This work was supported by the Natural Sciences and Engineering Council of Canada and the Ontario Ministry of Research and Innovation.

1. Preparativi per colture cellulari <ol><li> Acquisto commercialmente disponibili scorte di cellule umane. NOTA: Questo protocollo utilizza il carcinoma del colon-retto HCT116 e renali cellule primarie umane prossimali tubulari epiteliali (HRPTEC). </li><li> Fare 500 ml di mezzo per la cultura di HCT116: Modified Eagle Medium di Dulbecco (DMEM) / medio alta di glucosio integrato con 7,5% siero fetale bovino (FBS) e 1% penicillina / streptomicina (P / S). </li><li> Fare 500 ml di mezzo per la cultura di HRPTEC: media delle cellule epiteliali integrato con il 5% FBS, 1% supplemento di crescita delle cellule epiteliali, e l&#39;1% P / S. </li><li> Preparare 500 ml di 1x tampone fosfato salino (PBS): 140 mm NaCl, 3 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4, 15 mm KH 2 PO 4. Regolare il pH a 7,4 e sterilizzare in autoclave per 40 minuti a 121 ° C. </li></ol> 2. Apertura di Cell Coltura <ol><li> Con attenzione aspirare il medium da un piatto confluenti 80-90% senza disturbare tegli cellule. </li><li> Aliquota 3-5 ml di PBS 1x per piatto cultura, rock delicatamente ogni pallone per rivestire la superficie del piatto, e con attenzione aspirare il PBS 1x. Ripetere l&#39;operazione per un secondo lavaggio 1x PBS. </li><li> Aliquota 3 ml di acido tripsina-etilendiamminotetraacetico 0,05% (EDTA) in ogni piatto cultura e delicatamente in modo uniforme di roccia per rivestire le cellule con tripsina-EDTA. Incubare a 37 ° C per 2-3 minuti. </li><li> Trasferire le cellule staccate in una provetta da centrifuga da 15 ml e centrifugare a 4000 xg per 90 sec. </li><li> Risospendere il pellet cellulare in 1 ml di DMEM completo. </li><li> Contare le cellule utilizzando un emocitometro. Calcolare quanti apirogene e polistirolo 100 millimetri cella cultura piatti sono necessari per raggiungere una densità di semina iniziale di circa 2.500-5.000 cellule per cm 2. </li><li> terreno completo Pre-caldo coltura cellulare made in passi 1.2 o 1.3 in un bagno d&#39;acqua C 37 ° C per 30-45 minuti. </li><li> Decontaminare la bottiglia medio e fiala cella con il 70% di etanolo. Da questo punto in avanti tuttile operazioni devono essere eseguite in modo asettico. </li><li> Aliquotare 6 ml di DMEM completo in altrettante piatti di coltura cellulare 100 mm richiesti per utilizzare l&#39;intero volume di cellule congelate nella densità di semina di cui al punto 2.6. </li><li> Trasferire il volume di sospensione cellulare calcolata al punto 2.6 a ciascuno dei piatti 100 coltura mm. Oscillare ciascuna piastra manualmente per distribuire uniformemente le cellule sulla superficie della piastra. </li><li> Posizionare la testa di serie 100 millimetri piatto di coltura cellulare in incubatore a 37 ° C in atmosfera di CO 2 5%. Consentono alle cellule di incubare, almeno 24 ore prima che i passi successivi. </li></ol> 3. Trapianto <ol><li> Mostra ogni piatto di coltura cellulare al microscopio per determinare la percentuale di confluenza cellule (cellule% coprono l&#39;area del piatto). le cellule per l&#39;incubatore e pre-caldo terreno completo e PBS 1x Return. Procedere al passaggio successivo, se le cellule sono 80-100% confluenti. </li><li> aspirare accuratamente la media trascorsa senza disturbare ilcellule in ogni piatto cultura. </li><li> Aliquota 3-5 ml di PBS 1x per piatto cultura, rock delicatamente ogni pallone per rivestire la superficie del piatto, e con attenzione aspirare il PBS 1x. Ripetere l&#39;operazione per un secondo lavaggio 1x PBS. </li><li> Aliquota 3 ml di 0,05% tripsina-EDTA in ogni piatto cultura e agitare delicatamente per rivestire in modo uniforme le cellule con tripsina-EDTA. Incubare a 37 ° C per 2-3 minuti. </li><li> Durante questa incubazione, un&#39;aliquota di 10 ml di terreno completo in altrettanti piatti della cultura sono necessari per ottenere la densità cellulare di 2.500-5.000 cellule per cm 2. </li><li> Quando le cellule hanno staccata dalla piastra, aggiungere rapidamente 3 ml di inibitore della tripsina 1x definito e miscelare delicatamente il piatto per 1 min per garantire che tutte le tripsina-EDTA è stato neutralizzato. </li><li> Trasferire le cellule staccate in una sterile 15 ml provetta e mettere da parte. Aggiungere 3 ml di PBS 1X per il piatto per raccogliere tutte le cellule rimanenti e il trasferimento che per lo stesso 15 ml provetta. </li><li> Agglomerare le cellule per centrifugazione a 150 xgper 5 min. </li><li> Aspirare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 3 ml di mezzo completo. </li><li> Contare le cellule utilizzando un emocitometro e seminare 150 mm piastre di coltura contenente 15 ml di terreno completo per ottenere una densità cellulare di 2.500-5.000 cellule per cm 2. Utilizzare due di 150 mm per ogni test cap-binding. NOTA: diffusione di ossigeno alle cellule tramite mezzo liquido dipende dal volume di 36. Si raccomanda di mantenere il volume dei mezzi coerenti tra esperimenti se le cellule aderenti o cellule in sospensione sono utilizzati. I supporti possono essere pre-condizionati (incubate nella postazione di lavoro per 24 ore, come discusso in discussione) per evitare questi variabilità in diffusione. </li><li> Porre le capsule testa di serie-cultura nel termostato a 37 ° C in atmosfera di CO 2 5%. Consentono alle cellule di incubare, almeno 24 ore prima di procedere alle fasi successive. </li></ol> 4. L&#39;esposizione Physioxic <ol><li> Visualizza le cellule sotto il microscopio. per besrisultati t, in modo che le cellule sono 70-80% confluenti per una esposizione di 24 ore, il 50-60% confluenti per un&#39;esposizione 48 ore, e il 40-50% confluenti per un&#39;esposizione 72 ore. </li><li> Posizionare le cellule in una workstation ipossia per il tempo desiderato (24, 48, o 72 ore a seconda dell&#39;esperimento). </li><li> Impostare la workstation per la physioxia appropriata. NOTA: Ad esempio, un&#39;impostazione 3% O 2 sarebbe accompagnata da 5% di CO 2 e il 92% N 2. NOTA: Se le fluttuazioni di ossigeno all&#39;interno di una gamma dinamica si desiderano su una linea temporale specifico, il programma il programma nello strumento o regolare manualmente le impostazioni di ossigeno agli intervalli desiderati. </li><li> Impostare l&#39;umidità al 60%. L&#39;atmosfera workstation è molto secca comunque, e dei media sarà notevolmente evapora durante lunghi esperimenti (&gt; 48 ore). Mantenere una riserva media in un pallone di coltura di cellule all&#39;interno della stazione di lavoro (in modo che il supporto viene equilibrato con l&#39;ambiente workstation) per ricostituire i mezzi di comunicazione nel DIS coltura cellularelui è. NOTA: Ogni soluzione che interagirà con le cellule prima di lisi (come PBS e tripsina-EDTA) deve essere pre-condizionato per 24 ore prima dell&#39;uso nella workstation ipossia in modo che l&#39;ossigeno disciolto equilibra con l&#39;ossigeno atmosferico 36. </li><li> Mantenere le cellule all&#39;interno della stazione di lavoro fino lisi. </li></ol> 5. Buffer Preparazione per il saggio Cap-binding <ol><li> Preparare 1x Tris-Buffered Saline (TBS). <ol><li> In 800 ml di dH 2 O, sciogliere 8,76 g di NaCl e 6,05 g Tris Base. </li><li> Portare la soluzione ad un pH finale di 7,4 usando 1 M HCl. </li><li> Portare il volume finale di 1 L con dH 2 O. </li></ol></li><li> Preparare tampone