Name: analysis of cap-binding proteins in human cells exposed to physiological oxygen conditions
Uploaded: 2016-12-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 40 s
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This work was supported by the Natural Sciences and Engineering Council of Canada and the Ontario Ministry of Research and Innovation.

1. Vorbereitungen für die Zellkultur <ol><li> Erwerben Sie kommerziell verfügbaren Bestände von menschlichen Zellen. Hinweis: Dieses Protokoll nutzt HCT116 kolorektalem Karzinom und primären humanen renalen proximalen Tubulusepithelzellen (HRPTEC). </li><li> Make 500 ml Medium für die Kultur von HCT116: Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) / Hochglucosemedium, supplementiert mit 7,5% fötalem Rinderserum (FBS) und 1% Penicillin / Streptomycin (P / S). </li><li> Machen Sie 500 ml Medium für die Kultur von HRPTEC: Epithelial Zellmedium mit 5% FBS, 1% Epithelzellwachstum Ergänzung und 1% P / S. </li><li> Bereiten 500 ml 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS): 140 mM NaCl, 3 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4, 15 mM KH 2 PO 4. PH-Wert auf 7,4 und Sterilisieren durch Autoklavieren für 40 min bei 121 ° C. </li></ol> 2. Einleitung der Zellkultur <ol><li> aspirieren vorsichtig das Medium von einem 80-90% konfluent Gericht ohne t störener Zellen. </li><li> Aliquotieren 3-5 ml 1x PBS pro Kulturschale, schaukeln sanft jeden Kolben zur Beschichtung der Oberfläche der Schale, und sorgfältig die 1x PBS absaugen. Wiederholen Sie dies für eine zweite 1x PBS zu waschen. </li><li> Aliquot 3 ml von 0,05% Trypsin-Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) in jede Kulturschale und sanft die Zellen mit Trypsin-EDTA gleichmäßig zu beschichten schaukeln. Inkubieren bei 37 ° C für 2-3 min. </li><li> Übertragen Sie die abgelösten Zellen in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen und Zentrifuge bei 4000 × g für 90 Sekunden. </li><li> Resuspendieren Zellpellet in 1 ml vollständigem DMEM. </li><li> Zählen von Zellen mit einem Hämozytometer. Berechnen Sie, wie viele nicht-pyrogene und Polystyrol 100 mm - Schalen Zellkultur erforderlich , um eine anfängliche Aussaatdichte von etwa 2.500-5.000 Zellen pro cm 2 zu erreichen. </li><li> Vorwärmen komplette Zellkulturmedium für 30-45 min in Schritten 1.2 oder 1.3 in einem 37 ° C Wasserbad gestellt. </li><li> Dekontaminieren Mediumflasche und Zell Fläschchen mit 70% Ethanol. Von diesem Zeitpunkt an alleOperationen sollten aseptisch durchgeführt werden. </li><li> Aliquot 6 ml komplettem DMEM in so viele 100 mm Zellkulturschalen erforderlich, um das gesamte Volumen des gefrorenen Zellen im Aussaatdichte in Schritt 2.6 erwähnt zu verwenden. </li><li> Übertragen, um das Volumen der Zellsuspension berechnet in Schritt 2.6 zu jeder der 100 mm-Kulturschalen. Schaukeln Sie jede Platte manuell gleichmäßig die Zellen über die Oberfläche der Platte verteilen. </li><li> Platzieren Sie die seeded 100 mm Zellkulturschale in den Inkubator bei 37 ° C in einer 5% CO 2 -Atmosphäre. Lassen Zellen mindestens 24 Stunden vor den nächsten Schritten zu brüten. </li></ol> 3. Subkultivierung <ol><li> Informieren jeder Zellkulturschale unter einem Mikroskop den Prozentsatz der Zellen Konfluenz (% Zellen mit der Fläche der Schale) zu bestimmen. Zurück Zellen in den Inkubator und vorwärmen komplettes Medium und 1x PBS. Fahren Sie mit dem nächsten Schritt, wenn die Zellen 80-100% konfluent sind. </li><li> aspirieren vorsichtig das verbrauchte Medium ohne die störendeZellen in jeder Kulturschale. </li><li> Aliquotieren 3-5 ml 1x PBS pro Kulturschale, schaukeln sanft jeden Kolben zur Beschichtung der Oberfläche der Schale, und sorgfältig die 1x PBS absaugen. Wiederholen Sie dies für eine zweite 1x PBS zu waschen. </li><li> Aliquot 3 ml 0,05% Trypsin-EDTA in jede Kulturschale und sanft schaukeln die Zellen gleichmäßig zu beschichten mit Trypsin-EDTA. Inkubieren bei 37 ° C für 2-3 min. </li><li> Während dieser Inkubation aliquote 10 ml vollständigem Medium in so viele Kulturschalen erforderlich sind , um Zelldichte von 2.500-5.000 Zellen pro cm 2 erhalten. </li><li> Wenn die Zellen von der Platte abgelöst, fügen Sie schnell 3 ml 1x definiert Trypsininhibitor und sanft die Schale für 1 min schwenken, um sicherzustellen, dass alle von der Trypsin-EDTA neutralisiert wurde. </li><li> Übertragen Sie die abgelösten Zellen in ein steriles 15 ml Zentrifugenröhrchen und beiseite stellen. 