빠른 같이 앞 용해,하지만 산소이 노출 생화학 적 경로에 영향을 미칠 수 있습니다. 특정 캡 - 결합 단백질은 제 2베이스와의 상호 작용을 필요로하거나, 따라서 일부 캡 인터랙는 정제 과정에서 누락 될 수 m 7 GTP를 가수 분해 할 수있다. 아가 로스 결합 된 효소 방수 캡 유사체로는이 프로토콜에서 치환 될 수있다. 여기에 설명 된 방법을 통해 활동과 eIF4F H 및 eIF4F의 다른 변형의 구성을 탐색하는 세포 생리 학적 조건 또는 스트레스 반응시 활용 복잡한 유전자 발현 기계에 빛을 흘릴 것입니다.

<table><tbody><tr><td>&amp;gamma;-aminophenyl-m&lt;sup&gt;7&lt;/sup&gt;GTP agarose C&lt;sub&gt;10&lt;/sub&gt;-linked beads</td><td>Jena Bioscience</td><td>AC-1555</td><td>Agarose-linked m&lt;sup&gt;7&lt;/sup&gt;GTP</td></tr><tr><td>100 mm culture dish</td><td>Corning</td><td>877222</td><td>10-cm culture dish</td></tr><tr><td>150 mm culture dish</td><td>Thermofisher</td><td>130183</td><td>15 cm culture dish</td></tr><tr><td>AEBSF Hydrochloride</td><td>ACROS Organics</td><td>A0356829</td><td>AEBSF</td></tr><tr><td>Agarose Beads</td><td>Jena Bioscience&amp;nbsp;</td><td>AC-0015</td><td>Agarose bead control</td></tr><tr><td>Bromophenol Blue</td><td>Fisher</td><td>BP112-25</td><td>Component of SDS-PAGE loading buffer</td></tr><tr><td>1.5 ml Centrifuge Tubes</td><td>FroggaBio</td><td>1210-00S</td><td>Used to centrifuge small volumes</td></tr><tr><td>15 ml Conical Centrifuge Tubes</td><td>Fisher</td><td>1495970C</td><td>Used in culturing primary cells</td></tr><tr><td>Defined trypsin inhibitor</td><td>Fisher</td><td>R007100</td><td>DTI</td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Fisher</td><td>BP172-25</td><td>DTT</td></tr><tr><td>Epithelial cell medium (complete kit)</td><td>ScienCell</td><td>4101</td><td>Includes serum and growth factor supplements)</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Fisher</td><td>BP229-1</td><td>Component of SDS-PAGE loading buffer</td></tr><tr><td>100 mM Guanosine 5&#039;-triphosphate, 1 ml</td><td>Jena Bioscience</td><td>272076-0251M</td><td>GTP</td></tr><tr><td>HCT116 colorectal carcinoma</td><td>ATCC</td><td>CCL-247</td><td>Human cancer cell line</td></tr><tr><td>Human renal proximal tubular epithelial cells</td><td>ATCC</td><td>PCS-400-010</td><td>HRPTEC</td></tr><tr><td>Hyclone DMEM/High Glucose</td><td>GE Life Sciences</td><td>SH30022.01</td><td>Standard media for human cell culture</td></tr><tr><td>Hyclone Penicillin-Streptomycin solution</td><td>GE Life Sciences</td><td>SV30010</td><td>Antibiotic component of DMEM</td></tr><tr><td>H35 HypOxystation</td><td>Hypoxygen</td><td>N/A</td><td>Hypoxia workstation</td></tr><tr><td>Igepal CA-630</td><td>MP Biomedicals</td><td>2198596</td><td>Detergent component of lysis buffer</td></tr><tr><td>Monopotassium phosphate</td><td>Fisher</td><td>P288-500</td><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>Fisher</td><td>P217-500</td><td>KCl</td></tr><tr><td>Magnesium chloride</td><td>Fisher</td><td>M33-500</td><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Fisher</td><td>BP358-10</td><td>NaCl</td></tr><tr><td>Sodium fluoride</td><td>Fisher</td><td>5299-100</td><td>NaF (phosphatase inhibitor component of lysis buffer)</td></tr><tr><td>Disodium phosphate</td><td>Fisher</td><td>5369-500</td><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>Premium Grade Fetal Bovine Serum</td><td>Seradigm</td><td>1500-500</td><td>FBS</td></tr><tr><td>Protease Inhibitor Cocktail (100x)</td><td>Cell Signalling</td><td>58715</td><td>Component of lysis buffer</td></tr><tr><td>Sodium Dodecyl Sulfate</td><td>Fisher</td><td>BP166-100</td><td>SDS</td></tr><tr><td>Sodium Orthovanadate</td><td>Sigma</td><td>56508</td><td>Na&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;VO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Fisher</td><td>BP152-5</td><td>Component of buffers</td></tr><tr><td>0.05% Trypsin-EDTA (1x)</td><td>Life Technologies</td><td>2500-067</td><td>Trypsin used to detach adherent cells</td></tr></tbody></table>