di lisi non denaturazione. Preparare Lysis Buffer il giorno del test tappo vincolante. Fare tampone di lisi in più per lavare le perline agarosio vuote e la γ-amminofenil-m 7 GTP agarosio perline C10-linked (passi 7.9 e 7.13). <ol><li> In 7 ml di dH 2 O, aggiungere 160 ml 5 M NaCl, 160 microlitri 1 M Tris-HCl pH 7,4, 40 microlitri 200 mM NaF, 40 microlitri 1 M MgCl 2 e 40 microlitri 1 mM sodio orthovanadate. </li><li> Aggiungere 40 ml di Igepal alla soluzione 7 ml. Tagliare la punta della pipetta per aiutare recuperare Igepal in quanto è estremamente viscoso. </li><li> Mescolare pipettando su e giù, o vortice, la soluzione 7 ml finché tutti i Igepal è stato dissolto. </li><li> Aumentare il volume finale della soluzione a 8 ml e tenere in ghiaccio. </li></ol></li><li> Preparare 4x dodecil solfato di sodio (SDS) -page Sample Buffer. <ol><li> In un becher, unire 16 ml 1 M Tris-HCl pH 6,8, 12,64 ml di glicerolo, e 8 ml ditiotreitolo (DTT). </li><li> Aggiungere 3,2 g di SDS e 0,16 g di blu di bromofenolo. Lasciare in polvere per sciogliere completamente mescolando con un bastoncino magnetico. </li><li> Aliquota in provette da 1,5 ml microcentrifuga e conservare a -20 ° C. </li></ol></li></ol> 6. cellulare Lysis <ol><li> Preparare non denaturazione-tampone di lisi e tenere in ghiaccio il giorno di The cap-binding assay. </li><li> Pre-calda 1x PBS e tripsina in un bagno d&#39;acqua a 37 ° C per 30 min. </li><li> Aliquota 980 ml di tampone di lisi in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga per ogni test cap-binding in corso di esecuzione. </li><li> Aggiungere 10 ml di 4- (2-amminoetil) benzensolfonile fluoruro cloridrato e 10 ml di 100x cocktail di inibitori delle proteasi ai 980 ml di tampone di lisi. Tenere in ghiaccio. </li><li> Eliminare il supporto da ogni piatto 150 millimetri in un contenitore di rifiuti all&#39;interno della stazione di lavoro ipossia. </li><li> Lavare le cellule con 3-4 ml di caldo 1x PBS e scartare tutto il liquido. </li><li> Aggiungere 1 ml di caldo 0,05% tripsina-EDTA per ogni piatto e lasciate riposare per 2 minuti o fino a quando le cellule non sono rispettate piastra. </li><li> Usando una pipetta, trasferire le cellule di una piastra in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga. Ripetere se necessario in modo che ciascuna piastra di cellule viene trasferito in un 1,5 ml provetta separata. </li><li> Centrifugare le provette da 1,5 ml microcentrifuga a 6.000 g per 90 sec to agglomerare le cellule. </li><li> Aspirare il tripsina con una pipetta senza disturbare il pellet. Se il pellet è disturbato, ri-centrifugare la provetta da 1,5 ml a 6.000 g per 90 sec. </li><li> Lavare le cellule con caldo PBS 1x pipettando gentilmente 200 ml di PBS nella provetta appena sopra il pellet. Re-centrifuga se il pellet è disturbato. </li><li> Aspirare il PBS senza disturbare il pellet. </li><li> Pipettare 500 microlitri dalle 1 ml preparati soluzione tampone di lisi sul primo pellet cellulare. Risospendere il pellet interamente pipettando su e giù. </li><li> Combinare le cellule risospese con il secondo pellet di cellule e risospendere il secondo pellet pipettando su e giù. Ripetere questo processo fino a quando tutti i pellet sono stati combinati e risospese per ogni campione. </li><li> Combinare il lisato con i restanti 500 ml di tampone di lisi in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga. </li><li> Rimuovere campioni dalla workstation ipossia. NOTA: Dopo aver aggiunto tampone di lisi, unall fasi successive devono essere eseguite in aria ambiente come workstation ipossia è impostato a 37 ° C e le seguenti operazioni devono essere eseguite a freddo (4 ° C o su ghiaccio). </li><li> Lisare le cellule utilizzando blanda agitazione ruotando i campioni a 4 ° C per 1,5-2 ore. </li><li> Centrifugare le cellule lisate a 12.000 xg per 15 min a 4 ° C per rimuovere i detriti cellulari. </li><li> Trasferire il lisato in una nuova provetta da 1,5 ml e scartare il pellet. </li><li> Prenotare una porzione (5-10%) del surnatante da utilizzare nel suo complesso controllo di input lisato cellulare per future analisi western blot. </li></ol> 7. Assay Cap-binding <ol><li> Per ogni campione, trasferire 50 ml di vuoto agarosio liquami controllo tallone e 50 ml di liquame tallone γ-amminofenil-m 7 GTP agarosio C10-linked per separare 1,5 ml microprovette. Utilizzare forbici per rimuovere la punta della pipetta per facilitare la raccolta della poltiglia tallone. </li><li> Agglomerare le perline by centrifugazione della poltiglia a 500 xg per 30 sec. </li><li> Rimuovere il surnatante con attenzione e risospendere le sfere in 500 ml di TBS. </li><li> Ripetere i punti 7.2 e 7.3. Agglomerare le perline a 500 xg per 30 sec e rimuovere il surnatante. </li><li> Trasferire il surnatante contenente il lisato dal punto 6.19 al tubo di 1,5 ml microcentrifuga contenente le perline agarosio vuote. NOTA: Le perle di agarosio bianco agiscono come una fase di pre-compensazione per rimuovere le proteine ​​dal lisato che interagiscono in modo non specifico con il tallone. </li><li> Incubare per 10 minuti a 4 ° C con agitazione. </li><li> Pellet le perline agarosio vuote per centrifugazione a 500 g per 30 sec. </li><li> Trasferire il lisato alla provetta da 1,5 ml microcentrifuga contenente le γ-amminofenil-m 7 GTP agarosio perline C10-linked. </li><li> Lavare le perline agarosio vuote da risospendere le sfere in 500 ml di tampone di lisi, pellet le perline per centrifugazione a 500 xg per 30 secondi, e scartando la Supernatant. Ripetere questa operazione quattro volte per un totale di cinque lavaggi. </li><li> Risospendere le sfere agarosio vuote nel tampone campione 1x SDS-PAGE, e far bollire le perline per 90 secondi a 95 ° C. Conservare a -20 ° C per una futura analisi western blot per osservare se la proteina di interesse si lega in modo non specifico per il tallone. </li><li> Incubare il lisato con le perline γ-amminofenil-m 7 GTP agarosio C10-collegate con agitazione per 1 ora a 4 ° C per catturare le proteine di legame della cap. </li><li> Agglomerare le γ-amminofenil-m 7 GTP agarosio perline C10-linked per centrifugazione a 500 g per 30 sec. Eliminare il surnatante. </li><li> Lavare le γ-amminofenil-m 7 GTP agarosio perline C10-linked ripetendo il passaggio 7.9. </li><li> Risospendere le sfere in 600 microlitri di tampone di lisi. </li><li> Aggiungere GTP ad una concentrazione finale di 1 mM. </li><li> Incubare le γ-amminofenil-m 7 GTP agarosio perline C10-linked + 1 mM GTP con agitazione per 1 ora a 4 ° C. Nota: Questosarà dissociarsi proteine che interagiscono in modo non specifico con m 7 GTP (vale a dire, di interagire anche con GTP non metilato). </li><li> Agglomerare le γ-amminofenil-m 7 GTP agarosio perline C10-linked per centrifugazione a 500 g per 30 sec. </li><li> Trasferire il surnatante in una nuova provetta da 1,5 ml microcentrifuga e aggiungere 200 ml di 4x tampone campione SDS-PAGE (50 mM Tris-HCl, 100 mM DTT, 2% SDS, 0,1% blu di bromofenolo e 10% glicerolo). Conservare il campione di controllo GTP a -20 ° C per una futura analisi Western Blot 37. Lavare le perline ripetendo il passaggio 7.9. </li><li> Risospendere le sfere in 1x tampone campione SDS-PAGE (50 mM Tris-HCl, 100 mM DTT, 2% SDS, 0,1% blu di bromofenolo e 10% glicerolo) e ebollizione a 95 ° C per 90 sec. Conservare il m frazione 7 GTP-bound a -20 ° C per una futura analisi Western Blot 37. </li></ol>