3 ml 1x PBS in die Schale jegliche verbleibenden Zellen zu sammeln und zu übertragen, die zum gleichen 15 ml Zentrifugenröhrchen. </li><li> Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugieren 150 xg5 min. </li><li> Aspirieren den Überstand und Zellpellet in 3 ml vollständigem Medium. </li><li> Zählen von Zellen unter Verwendung eines Hämozytometers und Samen 150 mm Kulturschalen mit 15 ml vollständigem Medium eine Zelldichte von 2.500-5.000 Zellen pro cm 2 zu erhalten. Verwenden Sie zwei 150 mm für jede Kappe Bindungsassay. HINWEIS: Sauerstoffdiffusion zu den Zellen durch flüssige Medien ist abhängig von dem Volumen 36. Es wird empfohlen, das Volumen der Medien konsistent zwischen den Experimenten zu halten, ob anhaftenden Zellen oder Zellen in Suspension verwendet werden. Medien werden kann vorbehandelt (inkubiert in der Workstation für 24 Stunden wie in Diskussion besprochen), um diese Variabilitäten in Diffusion zu vermeiden. </li><li> Legen Sie die geimpfte Kulturschalen im Inkubator bei 37 ° C in einer 5% CO 2 -Atmosphäre. Lassen Zellen mindestens 24 Stunden inkubiert, bevor zu den nächsten Schritten fortfahren. </li></ol> 4. Physioxic Exposure <ol><li> Sehen Sie sich die Zellen unter dem Mikroskop. BESt Ergebnisse, stellen Sie sicher, dass die Zellen sind 70-80% konfluent für eine 24-Stunden-Exposition, 50-60% konfluent für eine 48 Stunden Belichtung und 40 bis 50% konfluent für eine 72 Stunden Exposition. </li><li> Platzieren Sie die Zellen in eine Hypoxie-Workstation für die gewünschte Zeit (24, 48 oder 72 Stunden je nach Experiment). </li><li> Stellen Sie die Workstation an den entsprechenden physioxia. HINWEIS: Zum Beispiel eine 3% O 2 Einstellung von 5% CO 2 und 92% N 2 begleitet würden. HINWEIS: Wenn die Sauerstoffschwankungen innerhalb eines dynamischen Bereichs sind eine bestimmte Zeitleiste, programmieren Sie den Zeitplan in das Gerät gewünscht über oder manuell die Sauerstoff-Einstellungen in den gewünschten Intervallen einzustellen. </li><li> Stellen Sie die Luftfeuchtigkeit auf 60%. Die Workstation Atmosphäre ist sehr trocken dennoch und Medien wird deutlich bei langen Experimenten (&gt; 48 h) zu verdampfen. Halten Sie eine Medien Reserve in einer Zellkulturflasche in der Workstation (so, dass die Medien mit der Workstation Atmosphäre ins Gleichgewicht gebracht wird), um die Medien in der Zellkultur dis aufzufüllener ist. HINWEIS: Jede Lösung , die mit den Zellen vor der Lyse (wie PBS und Trypsin-EDTA) sollte vorab konditioniert für 24 h vor der Verwendung innerhalb der Hypoxie Workstation so daß der gelöste Sauerstoff mit dem Luftsauerstoff zu interagieren 36 äquilibriert. </li><li> Halten Zellen innerhalb der Arbeitsstation, bis die Lyse. </li></ol> 5. Vorbereitung Puffer für Cap-Bindungsassay <ol><li> Bereiten 1x Tris-gepufferter Salzlösung (TBS). <ol><li> In 800 ml dH 2 O lösen sich 8,76 g NaCl und 6,05 g Tris - Base. </li><li> Man bringt die Lösung auf einen endgültigen pH von 7,4 unter Verwendung von 1 M HCl. </li><li> Bringen Sie das endgültige Volumen auf 1 l mit dH 2 O. </li></ol></li><li> Bereiten Sie nicht denaturierende Lyse-Puffer. Bereiten Sie die Lyse-Puffer, den Tag des cap-Bindungstest. Machen Sie zusätzliche Lysepuffer die leeren Agarosekügelchen und die γ-aminophenyl-m 7 GTP Agarose - C10-verknüpften Kügelchen (Schritte 7.9 und 7.13) zu waschen. <ol><li> In 7 ml dH 2 O, fügen Sie 160 ul 5 M NaCll, 160 &amp; mgr; l 1 M Tris-HCl pH 7,4, 40 ul 200 mM NaF, 40 &amp; mgr; l 1 M MgCl 2 und 40 &amp; mgr; l 1 mM Natriumorthovanadat. </li><li> In 40 ul Igepal auf die 7 ml Lösung. Schneiden Sie die Spitze der Pipette abrufen zu helfen Igepal, da es extrem zähflüssig ist. </li><li> Mischen durch Pipettieren von oben und unten, oder Wirbel, die 7 ml Lösung, bis alle der Igepal aufgelöst wurde. </li><li> Heben Sie das endgültige Volumen der Lösung auf 8 ml und auf Eis halten. </li></ol></li><li> Bereiten Sie 4x Natriumdodecylsulfat (SDS) -PAGE Probenpuffer. <ol><li> In einem Becherglas kombinieren 16 ml 1 M Tris-HCl pH 6,8, 12,64 ml Glycerin und 8 ml Dithiothreitol (DTT). </li><li> In 3,2 g SDS und 0,16 g Bromphenolblau. Lassen Pulver zu lösen vollständig mit einem magnetischen Rührstab durch Mischen. </li><li> Aliquote in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und bei -20 ° C. </li></ol></li></ol> 6. Zellyse <ol><li> Bereiten Sie nicht denaturierende Lyse-Puffer und auf Eis halten den Tag der the cap-Bindungstest. </li><li> Vorwärmen 1x PBS und Trypsin in einem 37 ° C Wasserbad für 30 min. </li><li> Aliquot 980 ul Lysepuffer in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen für jede cap-Bindungsassay durchgeführt wird. </li><li> Zugabe von 10 &amp; mgr; l von 4- (2-aminoethyl) benzolsulfonyl Fluorid-Hydrochlorid und 10 &amp; mgr; l 100x-Protease-Inhibitor-Cocktail zu den 980 &amp; mgr; l Lysepuffer. Halten Sie sich auf dem Eis. </li><li> Entsorgen Sie die Medien von jedem 150-mm-Schale in einem Abfallbehälter in der Hypoxie-Workstation. </li><li> Waschen Sie die Zellen mit 3-4 ml warmem 1x PBS und entsorgen Sie die gesamte Flüssigkeit. </li><li> 1 ml warmes 0,05% Trypsin-EDTA zu jeder Schale und ließ für 2 min sitzen oder bis die Zellen nicht mehr an der Platte haftete. </li><li> Mit einer Pipette übertragen die Zellen einer Platte zu einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Wiederholen, wie erforderlich, so daß jede Platte der Zellen auf einem separaten 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen überführt wird. </li><li> Zentrifugieren Sie die 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen bei 6000 × g für 90 s to die Zellen pelletieren. </li><li> Saugen Sie das Trypsin mit Hilfe einer Pipette ohne das Pellet zu stören. Wenn das Pellet gestört ist, wieder Zentrifuge die 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen bei 6000 × g für 90 Sekunden. </li><li> Waschen Sie die Zellen mit warmem 1x PBS durch sanftes Pipettieren von 200 ul PBS in das Röhrchen gerade oberhalb des Pellets. Re-Zentrifuge, wenn das Pellet wird gestört. </li><li> Saugen Sie das PBS, ohne das Pellet zu stören. </li><li> Pipette 500 &amp; mgr; l aus den 1 ml hergestellt Lyse-Pufferlösung auf die erste Zellpellet. Das Pellet vollständig durch Auf- und Abpipettieren. </li><li> Kombinieren Sie die resuspendierten Zellen mit dem zweiten Zellpellet und resuspendieren das zweite Pellet durch Auf- und Abpipettieren. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis alle Pellets wurden für jede Probe kombiniert und erneut suspendiert. </li><li> Kombinieren des Lysats mit den verbleibenden 500 ul Lysepuffer in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. </li><li> Entfernen Proben aus der Hypoxie-Workstation. HINWEIS: Nach dem Lysepuffer Zugabe einll nachfolgenden Schritte sind in der Umgebungsluft durchgeführt werden, da der Hypoxie-Workstation auf 37 ° C eingestellt ist und die folgenden Schritte ausgeführt werden kalt (4 ° C oder auf Eis) werden. </li><li> Lyse der Zellen unter Verwendung von leichtem Rühren durch Drehen der Proben bei 4 ° C für 1,5-2 Stunden. </li><li> Zentrifugation der lysierten Zellen bei 12.000 xg für 15 min bei 4 ° C um Zelltrümmer zu entfernen. </li><li> Übertragen Sie das Lysat in ein neues 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und verwerfen das Pellet. </li><li> Reservieren ein Teil (5-10%) des Überstands als Ganzes Zelllysat Eingangssteuerung für zukünftige Western-Blot-Analyse verwendet werden. </li></ol> 7. Cap-Bindungsassay <ol><li> Für jede Probe werden 50 &amp; mgr; l des Zuschnitts Agarosekügelchen Steuer Slurry und 50 ul der γ-aminophenyl-m 7 GTP Agarose - C10-linked Kügelchenaufschlämmung 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen zu trennen. Mit einer Schere die Spitze der Pipette zu entfernen Sammlung des Wulstes Aufschlämmung zu erleichtern. </li><li> Pellet die Perlen by Zentrifugieren der Aufschlämmung bei 500 xg für 30 sec. </li><li> Entfernen Sie den Überstand vorsichtig und resuspendieren die Perlen in 500 ul TBS. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 7.2 und 7.3. Pellet die Kügelchen bei 500 g für 30 Sekunden und entfernen Sie den Überstand. </li><li> Den Überstand des Lysats aus Schritt 6,19 bis 1,5 ml Mikroröhrchen, das die leeren Agarosekügelchen enthält. HINWEIS: Die leeren Agarosekügelchen wirken als pre-Löschschritt Proteine ​​aus dem Lysat zu entfernen, die nicht spezifisch mit der Wulst zusammenwirken. </li><li> Inkubieren für 10 min bei 4 ° C unter leichtem Schütteln. </li><li> Pellet die leere Agarosekügelchen von bei 500 × g für 30 Sekunden zentrifugiert. </li><li> Übertragen Sie das Lysat auf die 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen , die γ-aminophenyl-m 7 GTP Agarose - C10-verknüpften Kügelchen enthält. </li><li> Waschen Sie die leere Agarosekügelchen durch Resuspendieren der Kügelchen in 500 ul Lysepuffer, die Perlen der Pelletierung von 30 s bei 500 · g zentrifugiert, und Verwerfen des supernatant. Wiederholen Sie diese vier Mal für insgesamt fünf Wäschen. </li><li> Resuspendieren der leeren Agarosekügelchen in 1x SDS-PAGE-Probenpuffer, und kochen Sie die Perlen für 90 Sekunden bei 95 ° C. Bei -20 ° C für zukünftige Western-Blot-Analyse zu beobachten, ob das Protein von Interesse bindet unspezifisch an dem Wulst. </li><li> Inkubieren des Lysats mit den γ-aminophenyl-m 7 GTP Agarose - C10-verknüpften Kügelchen unter leichtem Schütteln für 1 h bei 4 ° C cap-Bindungsproteine zu erfassen. </li><li> Pellet die γ-aminophenyl-m 7 GTP Agarose - C10-gebundene Kügelchen durch bei 500 × g für 30 Sekunden zentrifugiert. Überstand verwerfen. </li><li> Waschen Sie die γ-aminophenyl-m 7 GTP Agarose - C10-verknüpften Kügelchen Schritt 7.9 wiederholen. </li><li> Resuspendieren der Kügelchen in 600 &amp; mgr; l Lysepuffer. </li><li> Hinzufügen GTP zu einer Endkonzentration von 1 mM. </li><li> Inkubieren der γ-aminophenyl-m 7 GTP Agarose - C10-verknüpften Kügelchen + 1 mM GTP unter leichtem Schütteln für 1 h bei 4 ° C. Anmerkung: Diesedistanziere werden Proteine , die nicht spezifisch mit m 7 GTP interagieren (dh interagieren auch mit nicht-methylierte GTP). </li><li> Pellet die γ-aminophenyl-m 7 GTP Agarose - C10-gebundene Kügelchen durch bei 500 × g für 30 Sekunden zentrifugiert. </li><li> Den Überstand in ein neues 1,5 ml-Mikrozentrifugenröhrchen eingewogen und 200 &amp; mgr; l 4x SDS-PAGE-Probenpuffer (50 mM Tris-HCl, 100 mM DTT, 2% SDS, 0,1% Bromphenolblau und 10% Glycerin). Bewahren Sie die GTP Kontrollprobe bei -20 ° C für eine spätere Western - Blot - Analyse 37. Waschen Sie die Perlen um 7,9 Schritt zu wiederholen. </li><li> Resuspendieren der Kügelchen in 1x SDS-PAGE-Probenpuffer (50 mM Tris-HCl, 100 mM DTT, 2% SDS, 0,1% Bromphenolblau und 10% Glycerin) und Kochen bei 95 ° C für 90 sec. Speichern die m 7 GTP-gebundenen Fraktion , die bei -20 ° C für zukünftige Western - Blot - Analyse 37. </li></ol>