analysis of cap-binding proteins in human cells exposed to physiological oxygen conditions

Translational control is a focal point of gene regulation, especially during periods of cellular stress. Cap-dependent translation via the eIF4F complex is by far the most common pathway to initiate protein synthesis in eukaryotic cells, but stress-specific variations of this complex are now emerging. Purifying cap-binding proteins with an affinity resin composed of Agarose-linked m7GTP (a 5' mRNA cap analog) is a useful tool to identify factors involved in the regulation of translation initiation. Hypoxia (low oxygen) is a cellular stress encountered during fetal development and tumor progression, and is highly dependent on translation regulation. Furthermore, it was recently reported that human adult organs have a lower oxygen content (physioxia 1-9% oxygen) that is closer to hypoxia than the ambient air where cells are routinely cultured. With the ongoing characterization of a hypoxic eIF4F complex (eIF4FH), there is increasing interest in understanding oxygen-dependent translation initiation through the 5' mRNA cap. We have recently developed a human cell culture method to analyze cap-binding proteins that are regulated by oxygen availability. This protocol emphasizes that cell culture and lysis be performed in a hypoxia workstation to eliminate exposure to oxygen. Cells must be incubated for at least 24 hr for the liquid media to equilibrate with the atmosphere within the workstation. To avoid this limitation, pre-conditioned media (de-oxygenated) can be added to cells if shorter time points are required. Certain cap-binding proteins require interactions with a second base or can hydrolyze the m7GTP, therefore some cap interactors may be missed in the purification process. Agarose-linked to enzymatically resistant cap analogs may be substituted in this protocol. This method allows the user to identify novel oxygen-regulated translation factors involved in cap-dependent translation.

M이 7 GTP 선호도 열에서의 eIF4E 및 eIF4E2의 산소에 반응하여 캡 결합 능력 분석 1 및도 2는 두 사람의 세포주에서 산소 변동에 대한 응답으로 두 가지 주요 캡 - 결합 단백질의 전형적인 m 7 GTP 선호도 정화의 서양 말을 나타냅니다 F의 igure 1과 대장 암의 주요 인간 신장 근위 관 ...

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Analysis of Cap-binding Proteins in Human Cells Exposed to Physiological Oxygen Conditions

Here, we present human cell culture protocols to analyze translation initiation factors that bind the 5' cap of mRNA during physiological oxygen conditions. This method utilizes an Agarose-linked m7GTP cap analog and is suitable to investigate cap-binding factors and their interacting partners.

생리 산소 조건에 노출 된 인간 세포의 캡 결합 단백질의 분석

Translational control is a focal point of gene regulation, especially during periods of cellular stress. Cap-dependent translation via the eIF4F complex ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Genetics

7.7K 조회수.  University of Guelph. Here, we present human cell culture protocols to analyze translation initiation factors that bind the 5' cap of mRNA during physiological oxygen conditions. This method utilizes an Agarose-linked m7GTP cap analog and is suitable to investigate cap-binding factors and their interacting partners.

