Assim, esse método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo da biologia do macrófago, como como caracterizar o estado de ativação em vários ambientes no nível da proteína. A principal vantagem dessa técnica é que ela proporciona a oportunidade de obter uma expressão diferente de muitas proteínas em macrófagos humanos usando o método de quantificação sem rótulos. Demonstrando o procedimento serão Marie Malier e Magali Court do meu laboratório.
Para começar, adicione 15 mililitros de solução de separação celular gradiente de densidade em cada um dos dois tubos de centrifugação de 50 mililitros para que a solução possa aquecer à temperatura ambiente antes de receber o LRSC. Isso é essencial, pois a densidade depende da temperatura. Esvazie o LRSC em um tubo de centrifugação de 50 mililitros.
Adicione 1x PBS até 50 mililitros e misture. Em seguida, muito lentamente, adicione 25 mililitros da mistura em cima de 15 mililitros de solução de gradiente de densidade equilibrada. Tenha cuidado para não misturar as fases durante esta etapa.
O sangue deve ser adicionado na solução gradiente de densidade sem qualquer perturbação desta fase. Centrifugar ambos os tubos de centrifugação por 25 minutos a 700 G sem quebras. No final da centrifugação gradiente de densidade, as camadas de baixo para cima são os eritrócitos e granulócitos, formando a pelota, a fase de solução de gradiente de densidade, uma camada de PBMCs e o plasma diluído.
Com uma pipeta, passe pela fase plasmática sem aspirar. Em seguida, colete a camada PBMC em um novo tubo de centrífugação de 50 mililitros. Adicione até 50 mililitros de 1x PBS aos PBMCs como uma configuração de lavagem e centrífuga por 10 minutos a 300 G.Aspire o supernasce e suspenda a pelota em 40 mililitros de meio macrófago.
Depois de colocar os PBMCs em uma câmara de Malassez, transfira a quantidade de PBMCs necessários para conduzir o experimento para um tubo de centrifugação. Centrifugar as células por 10 minutos a 300 G.Aspire o supernascer e suspenda a pelota em 80 microliters do buffer de classificação por 10 milhões de PBMCs. Em seguida, adicione 20 microliters de microesferas CD14 por 10 milhões de PBMCs.
Misture bem e incubar por 15 minutos a 4 graus Celsius sob agitação constante. Após a incubação, adicione um mililitro de tampão de classificação por 10 milhões de PBMCs como etapa de lavagem e centrífuga como antes. Em seguida, aspire o supernascer e suspenda novamente a pelota em 500 microliters de tampão de classificação por 100 milhões de PBMCs.
Agora, coloque uma coluna no campo magnético do separador. Prepare a coluna enxaguando-a com três mililitros de tampão de classificação. Aplique a suspensão do celular na coluna.
Em seguida, colete o fluxo através de células não rotuladas para posterior coloração, se necessário. Lave a coluna três vezes com três mililitros de tampão de classificação. Tenha cuidado para não secar sua coluna.
Em seguida, coloque um tubo de coleta sob a coluna e remova-o do separador. Após a lavagem, pipeta cinco mililitros de tampão de classificação na coluna. Imediatamente limpe as células magneticamente rotuladas empurrando firmemente o êmbolo para dentro da coluna.
Por fim, repita esses passos com uma nova coluna antes de emplacar os monócitos e realizar a polarização do macrófago, conforme descrito no protocolo de texto. Mantenha os monócitos e os macrófagos em um ambiente controlado pelo oxigênio para realizar a análise de condições hipoxicas. Use uma estação de trabalho de hipóxia para manter as células sob a pressão parcial de oxigênio desejada durante o experimento.
Ao trabalhar sob baixa pressão de oxigênio, é importante preparar todas as mídias e tampões de lavagem sob a estação, e esperar o suficiente para obter a pressão parcial correta no líquido. Realize a lise celular em um tampão sob um capô adaptado. Carregue o equivalente a proteína de 300.000 células para cada amostra em géis de acrilamida de 4-12%bis-tris.