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E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ISG15+modification+of+the+eIF4E+cognate+4EHP+enhances+cap+structure-binding+activity+of+4EHP.">ISG15 modification of the eIF4E cognate 4EHP enhances cap structure-binding activity of 4EHP.</a> Genes Dev. 21 (3), 255-260 (2007).</li><li>Kedersha, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+that+ternary+complex+(eIF2-GTP-tRNA(i)(Met))-deficient+preinitiation+complexes+are+core+constituents+of+mammalian+stress+granules.">Evidence that ternary complex (eIF2-GTP-tRNA(i)(Met))-deficient preinitiation complexes are core constituents of mammalian stress granules.</a> Mol Biol Cell. 13 (1), 195-210 (2002).</li><li>Gu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+the+structure,+mechanism,+and+regulation+of+scavenger+mRNA+decapping+activity.">Insights into the structure, mechanism, and regulation of scavenger mRNA decapping activity.</a> Mol Cell. 14 (1), 67-80 (2004).</li><li>Szczepaniak, S. A., Zuberek, J., Darzynkiewicz, E., Kufel, J., Jemielity, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affinity+resins+containing+enzymatically+resistant+mRNA+cap+analogs--a+new+tool+for+the+analysis+of+cap-binding+proteins.">Affinity resins containing enzymatically resistant mRNA cap analogs--a new tool for the analysis of cap-binding proteins.</a> RNA. 18 (7), 1421-1432 (2012).</li><li>Joshi, B., Cameron, A., Jagus, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+mammalian+eIF4E-family+members.">Characterization of mammalian eIF4E-family members.</a> Eur J Biochem. 271 (11), 2189-2203 (2004).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Die Analyse der Cap-bindenden Proteinen in menschlichen physiologischen Sauerstoffbedingungen ausgesetzt Zellen können für die Identifizierung von neuen Sauerstoff-regulierten Translationsinitiationsfaktoren ermöglichen. Die Affinität dieser Faktoren für die 5 &#39;Cap der mRNA oder andere cap-assoziierte Proteine können durch die Stärke ihrer Verbindung zu m 7 GTP-gebundenen Agarosekügelchen gemessen werden. Eine Einschränkung dieser Technik ist, dass sie die cap-Bindungspotential von Proteinen nach...