비디오: Analysis of Cap-binding Proteins in Human Cells Exposed to Physiological Oxygen Conditions

Measuring mRNA Levels Over Time During the Yeast S. cerevisiae Hypoxic Response

Complex changes in gene expression typically mediate a large portion of a cellular response. Each gene may change expression with unique kinetics as the gene is regulated by the particular timing of one of many stimuli, signaling pathways or secondary effects. In order to capture the entire gene expression response to hypoxia in the yeast S. cerevisiae, RNA-seq analysis was used to monitor the mRNA levels of all genes at specific times after exposure to hypoxia. Hypoxia was established by growing cells in ~100% N2 gas. Importantly, unlike other hypoxic studies, ergosterol and unsaturated fatty acids were not added to the media because these metabolites affect gene expression. Time points were chosen in the range of 0 - 4 h after hypoxia because that period captures the major changes in gene expression. At each time point, mid-log hypoxic cells were quickly filtered and frozen, limiting exposure to O2 and concomitant changes in gene expression. Total RNA was extracted from cells and used to enrich for mRNA, which was then converted to cDNA. From this cDNA, multiplex libraries were created and eight or more samples were sequenced in one lane of a next-generation sequencer. A post-sequencing pipeline is described, which includes quality base trimming, read mapping and determining the number of reads per gene. DESeq2 within the R statistical environment was used to identify genes that change significantly at any one of the hypoxic time points. Analysis of three biological replicates revealed high reproducibility, genes of differing kinetics and a large number of expected O2-regulated genes. These methods can be used to study how the cells of various organisms respond to hypoxia over time and adapted to study gene expression during other cellular responses.

Measuring mRNA Levels Over Time During the Yeast S. cerevisiae Hypoxic Response

Here, we present a protocol using RNA-seq to monitor mRNA levels over time during the hypoxic response of S. cerevisiae cells. This method can be adapted to analyze gene expression during any cellular response.

효 모 S. cerevisiae Hypoxic 응답 하는 동안 시간이 지남에 mRNA 수준 측정

Complex changes in gene expression typically mediate a large portion of a cellular response. Each gene may change expression with unique kinetics as the ...