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E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ISG15+modification+of+the+eIF4E+cognate+4EHP+enhances+cap+structure-binding+activity+of+4EHP.">ISG15 modification of the eIF4E cognate 4EHP enhances cap structure-binding activity of 4EHP.</a> Genes Dev. 21 (3), 255-260 (2007).</li><li>Kedersha, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+that+ternary+complex+(eIF2-GTP-tRNA(i)(Met))-deficient+preinitiation+complexes+are+core+constituents+of+mammalian+stress+granules.">Evidence that ternary complex (eIF2-GTP-tRNA(i)(Met))-deficient preinitiation complexes are core constituents of mammalian stress granules.</a> Mol Biol Cell. 13 (1), 195-210 (2002).</li><li>Gu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+the+structure,+mechanism,+and+regulation+of+scavenger+mRNA+decapping+activity.">Insights into the structure, mechanism, and regulation of scavenger mRNA decapping activity.</a> Mol Cell. 14 (1), 67-80 (2004).</li><li>Szczepaniak, S. A., Zuberek, J., Darzynkiewicz, E., Kufel, J., Jemielity, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affinity+resins+containing+enzymatically+resistant+mRNA+cap+analogs--a+new+tool+for+the+analysis+of+cap-binding+proteins.">Affinity resins containing enzymatically resistant mRNA cap analogs--a new tool for the analysis of cap-binding proteins.</a> RNA. 18 (7), 1421-1432 (2012).</li><li>Joshi, B., Cameron, A., Jagus, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+mammalian+eIF4E-family+members.">Characterization of mammalian eIF4E-family members.</a> Eur J Biochem. 271 (11), 2189-2203 (2004).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