Translational Steuerung zeichnet sich als ein ebenso wichtiger Schritt , um die Transkriptionsregulation in der Genexpression, insbesondere in Zeiten der zellulären Stress 1. Ein Schwerpunkt der Translationskontrolle ist bei der geschwindigkeitsbestimmende Schritt der Einleitung , wo die ersten Schritte der Proteinsynthese , die Bindung des eukaryotische Initiationsfaktor 4E (eIF4E) an die 7-Methylguanosin (m 7 GTP) 5&#39; - Cap von mRNAs beinhalten 2 . eIF4E ist Teil eines trimeren Komplex namens eIF4F die eIF4A, eine RNA - Helikase und eIF4G, ein Gerüstprotein , die für die Rekrutierung anderer Übersetzungsfaktoren und die 40S - Ribosoms 3 umfasst. Unter normalen physiologischen Bedingungen, die überwiegende Mehrheit der mRNAs über einen CAP-abhängigen Mechanismus übersetzt, aber unter Perioden der zellulären Stress etwa 10% der humanen mRNAs enthalten 5 &#39;UTR , die cap-unabhängige Translation Initiation 1,4 ermöglichen kann. Cap-abhängige Translation ist historisch Synonymous mit eIF4F jedoch stressspezifische Varianten von eIF4F haben ein Trend - Thema geworden 5-8. Verschiedene Zellspannungen verursachen eIF4E Aktivität über die Säugetier-Ziel von Rapamycin-Komplex 1 (mTORC1) verdrängt werden. Diese Kinase wird unter Stress beeinträchtigt, die eines seiner Ziele in der erhöhten Aktivität führt, die 4E-Bindungsprotein (4E-BP). Nicht-phosphoryliert 4E-BP bindet an eIF4E und blockiert ihre Fähigkeit , mit eIF4G wodurch die Unterdrückung von Cap-abhängige Translation 9,10 zu interagieren. Interessanterweise hat ein Homolog von eIF4E namens eIF4E2 (oder 4EHP) eine viel geringere Affinität für 4E-BP 11, vielleicht so dass es Stress-vermittelten Repression zu entziehen. Tatsächlich zunächst als Repressor der Übersetzung charakterisiert aufgrund seiner mangelnden Wechselwirkung mit eIF4G 12 initiiert eIF4E2 Übersetzung von Hunderten von mRNAs , die RNA Hypoxie - Response - Elemente in ihren 3&#39; - UTR 6,13 während des hypoxischen Stress enthalten. Diese Aktivierung is durch Wechselwirkungen mit eIF4G3 erzielte RNA - Bindungsprotein - Motiv 4 und der Hypoxie - induzierbaren Faktor (HIF) 2α einen hypoxischen eIF4F Komplex oder eIF4F H 6,13 zu bilden. Als Repressor unter normalen Bedingungen bindet eIF4E2 mit GIGYF2 und ZNF598 14. Diese Komplexe wurden, teilweise identifiziert durch Agarose-linked m 7 GTP Affinitätsharze. Diese klassische Methode 15 ist im Bereich der Übersetzungsnorm und ist die beste und am häufigsten verwendete Technik cap-Bindungskomplexe in Zug zu isolieren , nach unten und in - vitro - Bindungsassays 16-19. Da der cap-abhängigen Translationsmaschinerie als flexibel und anpassungsfähig mit inter ändernden Teilen Schwellen 6-8,13 Dieses Verfahren ist ein leistungsfähiges Werkzeug , um schnell neue cap-Bindungsproteine in der Stressantwort beteiligt identifizieren. Weiterhin ist in Variationen eIF4F könnte weitreichende Auswirkungen haben, da mehrere eukaryotische Modellsysteme scheinen eine eIF4E2 Homolog für Stressreaktionen zu verwenden, wiewie A. thaliana 20, S. Pombe 21, D. melanogaster 22 und C. elegans 23. Hinweise darauf , dass Variationen in eIF4F nicht streng auf Stressbedingungen beschränkt, sondern in der normalen Physiologie 24 einbezogen werden. Die Sauerstoffversorgung der Gewebe (in Kapillarenden) oder innerhalb von Geweben (via Mikroelektroden gemessen wird ) variiert von 2-6% im Gehirn 25, 3-12% der Lunge 26, 3,5-6% im Darm 27, 4% in die Leber 28, 7-12% in der Niere 29, 4% in Muskel 30 und 6-7% in dem Knochenmark 31. Zellen und Mitochondrien enthalten weniger als 1,3% Sauerstoff 32. Diese Werte sind sehr viel näher an Hypoxie als die Umgebungsluft, wo Zellen routinemßig kultiviert. Dies legt nahe, dass das, was vorher waren gedacht als Hypoxie-spezifische zelluläre Prozesse in einer physiologischen Umgebung von Bedeutung sein können. Interessanterweise eIF4F und eIF4F H </sup&gt; aktiv an der Translationsinitiations verschiedener Pools oder Klassen von mRNAs in verschiedenen menschlichen Zelllinien teilnehmen zu physiologischen Sauerstoff ausgesetzt oder &quot;physioxia&quot; 24. Niedrige Sauerstoff treibt auch die richtige Entwicklung des Fötus 33 und Zellen haben in der Regel höhere Proliferationsraten, längere Lebensdauer, weniger DNA - Schäden und weniger allgemeine Stressreaktionen in physioxia 34. Daher ist eIF4F H wahrscheinlich ein wichtiger Faktor bei der Expression von ausgewählten Genen unter physiologischen Bedingungen. Hier bieten wir ein Protokoll zur Kultivierung von Zellen in festen physiologischen Sauerstoffbedingungen oder in einem dynamischen Schwankungsbereich, die wahrscheinlich mehr repräsentativ für Gewebe-Mikroumgebungen ist. Ein Vorteil dieses Verfahrens ist, dass Zellen innerhalb der Hypoxie Workstation lysiert werden. Es ist oft nicht klar, wie der Übergang von hypoxische Zellkultur zu Zellaufschluß wird in anderen Protokollen durchgeführt. Zellen werden oft zunächst von einem kleinen Hypoxie Inkubator entfernt werdenVordergrund - Lyse, aber diese Exposition gegenüber Sauerstoff konnte biochemische Wege beeinflussen , wie die zelluläre Reaktion auf Sauerstoff schnell ist (ein oder zwei Minuten) 35. Bestimmte cap-bindende Proteine erfordern Wechselwirkungen mit einer zweiten Base oder die m 7 GTP hydrolysieren daher einige Kappe Interaktoren können in dem Reinigungsverfahren fehlen. Agarose-gebundenen enzymatisch sicheren Verschluss-Analoga können in diesem Protokoll ersetzt werden. Erforschung der Aktivität und Zusammensetzung der eIF4F H und andere Variationen von eIF4F durch das hier beschriebene Verfahren wird Licht auf die komplizierten Genexpression Maschinerien , die Zellen während der physiologischen Bedingungen oder Stressreaktionen zu nutzen.