연구

유전학

Tracking Hypoxic Signaling within Encapsulated Cell Aggregates

In Diabetes mellitus type 1, autoimmune destruction of the pancreatic &beta;-cells results in loss of insulin production and potentially lethal hyperglycemia. As an alternative treatment option to exogenous insulin injection, transplantation of functional pancreatic tissue has been explored1,2. This approach offers the promise of a more natural, long-term restoration of normoglycemia. Protection of the donor tissue from the host's immune system is required to prevent rejection and encapsulation is a method used to help achieve this aim.
Biologically-derived materials, such as alginate3 and agarose4, have been the traditional choice for capsule construction but may induce inflammation or fibrotic overgrowth5 which can impede nutrient and oxygen transport. Alternatively, synthetic poly(ethylene glycol) (PEG)-based hydrogels are non-degrading, easily functionalized, available at high purity, have controllable pore size, and are extremely biocompatible,6,7,8. As an additional benefit, PEG hydrogels may be formed rapidly in a simple photo-crosslinking reaction that does not require application of non-physiological temperatures6,7. Such a procedure is described here. In the crosslinking reaction, UV degradation of the photoinitiator, 1-[4-(2-Hydroxyethoxy)-phenyl]-2-hydroxy-2-methyl-1-propane-1-one (Irgacure 2959), produces free radicals which attack the vinyl carbon-carbon double bonds of dimethacrylated PEG (PEGDM) inducing crosslinking at the chain ends. Crosslinking can be achieved within 10 minutes. PEG hydrogels constructed in such a manner have been shown to favorably support cells7,9, and the low photoinitiator concentration and brief exposure to UV irradiation is not detrimental to viability and function of the encapsulated tissue10. While we methacrylate our PEG with the method described below, PEGDM can also be directly purchased from vendors such as Sigma.
An inherent consequence of encapsulation is isolation of the cells from a vascular network. Supply of nutrients, notably oxygen, is therefore reduced and limited by diffusion. This reduced oxygen availability may especially impact &beta;-cells whose insulin secretory function is highly dependent on oxygen11-13. Capsule composition and geometry will also impact diffusion rates and lengths for oxygen. Therefore, we also describe a technique for identifying hypoxic cells within our PEG capsules. Infection of the cells with a recombinant adenovirus allows for a fluorescent signal to be produced when intracellular hypoxia-inducible factor (HIF) pathways are activated14. As HIFs are the primary regulators of the transcriptional response to hypoxia, they represent an ideal target marker for detection of hypoxic signaling15. This approach allows for easy and rapid detection of hypoxic cells. Briefly, the adenovirus has the sequence for a red fluorescent protein (Ds Red DR from Clontech) under the control of a hypoxia-responsive element (HRE) trimer. Stabilization of HIF-1 by low oxygen conditions will drive transcription of the fluorescent protein (Figure 1). Additional details on the construction of this virus have been published previously15. The virus is stored in 10% glycerol at -80&deg; C as many 150 &mu;L aliquots in 1.5 mL centrifuge tubes at a concentration of 3.4 x 1010 pfu/mL. 
Previous studies in our lab have shown that MIN6 cells encapsulated as aggregates maintain their viability throughout 4 weeks of culture in 20% oxygen. MIN6 aggregates cultured at 2 or 1% oxygen showed both signs of necrotic cells (still about 85-90% viable) by staining with ethidium bromide as well as morphological changes relative to cells in 20% oxygen. The smooth spherical shape of the aggregates displayed at 20% was lost and aggregates appeared more like disorganized groups of cells. While the low oxygen stress does not cause a pronounced drop in viability, it is clearly impacting MIN6 aggregation and function as measured by glucose-stimulated insulin secretion15. Western blot analysis of encapsulated cells in 20% and 1% oxygen also showed a significant increase in HIF-1&alpha; for cells cultured in the low oxygen conditions which correlates with the expression of the DsRed DR protein.

A method for photo-encapsulation of cells in a crosslinked PEG hydrogel is described. Hypoxic signaling within encapsulated murine insulinoma (MIN6) aggregates is tracked using a fluorescent marker system. This system allows serial examination of cells within a hydrogel scaffold and correlation of hypoxic signaling with changes in cell phenotype.

캡슐화된 세포 집계 내에서 추적 Hypoxic 신호

In Diabetes mellitus type 1, autoimmune destruction of the pancreatic &beta;-cells results in loss of insulin production and potentially lethal ...

생체공학

Proteomic Analysis of Human Macrophage Polarization Under a Low Oxygen Environment

Macrophages are innate immune cells involved in a number of physiological functions ranging from responses to infectious pathogens to tissue homeostasis. The various functions of these cells are related to their activation states, which is also called polarization. The precise molecular description of these various polarizations is a priority in the field of macrophage biology. It is currently acknowledged that a multidimensional approach is necessary to describe how polarization is controlled by environmental signals. In this report, we describe a protocol designed to obtain the proteomic signature of various polarizations in human macrophages. This protocol is based on a label-free quantification of macrophage protein expression obtained from in-gel fractionated and Lys C/trypsin-digested cellular lysis content. We also provide a protocol based on in-solution digestion and isoelectric focusing fractionation to use as an alternative. Because oxygen concentration is a relevant environmental parameter in tissues, we use this protocol to explore how atmospheric composition or a low oxygen environment affects the classification of macrophage polarization.

We present a protocol to obtain proteomic signatures of human macrophages and apply this to determination of the impact of a low oxygen environment on macrophage polarization.

낮은 산소 환경에서 인간 대 식 세포 분극의 Proteomic 분석

Macrophages are innate immune cells involved in a number of physiological functions ranging from responses to infectious pathogens to tissue homeostasis. ...