L&#39;analisi delle proteine ​​di legame della cap in cellule umane esposte a condizioni di ossigeno fisiologiche può consentire l&#39;identificazione di nuovi fattori di inizio della traduzione di ossigeno-regolamentato. L&#39;affinità di questi fattori per tappo di mRNA o di altre proteine cap-associate al 5 &#39;può essere misurata con la forza della loro associazione di m 7 GTP-linked perline agarosio. Un avvertimento di questa tecnica è che misura il potenziale cap-legame delle proteine ​​pos...

Il controllo traslazionale sta emergendo come un passo altrettanto importante regolazione trascrizionale dell&#39;espressione genica, in particolare durante i periodi di stress cellulare 1. Un punto focale di controllo traduzione è al fattore limitante di iniziazione dove le prime fasi della sintesi proteica coinvolgono il legame della eucariotica fattore di iniziazione 4E (eIF4E) al 7-methylguanosine (m 7 GTP) 5 &#39;tappo di mRNA 2 . eIF4E è parte di un complesso di nome trimeric eIF4F che include eIF4A, una elicasi RNA, e eIF4G, una proteina impalcatura necessaria per l&#39;assunzione di altri fattori di traduzione e le 40S del ribosoma 3. In condizioni fisiologiche normali, la stragrande maggioranza degli mRNA vengono tradotti attraverso un meccanismo di cap-dipendente, ma sotto i periodi di stress cellulare circa il 10% di mRNA umani contiene 5 &#39;UTR che potrebbero consentire di traduzione cap-indipendente rito di iniziazione 1,4. traduzione Cap-dipendente è stata storicamente sinonimounità organizzative con eIF4F, tuttavia, le variazioni specifiche di stress di eIF4F sono diventati un argomento di tendenza 5-8. Vari stress cellulari causano attività eIF4E da reprimere attraverso la mammalian target of complesso rapamicina 1 (mTORC1). Questa chinasi diventa compromessa sotto stress, che provoca l&#39;aumento di attività di uno dei suoi obiettivi, la proteina 4E-binding (4E-BP). Non fosforilata 4E-BP si lega ad eIF4E e blocca la sua capacità di interagire con eIF4G causando la repressione della traduzione cap-dipendente 9,10. È interessante notare che, un omologo di eIF4E chiamato eIF4E2 (o 4EHP) ha un&#39;affinità molto più basso per 4E-BP 11, forse permettendogli di eludere la repressione dello stress-mediata. Infatti, inizialmente caratterizzato come un repressore della traduzione a causa della sua mancanza di interazione con eIF4G 12, eIF4E2 avvia la traduzione di centinaia di mRNA che contengono RNA elementi di risposta all&#39;ipossia nella loro 3 &#39;UTR durante lo stress ipossico 6,13. Questo mi attivaziones raggiunto attraverso le interazioni con eIF4G3, RNA-binding protein 4 motivo, e il fattore inducibile dall&#39;ipossia (HIF) 2α a costituire un complesso eIF4F ipossica, o eIF4F H 6,13. Come un repressore in condizioni normali, eIF4E2 si lega con GIGYF2 e ZNF598 14. Questi complessi sono stati, in parte, identificati attraverso Agarose-linked m 7 resine GTP affinità. Questo metodo classico 15 è standard nel campo della traduzione ed è i saggi migliore e più tecnica comunemente usata per isolare complessi cap-binding in pull down e in vitro di legame 16-19. Come le macchine di traduzione cap-dipendente sta emergendo come flessibile ed adattabile con le parti tra loro cambiare 6-8,13, questo metodo è un potente strumento per individuare rapidamente nuove proteine di legame della cap coinvolti nella risposta allo stress. Inoltre, le variazioni di eIF4F potrebbe avere vaste implicazioni come diversi sistemi modello eucarioti sembrano utilizzare un omologo eIF4E2 per le risposte di stress talicome A. thaliana 20, S. pombe 21, D. melanogaster 22, e C. elegans 23. L&#39;evidenza suggerisce che le variazioni di eIF4F non possono essere strettamente limitato a condizioni di stress, ma essere coinvolti nella fisiologia normale 24. La fornitura di ossigeno ai tessuti (alle estremità capillari) o all&#39;interno dei tessuti (misurata tramite microelettrodi) varia dal 2-6% nel cervello 25, 3-12% nei polmoni 26, 3.5-6% nell&#39;intestino 27, 4% in il fegato 28, 7-12% nel rene 29, 4% nel muscolo 30, e 6-7% nel midollo osseo 31. Le cellule e mitocondri contengono meno del 1,3% di ossigeno 32. Questi valori sono molto più vicini a ipossia che l&#39;aria ambiente in cui le cellule sono normalmente coltivate. Questo suggerisce che ciò che è stato precedentemente pensato come processi cellulari specifici per ipossia possono essere rilevanti in un ambiente fisiologico. È interessante notare che, eIF4F e eIF4F H </sup&gt; partecipare attivamente al inizio della traduzione di piscine distinte o classi di mRNA in diverse linee cellulari umane differenti esposti all&#39;ossigeno fisiologica o &quot;physioxia&quot; 24. Low ossigeno spinge anche il corretto sviluppo del feto 33 e le cellule hanno generalmente più alti tassi di proliferazione, durata della vita più lunga, meno danni al DNA e meno risposte allo stress generale in physioxia 34. Pertanto, eIF4F H è probabilmente un fattore chiave per l&#39;espressione dei geni selezionati in condizioni fisiologiche. Qui, forniamo un protocollo per le cellule di coltura in condizioni di ossigeno fisiologiche fissi o in un intervallo di fluttuazione dinamica che rischia più rappresentativa di microambienti tissutali. Un vantaggio di questo metodo è che le cellule sono lisate nella workstation ipossia. E spesso non è chiaro come la transizione dalla coltura cellulare ipossica a lisi cellulare avviene in altri protocolli. Le cellule vengono spesso rimossi prima da un piccolo incubatore ipossia esserefore lisi, ma questa esposizione all&#39;ossigeno potrebbe influenzare percorsi biochimici come risposta cellulare a ossigeno è rapida (uno o due min) 35. Alcune proteine di legame della cap richiedono interazioni con una seconda base o possono idrolizzare il GTP m 7, quindi alcuni interattori capitalizzazione possono perdere nel processo di purificazione. Agarosio-linked per analoghi cap enzimaticamente resistenti può essere sostituito in questo protocollo. Esplorare l&#39;attività e la composizione di eIF4F H e altre varianti del eIF4F attraverso il metodo descritto qui farà luce sui complessi macchinari di espressione genica che le cellule utilizzano in condizioni fisiologiche o risposte allo stress.