<table><tbody><tr><td>&amp;gamma;-aminophenyl-m&lt;sup&gt;7&lt;/sup&gt;GTP agarose C&lt;sub&gt;10&lt;/sub&gt;-linked beads</td><td>Jena Bioscience</td><td>AC-1555</td><td>Agarose-linked m&lt;sup&gt;7&lt;/sup&gt;GTP</td></tr><tr><td>100 mm culture dish</td><td>Corning</td><td>877222</td><td>10-cm culture dish</td></tr><tr><td>150 mm culture dish</td><td>Thermofisher</td><td>130183</td><td>15 cm culture dish</td></tr><tr><td>AEBSF Hydrochloride</td><td>ACROS Organics</td><td>A0356829</td><td>AEBSF</td></tr><tr><td>Agarose Beads</td><td>Jena Bioscience&amp;nbsp;</td><td>AC-0015</td><td>Agarose bead control</td></tr><tr><td>Bromophenol Blue</td><td>Fisher</td><td>BP112-25</td><td>Component of SDS-PAGE loading buffer</td></tr><tr><td>1.5 ml Centrifuge Tubes</td><td>FroggaBio</td><td>1210-00S</td><td>Used to centrifuge small volumes</td></tr><tr><td>15 ml Conical Centrifuge Tubes</td><td>Fisher</td><td>1495970C</td><td>Used in culturing primary cells</td></tr><tr><td>Defined trypsin inhibitor</td><td>Fisher</td><td>R007100</td><td>DTI</td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Fisher</td><td>BP172-25</td><td>DTT</td></tr><tr><td>Epithelial cell medium (complete kit)</td><td>ScienCell</td><td>4101</td><td>Includes serum and growth factor supplements)</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Fisher</td><td>BP229-1</td><td>Component of SDS-PAGE loading buffer</td></tr><tr><td>100 mM Guanosine 5&#039;-triphosphate, 1 ml</td><td>Jena Bioscience</td><td>272076-0251M</td><td>GTP</td></tr><tr><td>HCT116 colorectal carcinoma</td><td>ATCC</td><td>CCL-247</td><td>Human cancer cell line</td></tr><tr><td>Human renal proximal tubular epithelial cells</td><td>ATCC</td><td>PCS-400-010</td><td>HRPTEC</td></tr><tr><td>Hyclone DMEM/High Glucose</td><td>GE Life Sciences</td><td>SH30022.01</td><td>Standard media for human cell culture</td></tr><tr><td>Hyclone Penicillin-Streptomycin solution</td><td>GE Life Sciences</td><td>SV30010</td><td>Antibiotic component of DMEM</td></tr><tr><td>H35 HypOxystation</td><td>Hypoxygen</td><td>N/A</td><td>Hypoxia workstation</td></tr><tr><td>Igepal CA-630</td><td>MP Biomedicals</td><td>2198596</td><td>Detergent component of lysis buffer</td></tr><tr><td>Monopotassium phosphate</td><td>Fisher</td><td>P288-500</td><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>Fisher</td><td>P217-500</td><td>KCl</td></tr><tr><td>Magnesium chloride</td><td>Fisher</td><td>M33-500</td><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Fisher</td><td>BP358-10</td><td>NaCl</td></tr><tr><td>Sodium fluoride</td><td>Fisher</td><td>5299-100</td><td>NaF (phosphatase inhibitor component of lysis buffer)</td></tr><tr><td>Disodium phosphate</td><td>Fisher</td><td>5369-500</td><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>Premium Grade Fetal Bovine Serum</td><td>Seradigm</td><td>1500-500</td><td>FBS</td></tr><tr><td>Protease Inhibitor Cocktail (100x)</td><td>Cell Signalling</td><td>58715</td><td>Component of lysis buffer</td></tr><tr><td>Sodium Dodecyl Sulfate</td><td>Fisher</td><td>BP166-100</td><td>SDS</td></tr><tr><td>Sodium Orthovanadate</td><td>Sigma</td><td>56508</td><td>Na&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;VO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Fisher</td><td>BP152-5</td><td>Component of buffers</td></tr><tr><td>0.05% Trypsin-EDTA (1x)</td><td>Life Technologies</td><td>2500-067</td><td>Trypsin used to detach adherent cells</td></tr></tbody></table>