Controle a duração da migração eletroforética para permitir que cada amostra de proteína se divida em seis bandas de gel, como mostrado aqui. Após fixação e coloração conforme descrito no protocolo de texto, extirpar as bandas de proteína com um bisturi limpo. Pique cada banda excisada antes de colocá-los em tubos de 500 microliter.
Agora, lave as fatias de gel três vezes em 200 microlitadores de 25 mililitros de amônio bicarbonato por 20 minutos a 37 graus Celsius, descartando o bicarbonato de amônio entre cada passo. Siga-o com uma lavagem em 25 milimônios de bicarbonato de amônio e acetonitrilo. Em seguida, desidratar as peças de gel com 200 microliters de 100% acetonitrilo por 10 minutos.
Incubar cada peça de gel com 10 mililitros DTT e 25 milimônios bicarbonato de amônio por 45 minutos a 56 graus Celsius. Em seguida, descarte o DTT e incubar a peça de gel com iodoacetamida de 55 milimônios em 25 milimônios bicarbonato de amônio por 35 minutos no escuro à temperatura ambiente. Para parar a alquilação, descarte a solução usada e incuba cada peça de gel com 200 microlitres de 10 mililitros DTT em 25 mililitros de amônio bicarbonato por 10 minutos à temperatura ambiente.
Lave as peças de gel em 200 microliters de 25 milimônios bicarbonato de amônio. Em seguida, desidratar com 200 microliters de 100% acetonitrilo por 10 minutos. Digerir as proteínas durante a noite a 37 graus Celsius com Trypsin/Lys-C Mix de acordo com as instruções do fabricante.
Extrair os peptídeos resultantes de peças de gel adicionando 50 microlitadores de 50% de acetonitrilo por 15 minutos em tubos de baixa absorção. Depois de adicionar 50 microliters de ácido fórmico de 5% por 15 minutos, adicione 50 microliters de 100% acetonitrilo por 15 minutos. Puxe e seque cada fração em tubos de baixa absorção para limitar a absorção de peptídeos e perda de amostra.
Armazene as amostras a 80 graus Celsius até uma análise mais aprofundada conforme detalhado no protocolo de texto. Mostrada aqui é a pureza representativa avaliada pela citometria de fluxo após a seleção de contas magnéticas de monócitos positivos CD14. Imagens de contraste de fase de macrófagos humanos diferenciados mostram heterogeneidade de morfologias obtidas para duas polarizações diferentes após nove dias de cultura.
Um exemplo de digestão off-gel usando géis de página SDS manchados de prata é mostrado. A avaliação da proteína a partir da lise celular e após a digestão em solução mostra a ausência de degradação durante a lise e a eficiência da digestão. Mostrado aqui é um exemplo de um espectro de dissociação induzido por colisão de um peptídeo encontrado na relação massa-carga de 597,29 no espectro MS com uma carga elétrica de dois positivos.
A partir deste espectro, a sequência correspondente foi determinada. O resultado final após a análise é um mapa de calor representando o agrupamento hierárquico de todos os estados de polarização usando proteínas expressas diferencialmente. A análise revela um conjunto de proteínas super-expressas em todas as polarizações na condição de oxigênio de 3%.
Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que você tem que decidir primeiro que tipo de fracionamento você realizará em novas amostras para adaptar seu protocolo de acordo. A abordagem proteômica que utiliza este trabalho é complementar às abordagens genômicas que têm sido utilizadas nos últimos anos no campo dos estudos de polarização da biologia macrófago. Após seu desenvolvimento, essa técnica abre caminho para que o pesquisador no campo da imunologia explore os diversos estados de ativação de células imunes em humanos e também em outros mamíferos.
Não se esqueça que trabalhar com DTT pode ser perigoso, então você precisa trabalhar sob um capô adaptado para fazer este procedimento.