<table><tbody><tr><td>&amp;gamma;-aminophenyl-m&lt;sup&gt;7&lt;/sup&gt;GTP agarose C&lt;sub&gt;10&lt;/sub&gt;-linked beads</td><td>Jena Bioscience</td><td>AC-1555</td><td>Agarose-linked m&lt;sup&gt;7&lt;/sup&gt;GTP</td></tr><tr><td>100 mm culture dish</td><td>Corning</td><td>877222</td><td>10-cm culture dish</td></tr><tr><td>150 mm culture dish</td><td>Thermofisher</td><td>130183</td><td>15 cm culture dish</td></tr><tr><td>AEBSF Hydrochloride</td><td>ACROS Organics</td><td>A0356829</td><td>AEBSF</td></tr><tr><td>Agarose Beads</td><td>Jena Bioscience&amp;nbsp;</td><td>AC-0015</td><td>Agarose bead control</td></tr><tr><td>Bromophenol Blue</td><td>Fisher</td><td>BP112-25</td><td>Component of SDS-PAGE loading buffer</td></tr><tr><td>1.5 ml Centrifuge Tubes</td><td>FroggaBio</td><td>1210-00S</td><td>Used to centrifuge small volumes</td></tr><tr><td>15 ml Conical Centrifuge Tubes</td><td>Fisher</td><td>1495970C</td><td>Used in culturing primary cells</td></tr><tr><td>Defined trypsin inhibitor</td><td>Fisher</td><td>R007100</td><td>DTI</td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Fisher</td><td>BP172-25</td><td>DTT</td></tr><tr><td>Epithelial cell medium (complete kit)</td><td>ScienCell</td><td>4101</td><td>Includes serum and growth factor supplements)</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Fisher</td><td>BP229-1</td><td>Component of SDS-PAGE loading buffer</td></tr><tr><td>100 mM Guanosine 5&#039;-triphosphate, 1 ml</td><td>Jena Bioscience</td><td>272076-0251M</td><td>GTP</td></tr><tr><td>HCT116 colorectal carcinoma</td><td>ATCC</td><td>CCL-247</td><td>Human cancer cell line</td></tr><tr><td>Human renal proximal tubular epithelial cells</td><td>ATCC</td><td>PCS-400-010</td><td>HRPTEC</td></tr><tr><td>Hyclone DMEM/High Glucose</td><td>GE Life Sciences</td><td>SH30022.01</td><td>Standard media for human cell culture</td></tr><tr><td>Hyclone Penicillin-Streptomycin solution</td><td>GE Life Sciences</td><td>SV30010</td><td>Antibiotic component of DMEM</td></tr><tr><td>H35 HypOxystation</td><td>Hypoxygen</td><td>N/A</td><td>Hypoxia workstation</td></tr><tr><td>Igepal CA-630</td><td>MP Biomedicals</td><td>2198596</td><td>Detergent component of lysis buffer</td></tr><tr><td>Monopotassium phosphate</td><td>Fisher</td><td>P288-500</td><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>Fisher</td><td>P217-500</td><td>KCl</td></tr><tr><td>Magnesium chloride</td><td>Fisher</td><td>M33-500</td><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Fisher</td><td>BP358-10</td><td>NaCl</td></tr><tr><td>Sodium fluoride</td><td>Fisher</td><td>5299-100</td><td>NaF (phosphatase inhibitor component of lysis buffer)</td></tr><tr><td>Disodium phosphate</td><td>Fisher</td><td>5369-500</td><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>Premium Grade Fetal Bovine Serum</td><td>Seradigm</td><td>1500-500</td><td>FBS</td></tr><tr><td>Protease Inhibitor Cocktail (100x)</td><td>Cell Signalling</td><td>58715</td><td>Component of lysis buffer</td></tr><tr><td>Sodium Dodecyl Sulfate</td><td>Fisher</td><td>BP166-100</td><td>SDS</td></tr><tr><td>Sodium Orthovanadate</td><td>Sigma</td><td>56508</td><td>Na&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;VO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Fisher</td><td>BP152-5</td><td>Component of buffers</td></tr><tr><td>0.05% Trypsin-EDTA (1x)</td><td>Life Technologies</td><td>2500-067</td><td>Trypsin used to detach adherent cells</td></tr></tbody></table>

analysis of cap-binding proteins in human cells exposed to physiological oxygen conditions

Translational control is a focal point of gene regulation, especially during periods of cellular stress. Cap-dependent translation via the eIF4F complex is by far the most common pathway to initiate protein synthesis in eukaryotic cells, but stress-specific variations of this complex are now emerging. Purifying cap-binding proteins with an affinity resin composed of Agarose-linked m7GTP (a 5' mRNA cap analog) is a useful tool to identify factors involved in the regulation of translation initiation. Hypoxia (low oxygen) is a cellular stress encountered during fetal development and tumor progression, and is highly dependent on translation regulation. Furthermore, it was recently reported that human adult organs have a lower oxygen content (physioxia 1-9% oxygen) that is closer to hypoxia than the ambient air where cells are routinely cultured. With the ongoing characterization of a hypoxic eIF4F complex (eIF4FH), there is increasing interest in understanding oxygen-dependent translation initiation through the 5' mRNA cap. We have recently developed a human cell culture method to analyze cap-binding proteins that are regulated by oxygen availability. This protocol emphasizes that cell culture and lysis be performed in a hypoxia workstation to eliminate exposure to oxygen. Cells must be incubated for at least 24 hr for the liquid media to equilibrate with the atmosphere within the workstation. To avoid this limitation, pre-conditioned media (de-oxygenated) can be added to cells if shorter time points are required. Certain cap-binding proteins require interactions with a second base or can hydrolyze the m7GTP, therefore some cap interactors may be missed in the purification process. Agarose-linked to enzymatically resistant cap analogs may be substituted in this protocol. This method allows the user to identify novel oxygen-regulated translation factors involved in cap-dependent translation.