생화학

DHODH 및 SDH 활성을 측정하기 위한 안정 동위원소 추적 및 LC-MS 분석

Oxygen-Independent Assays to Measure Mitochondrial Function in Mammals

The flow of electrons in the mitochondrial electron transport chain (ETC) supports multifaceted biosynthetic, bioenergetic, and signaling functions in mammalian cells. As oxygen (O2) is the most ubiquitous terminal electron acceptor for the mammalian ETC, the O2 consumption rate is frequently used as a proxy for mitochondrial function. However, emerging research demonstrates that this parameter is not always indicative of mitochondrial function, as fumarate can be employed as an alternative electron acceptor to sustain mitochondrial functions in hypoxia. This article compiles a series of protocols that allow researchers to measure mitochondrial function independently of the O2 consumption rate. These assays are particularly useful when studying mitochondrial function in hypoxic environments. Specifically, we describe methods to measure mitochondrial ATP production, de novo pyrimidine biosynthesis, NADH oxidation by complex I, and superoxide production. In combination with classical respirometry experiments, these orthogonal and economical assays will provide researchers with a more comprehensive assessment of mitochondrial function in their system of interest.

저자 스포트라이트: 포유류의 미토콘드리아 기능을 측정하기 위한 산소 독립적 분석  

Here, we present a compilation of assays to directly measure mitochondrial function in mammalian cells independently of their ability to consume molecular oxygen.

포유류의 미토콘드리아 기능을 측정하기 위한 산소 비의존적 분석

The flow of electrons in the mitochondrial electron transport chain (ETC) supports multifaceted biosynthetic, bioenergetic, and signaling functions in ...

Respirometric Oxidative Phosphorylation Assessment in Saponin-permeabilized Cardiac Fibers

Investigation of mitochondrial function represents an important parameter of cardiac physiology as mitochondria are involved in energy metabolism, oxidative stress, apoptosis, aging, mitochondrial encephalomyopathies and drug toxicity. Given this, technologies to measure cardiac mitochondrial function are in demand. One technique that employs an integrative approach to measure mitochondrial function is respirometric oxidative phosphorylation (OXPHOS) analysis.
The principle of respirometric OXPHOS assessment is centered around measuring oxygen concentration utilizing a Clark electrode. As the permeabilized fiber bundle consumes oxygen, oxygen concentration in the closed chamber declines. Using selected substrate-inhibitor-uncoupler titration protocols, electrons are provided to specific sites of the electron transport chain, allowing evaluation of mitochondrial function. Prior to respirometric analysis of mitochondrial function, mechanical and chemical preparatory techniques are utilized to permeabilize the sarcolemma of muscle fibers. Chemical permeabilization employs saponin to selectively perforate the cell membrane while maintaining cellular architecture.
This paper thoroughly describes the steps involved in preparing saponin-skinned cardiac fibers for oxygen consumption measurements to evaluate mitochondrial OXPHOS. Additionally, troubleshooting advice as well as specific substrates, inhibitors and uncouplers that may be used to determine mitochondria function at specific sites of the electron transport chain are provided. Importantly, the described protocol may be easily applied to cardiac and skeletal tissue of various animal models and human samples.

Saponin-permeabilized fiber preparation in conjunction with respirometric oxidative phosphorylation analysis provides integrative assessment of mitochondrial function. Mitochondrial respiration in physiological and pathological states can reflect various regulatory influences including mitochondrial interactions, morphology and biochemistry.

사포닌 - permeabilized 심장 섬유에 Respirometric 산화 인산화 평가

Investigation of mitochondrial function represents an important parameter of cardiac physiology as mitochondria are involved in energy metabolism, ...