analysis of cap-binding proteins in human cells exposed to physiological oxygen conditions

Translational control is a focal point of gene regulation, especially during periods of cellular stress. Cap-dependent translation via the eIF4F complex is by far the most common pathway to initiate protein synthesis in eukaryotic cells, but stress-specific variations of this complex are now emerging. Purifying cap-binding proteins with an affinity resin composed of Agarose-linked m7GTP (a 5' mRNA cap analog) is a useful tool to identify factors involved in the regulation of translation initiation. Hypoxia (low oxygen) is a cellular stress encountered during fetal development and tumor progression, and is highly dependent on translation regulation. Furthermore, it was recently reported that human adult organs have a lower oxygen content (physioxia 1-9% oxygen) that is closer to hypoxia than the ambient air where cells are routinely cultured. With the ongoing characterization of a hypoxic eIF4F complex (eIF4FH), there is increasing interest in understanding oxygen-dependent translation initiation through the 5' mRNA cap. We have recently developed a human cell culture method to analyze cap-binding proteins that are regulated by oxygen availability. This protocol emphasizes that cell culture and lysis be performed in a hypoxia workstation to eliminate exposure to oxygen. Cells must be incubated for at least 24 hr for the liquid media to equilibrate with the atmosphere within the workstation. To avoid this limitation, pre-conditioned media (de-oxygenated) can be added to cells if shorter time points are required. Certain cap-binding proteins require interactions with a second base or can hydrolyze the m7GTP, therefore some cap interactors may be missed in the purification process. Agarose-linked to enzymatically resistant cap analogs may be substituted in this protocol. This method allows the user to identify novel oxygen-regulated translation factors involved in cap-dependent translation.

Analyse von Cap-Bindungsfähigkeit in Reaktion auf den Sauerstoff von eIF4E und eIF4E2 in einem m 7 GTP Affinitätssäule Die 1 und 2 Western - Blots von typischen m 7 GTP Affinitätsreinigung von zwei Haupt cap-Bindungsproteine in Reaktion auf Sauerstoff- Schwankungen in zwei humanen Zelllinien repräsentieren: primäre humane renale proximalen tubulären Epithelzellen (HRP...