Analisi di Capacità Cap-binding in risposta ad ossigeno di eIF4E e eIF4E2 in un m 7 GTP Affinity Colonna Le figure 1 e 2 rappresentano le macchie occidentali del tipico m 7 GTP affinità purificazione delle due principali proteine di legame della cap in risposta alle fluttuazioni di ossigeno in due linee cellulari umane: umane renale prossimale cellule primarie tubulari epi...

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Analysis of Cap-binding Proteins in Human Cells Exposed to Physiological Oxygen Conditions

Here, we present human cell culture protocols to analyze translation initiation factors that bind the 5' cap of mRNA during physiological oxygen conditions. This method utilizes an Agarose-linked m7GTP cap analog and is suitable to investigate cap-binding factors and their interacting partners.

Analisi delle proteine ​​di legame della cap in cellule umane esposte a condizioni fisiologiche di ossigeno

Translational control is a focal point of gene regulation, especially during periods of cellular stress. Cap-dependent translation via the eIF4F complex ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Genetics

7.7K Views.  University of Guelph. Here, we present human cell culture protocols to analyze translation initiation factors that bind the 5' cap of mRNA during physiological oxygen conditions. This method utilizes an Agarose-linked m7GTP cap analog and is suitable to investigate cap-binding factors and their interacting partners.

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Measuring mRNA Levels Over Time During the Yeast S. cerevisiae Hypoxic Response

Complex changes in gene expression typically mediate a large portion of a cellular response. Each gene may change expression with unique kinetics as the gene is regulated by the particular timing of one of many stimuli, signaling pathways or secondary effects. In order to capture the entire gene expression response to hypoxia in the yeast S. cerevisiae, RNA-seq analysis was used to monitor the mRNA levels of all genes at specific times after exposure to hypoxia. Hypoxia was established by growing cells in ~100% N2 gas. Importantly, unlike other hypoxic studies, ergosterol and unsaturated fatty acids were not added to the media because these metabolites affect gene expression. Time points were chosen in the range of 0 - 4 h after hypoxia because that period captures the major changes in gene expression. At each time point, mid-log hypoxic cells were quickly filtered and frozen, limiting exposure to O2 and concomitant changes in gene expression. Total RNA was extracted from cells and used to enrich for mRNA, which was then converted to cDNA. From this cDNA, multiplex libraries were created and eight or more samples were sequenced in one lane of a next-generation sequencer. A post-sequencing pipeline is described, which includes quality base trimming, read mapping and determining the number of reads per gene. DESeq2 within the R statistical environment was used to identify genes that change significantly at any one of the hypoxic time points. Analysis of three biological replicates revealed high reproducibility, genes of differing kinetics and a large number of expected O2-regulated genes. These methods can be used to study how the cells of various organisms respond to hypoxia over time and adapted to study gene expression during other cellular responses.

Measuring mRNA Levels Over Time During the Yeast S. cerevisiae Hypoxic Response

Here, we present a protocol using RNA-seq to monitor mRNA levels over time during the hypoxic response of S. cerevisiae cells. This method can be adapted to analyze gene expression during any cellular response.

Misurazione dei livelli di mRNA nel tempo durante la risposta Hypoxic lievito s. cerevisiae

Complex changes in gene expression typically mediate a large portion of a cellular response. Each gene may change expression with unique kinetics as the ...