생물학

Intra-cardiac Side-Firing Light Catheter for Monitoring Cellular Metabolism using Transmural Absorbance Spectroscopy of Perfused Mammalian Hearts

Absorbance spectroscopy of cardiac muscle provides non-destructive assessment of cytosolic and mitochondrial oxygenation via myoglobin and cytochrome absorbance respectively. In addition, numerous aspects of the mitochondrial metabolic status such as membrane potential and substrate entry can also be estimated. To perform cardiac wall transmission optical spectroscopy, a commercially available side-firing optical fiber catheter is placed in the left ventricle of the isolated perfused heart as a light source. Light passing through the heart wall is collected with an external optical fiber to perform optical spectroscopy of the heart in near real- time. The transmission approach avoids numerous surface scattering interference occurring in widely used reflection approaches. Changes in transmural absorbance spectra were deconvolved using a library of chromophore reference spectra, providing quantitative measures of all the known cardiac chromophores simultaneously. This spectral deconvolution approach eliminated intrinsic errors that may result from using common dual wavelength methods applied to overlapping absorbance spectra, as well as provided a quantitative evaluation of the goodness of fit. A custom program was designed for data acquisition and analysis, which permitted the investigator to monitor the metabolic state of the preparation during the experiment. These relatively simple additions to the standard heart perfusion system provide a unique insight into the metabolic state of the heart wall in addition to conventional measures of contraction, perfusion, and substrate/oxygen extraction.

Here we introduce a method for using an intra-ventricle optical catheter in perfused hearts to perform absorbance spectroscopy across the heart wall. The data obtained provides robust information on tissue oxygen tension as well as substrate utilization and membrane potential simultaneously with cardiac performance measures in this ubiquitous preparation.

교란 성 포유류 심장의 경부 흡광도 분광학을 사용하여 세포 대사를 모니터링하기위한 심장 내 측 발사 라이트 카테터

Absorbance spectroscopy of cardiac muscle provides non-destructive assessment of cytosolic and mitochondrial oxygenation via myoglobin and cytochrome ...

Biochemical Titration of Glycogen In vitro

Glycogen is the main energetic polymer of glucose in vertebrate animals and plays a crucial role in whole body metabolism as well as in cellular metabolism. Many methods to detect glycogen already exist but only a few are quantitative. We describe here a method using the Abcam Glycogen assay kit, which is based on specific degradation of glycogen to glucose by glucoamylase. Glucose is then specifically oxidized to a product that reacts with the OxiRed probe to produce fluorescence. Titration is accurate, sensitive and can be achieved on cell extracts or tissue sections. However, in contrast to other techniques, it does not give information about the distribution of glycogen in the cell. As an example of this technique, we describe here the titration of glycogen in two cell lines, Chinese hamster lung fibroblast CCL39 and human colon carcinoma LS174, incubated in normoxia (21% O2) versus hypoxia (1% O2). We hypothesized that hypoxia is a signal that prepares cells to synthesize and store glycogen in order to survive1.

Biochemical Titration of Glycogen In vitro

We describe here an accurate, reproducible and convenient biochemical method for titration of glycogen in vitro. This technique uses the Abcam Glycogen assay kit and is based on successive hydrolysis of glycogen to glucose and glucose titration by fluorescence.

글리코겐의 생화학 적정<em&gt; 체외</em

Glycogen is the main energetic polymer of glucose in vertebrate animals and plays a crucial role in whole body metabolism as well as in cellular ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

저산소증에 따라 단일 세포 수준에서 글로벌 RNA의 합성 분석

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

생리 산소 조건에 노출 된 인간 세포의 캡 결합 단백질의 분석

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포유류의 미토콘드리아 기능을 측정하기 위한 산소 비의존적 분석

포유류의 미토콘드리아 기능을 측정하기 위한 산소 비의존적 분석

포유류의 미토콘드리아 기능을 측정하기 위한 산소 비의존적 분석

사포닌 - permeabilized 심장 섬유에 Respirometric 산화 인산화 평가

교란 성 포유류 심장의 경부 흡광도 분광학을 사용하여 세포 대사를 모니터링하기위한 심장 내 측 발사 라이트 카테터

글리코겐의 생화학 적정

저산소증에 따라 단일 세포 수준에서 글로벌 RNA의 합성 분석