Ricerca

Genetica

Tracking Hypoxic Signaling within Encapsulated Cell Aggregates

In Diabetes mellitus type 1, autoimmune destruction of the pancreatic &beta;-cells results in loss of insulin production and potentially lethal hyperglycemia. As an alternative treatment option to exogenous insulin injection, transplantation of functional pancreatic tissue has been explored1,2. This approach offers the promise of a more natural, long-term restoration of normoglycemia. Protection of the donor tissue from the host's immune system is required to prevent rejection and encapsulation is a method used to help achieve this aim.
Biologically-derived materials, such as alginate3 and agarose4, have been the traditional choice for capsule construction but may induce inflammation or fibrotic overgrowth5 which can impede nutrient and oxygen transport. Alternatively, synthetic poly(ethylene glycol) (PEG)-based hydrogels are non-degrading, easily functionalized, available at high purity, have controllable pore size, and are extremely biocompatible,6,7,8. As an additional benefit, PEG hydrogels may be formed rapidly in a simple photo-crosslinking reaction that does not require application of non-physiological temperatures6,7. Such a procedure is described here. In the crosslinking reaction, UV degradation of the photoinitiator, 1-[4-(2-Hydroxyethoxy)-phenyl]-2-hydroxy-2-methyl-1-propane-1-one (Irgacure 2959), produces free radicals which attack the vinyl carbon-carbon double bonds of dimethacrylated PEG (PEGDM) inducing crosslinking at the chain ends. Crosslinking can be achieved within 10 minutes. PEG hydrogels constructed in such a manner have been shown to favorably support cells7,9, and the low photoinitiator concentration and brief exposure to UV irradiation is not detrimental to viability and function of the encapsulated tissue10. While we methacrylate our PEG with the method described below, PEGDM can also be directly purchased from vendors such as Sigma.
An inherent consequence of encapsulation is isolation of the cells from a vascular network. Supply of nutrients, notably oxygen, is therefore reduced and limited by diffusion. This reduced oxygen availability may especially impact &beta;-cells whose insulin secretory function is highly dependent on oxygen11-13. Capsule composition and geometry will also impact diffusion rates and lengths for oxygen. Therefore, we also describe a technique for identifying hypoxic cells within our PEG capsules. Infection of the cells with a recombinant adenovirus allows for a fluorescent signal to be produced when intracellular hypoxia-inducible factor (HIF) pathways are activated14. As HIFs are the primary regulators of the transcriptional response to hypoxia, they represent an ideal target marker for detection of hypoxic signaling15. This approach allows for easy and rapid detection of hypoxic cells. Briefly, the adenovirus has the sequence for a red fluorescent protein (Ds Red DR from Clontech) under the control of a hypoxia-responsive element (HRE) trimer. Stabilization of HIF-1 by low oxygen conditions will drive transcription of the fluorescent protein (Figure 1). Additional details on the construction of this virus have been published previously15. The virus is stored in 10% glycerol at -80&deg; C as many 150 &mu;L aliquots in 1.5 mL centrifuge tubes at a concentration of 3.4 x 1010 pfu/mL. 
Previous studies in our lab have shown that MIN6 cells encapsulated as aggregates maintain their viability throughout 4 weeks of culture in 20% oxygen. MIN6 aggregates cultured at 2 or 1% oxygen showed both signs of necrotic cells (still about 85-90% viable) by staining with ethidium bromide as well as morphological changes relative to cells in 20% oxygen. The smooth spherical shape of the aggregates displayed at 20% was lost and aggregates appeared more like disorganized groups of cells. While the low oxygen stress does not cause a pronounced drop in viability, it is clearly impacting MIN6 aggregation and function as measured by glucose-stimulated insulin secretion15. Western blot analysis of encapsulated cells in 20% and 1% oxygen also showed a significant increase in HIF-1&alpha; for cells cultured in the low oxygen conditions which correlates with the expression of the DsRed DR protein.

A method for photo-encapsulation of cells in a crosslinked PEG hydrogel is described. Hypoxic signaling within encapsulated murine insulinoma (MIN6) aggregates is tracked using a fluorescent marker system. This system allows serial examination of cells within a hydrogel scaffold and correlation of hypoxic signaling with changes in cell phenotype.

Tracciamento di segnalazione all&#39;interno di aggregati di cellule ipossiche Encapsulated

In Diabetes mellitus type 1, autoimmune destruction of the pancreatic &beta;-cells results in loss of insulin production and potentially lethal ...

Bioingegneria

Proteomic Analysis of Human Macrophage Polarization Under a Low Oxygen Environment

Macrophages are innate immune cells involved in a number of physiological functions ranging from responses to infectious pathogens to tissue homeostasis. The various functions of these cells are related to their activation states, which is also called polarization. The precise molecular description of these various polarizations is a priority in the field of macrophage biology. It is currently acknowledged that a multidimensional approach is necessary to describe how polarization is controlled by environmental signals. In this report, we describe a protocol designed to obtain the proteomic signature of various polarizations in human macrophages. This protocol is based on a label-free quantification of macrophage protein expression obtained from in-gel fractionated and Lys C/trypsin-digested cellular lysis content. We also provide a protocol based on in-solution digestion and isoelectric focusing fractionation to use as an alternative. Because oxygen concentration is a relevant environmental parameter in tissues, we use this protocol to explore how atmospheric composition or a low oxygen environment affects the classification of macrophage polarization.

We present a protocol to obtain proteomic signatures of human macrophages and apply this to determination of the impact of a low oxygen environment on macrophage polarization.

Analisi proteomica di polarizzazione di macrofago umano in un ambiente a basso tenore di ossigeno

Macrophages are innate immune cells involved in a number of physiological functions ranging from responses to infectious pathogens to tissue homeostasis. ...

Biochimica

Tracciamento di isotopi stabili e analisi LC-MS per misurare le attività di DHODH e SDH

Oxygen-Independent Assays to Measure Mitochondrial Function in Mammals

The flow of electrons in the mitochondrial electron transport chain (ETC) supports multifaceted biosynthetic, bioenergetic, and signaling functions in mammalian cells. As oxygen (O2) is the most ubiquitous terminal electron acceptor for the mammalian ETC, the O2 consumption rate is frequently used as a proxy for mitochondrial function. However, emerging research demonstrates that this parameter is not always indicative of mitochondrial function, as fumarate can be employed as an alternative electron acceptor to sustain mitochondrial functions in hypoxia. This article compiles a series of protocols that allow researchers to measure mitochondrial function independently of the O2 consumption rate. These assays are particularly useful when studying mitochondrial function in hypoxic environments. Specifically, we describe methods to measure mitochondrial ATP production, de novo pyrimidine biosynthesis, NADH oxidation by complex I, and superoxide production. In combination with classical respirometry experiments, these orthogonal and economical assays will provide researchers with a more comprehensive assessment of mitochondrial function in their system of interest.

Autore in primo piano: Saggi indipendenti dall'ossigeno per misurare la funzione mitocondriale nei mammiferi  

Here, we present a compilation of assays to directly measure mitochondrial function in mammalian cells independently of their ability to consume molecular oxygen.

Saggi indipendenti dall'ossigeno per misurare la funzione mitocondriale nei mammiferi

The flow of electrons in the mitochondrial electron transport chain (ETC) supports multifaceted biosynthetic, bioenergetic, and signaling functions in ...

Respirometric Oxidative Phosphorylation Assessment in Saponin-permeabilized Cardiac Fibers

Investigation of mitochondrial function represents an important parameter of cardiac physiology as mitochondria are involved in energy metabolism, oxidative stress, apoptosis, aging, mitochondrial encephalomyopathies and drug toxicity. Given this, technologies to measure cardiac mitochondrial function are in demand. One technique that employs an integrative approach to measure mitochondrial function is respirometric oxidative phosphorylation (OXPHOS) analysis.
The principle of respirometric OXPHOS assessment is centered around measuring oxygen concentration utilizing a Clark electrode. As the permeabilized fiber bundle consumes oxygen, oxygen concentration in the closed chamber declines. Using selected substrate-inhibitor-uncoupler titration protocols, electrons are provided to specific sites of the electron transport chain, allowing evaluation of mitochondrial function. Prior to respirometric analysis of mitochondrial function, mechanical and chemical preparatory techniques are utilized to permeabilize the sarcolemma of muscle fibers. Chemical permeabilization employs saponin to selectively perforate the cell membrane while maintaining cellular architecture.
This paper thoroughly describes the steps involved in preparing saponin-skinned cardiac fibers for oxygen consumption measurements to evaluate mitochondrial OXPHOS. Additionally, troubleshooting advice as well as specific substrates, inhibitors and uncouplers that may be used to determine mitochondria function at specific sites of the electron transport chain are provided. Importantly, the described protocol may be easily applied to cardiac and skeletal tissue of various animal models and human samples.

Saponin-permeabilized fiber preparation in conjunction with respirometric oxidative phosphorylation analysis provides integrative assessment of mitochondrial function. Mitochondrial respiration in physiological and pathological states can reflect various regulatory influences including mitochondrial interactions, morphology and biochemistry.

Respirometriche valutazione fosforilazione ossidativa in fibre cardiache saponina permeabilizzate

Investigation of mitochondrial function represents an important parameter of cardiac physiology as mitochondria are involved in energy metabolism, ...

Biologia

Intra-cardiac Side-Firing Light Catheter for Monitoring Cellular Metabolism using Transmural Absorbance Spectroscopy of Perfused Mammalian Hearts

Absorbance spectroscopy of cardiac muscle provides non-destructive assessment of cytosolic and mitochondrial oxygenation via myoglobin and cytochrome absorbance respectively. In addition, numerous aspects of the mitochondrial metabolic status such as membrane potential and substrate entry can also be estimated. To perform cardiac wall transmission optical spectroscopy, a commercially available side-firing optical fiber catheter is placed in the left ventricle of the isolated perfused heart as a light source. Light passing through the heart wall is collected with an external optical fiber to perform optical spectroscopy of the heart in near real- time. The transmission approach avoids numerous surface scattering interference occurring in widely used reflection approaches. Changes in transmural absorbance spectra were deconvolved using a library of chromophore reference spectra, providing quantitative measures of all the known cardiac chromophores simultaneously. This spectral deconvolution approach eliminated intrinsic errors that may result from using common dual wavelength methods applied to overlapping absorbance spectra, as well as provided a quantitative evaluation of the goodness of fit. A custom program was designed for data acquisition and analysis, which permitted the investigator to monitor the metabolic state of the preparation during the experiment. These relatively simple additions to the standard heart perfusion system provide a unique insight into the metabolic state of the heart wall in addition to conventional measures of contraction, perfusion, and substrate/oxygen extraction.

Here we introduce a method for using an intra-ventricle optical catheter in perfused hearts to perform absorbance spectroscopy across the heart wall. The data obtained provides robust information on tissue oxygen tension as well as substrate utilization and membrane potential simultaneously with cardiac performance measures in this ubiquitous preparation.

Catetere leggero intra-cardiaco per il monitoraggio del metabolismo cellulare utilizzando la spettroscopia transmurale di riambente di cuori mammiferi perfusi

Absorbance spectroscopy of cardiac muscle provides non-destructive assessment of cytosolic and mitochondrial oxygenation via myoglobin and cytochrome ...

Biochemical Titration of Glycogen In vitro

Glycogen is the main energetic polymer of glucose in vertebrate animals and plays a crucial role in whole body metabolism as well as in cellular metabolism. Many methods to detect glycogen already exist but only a few are quantitative. We describe here a method using the Abcam Glycogen assay kit, which is based on specific degradation of glycogen to glucose by glucoamylase. Glucose is then specifically oxidized to a product that reacts with the OxiRed probe to produce fluorescence. Titration is accurate, sensitive and can be achieved on cell extracts or tissue sections. However, in contrast to other techniques, it does not give information about the distribution of glycogen in the cell. As an example of this technique, we describe here the titration of glycogen in two cell lines, Chinese hamster lung fibroblast CCL39 and human colon carcinoma LS174, incubated in normoxia (21% O2) versus hypoxia (1% O2). We hypothesized that hypoxia is a signal that prepares cells to synthesize and store glycogen in order to survive1.

Biochemical Titration of Glycogen In vitro

We describe here an accurate, reproducible and convenient biochemical method for titration of glycogen in vitro. This technique uses the Abcam Glycogen assay kit and is based on successive hydrolysis of glycogen to glucose and glucose titration by fluorescence.

Titolazione biochimica di glicogeno<em&gt; In vitro</em

Glycogen is the main energetic polymer of glucose in vertebrate animals and plays a crucial role in whole body metabolism as well as in cellular ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

Analisi globale di RNA Sintesi a livello di singola cellula seguente ipossia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

Analisi delle proteine di legame della cap in cellule umane esposte a condizioni fisiologiche di ossigeno

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Misurazione dei livelli di mRNA nel tempo durante la risposta Hypoxic lievito s. cerevisiae

Tracciamento di segnalazione all'interno di aggregati di cellule ipossiche Encapsulated

Analisi proteomica di polarizzazione di macrofago umano in un ambiente a basso tenore di ossigeno

Saggi indipendenti dall'ossigeno per misurare la funzione mitocondriale nei mammiferi

Saggi indipendenti dall'ossigeno per misurare la funzione mitocondriale nei mammiferi

Saggi indipendenti dall'ossigeno per misurare la funzione mitocondriale nei mammiferi

Respirometriche valutazione fosforilazione ossidativa in fibre cardiache saponina permeabilizzate

Catetere leggero intra-cardiaco per il monitoraggio del metabolismo cellulare utilizzando la spettroscopia transmurale di riambente di cuori mammiferi perfusi

Titolazione biochimica di glicogeno

Analisi globale di RNA Sintesi a livello di singola cellula seguente ipossia

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