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Analysis of Cap-binding Proteins in Human Cells Exposed to Physiological Oxygen Conditions

Here, we present human cell culture protocols to analyze translation initiation factors that bind the 5' cap of mRNA during physiological oxygen conditions. This method utilizes an Agarose-linked m7GTP cap analog and is suitable to investigate cap-binding factors and their interacting partners.

Analyse von Cap-bindende Proteine ​​in menschlichen Zellen zu Physiologische Sauerstoffbedingungen ausgesetzt

Translational control is a focal point of gene regulation, especially during periods of cellular stress. Cap-dependent translation via the eIF4F complex ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Genetics

7.7K Aufrufe.  University of Guelph. Here, we present human cell culture protocols to analyze translation initiation factors that bind the 5' cap of mRNA during physiological oxygen conditions. This method utilizes an Agarose-linked m7GTP cap analog and is suitable to investigate cap-binding factors and their interacting partners.

Serie: Analysis of Cap-binding Proteins in Human Cells Exposed to Physiological Oxygen Conditions

Measuring mRNA Levels Over Time During the Yeast S. cerevisiae Hypoxic Response

Complex changes in gene expression typically mediate a large portion of a cellular response. Each gene may change expression with unique kinetics as the gene is regulated by the particular timing of one of many stimuli, signaling pathways or secondary effects. In order to capture the entire gene expression response to hypoxia in the yeast S. cerevisiae, RNA-seq analysis was used to monitor the mRNA levels of all genes at specific times after exposure to hypoxia. Hypoxia was established by growing cells in ~100% N2 gas. Importantly, unlike other hypoxic studies, ergosterol and unsaturated fatty acids were not added to the media because these metabolites affect gene expression. Time points were chosen in the range of 0 - 4 h after hypoxia because that period captures the major changes in gene expression. At each time point, mid-log hypoxic cells were quickly filtered and frozen, limiting exposure to O2 and concomitant changes in gene expression. Total RNA was extracted from cells and used to enrich for mRNA, which was then converted to cDNA. From this cDNA, multiplex libraries were created and eight or more samples were sequenced in one lane of a next-generation sequencer. A post-sequencing pipeline is described, which includes quality base trimming, read mapping and determining the number of reads per gene. DESeq2 within the R statistical environment was used to identify genes that change significantly at any one of the hypoxic time points. Analysis of three biological replicates revealed high reproducibility, genes of differing kinetics and a large number of expected O2-regulated genes. These methods can be used to study how the cells of various organisms respond to hypoxia over time and adapted to study gene expression during other cellular responses.

Measuring mRNA Levels Over Time During the Yeast S. cerevisiae Hypoxic Response

Here, we present a protocol using RNA-seq to monitor mRNA levels over time during the hypoxic response of S. cerevisiae cells. This method can be adapted to analyze gene expression during any cellular response.

Messung der mRNA-Niveaus im Laufe der Zeit während der Hefe S. Cerevisiae hypoxischen Antwort

Complex changes in gene expression typically mediate a large portion of a cellular response. Each gene may change expression with unique kinetics as the ...

Forschung

Genetik

Tracking Hypoxic Signaling within Encapsulated Cell Aggregates

In Diabetes mellitus type 1, autoimmune destruction of the pancreatic &beta;-cells results in loss of insulin production and potentially lethal hyperglycemia. As an alternative treatment option to exogenous insulin injection, transplantation of functional pancreatic tissue has been explored1,2. This approach offers the promise of a more natural, long-term restoration of normoglycemia. Protection of the donor tissue from the host's immune system is required to prevent rejection and encapsulation is a method used to help achieve this aim.
Biologically-derived materials, such as alginate3 and agarose4, have been the traditional choice for capsule construction but may induce inflammation or fibrotic overgrowth5 which can impede nutrient and oxygen transport. Alternatively, synthetic poly(ethylene glycol) (PEG)-based hydrogels are non-degrading, easily functionalized, available at high purity, have controllable pore size, and are extremely biocompatible,6,7,8. As an additional benefit, PEG hydrogels may be formed rapidly in a simple photo-crosslinking reaction that does not require application of non-physiological temperatures6,7. Such a procedure is described here. In the crosslinking reaction, UV degradation of the photoinitiator, 1-[4-(2-Hydroxyethoxy)-phenyl]-2-hydroxy-2-methyl-1-propane-1-one (Irgacure 2959), produces free radicals which attack the vinyl carbon-carbon double bonds of dimethacrylated PEG (PEGDM) inducing crosslinking at the chain ends. Crosslinking can be achieved within 10 minutes. PEG hydrogels constructed in such a manner have been shown to favorably support cells7,9, and the low photoinitiator concentration and brief exposure to UV irradiation is not detrimental to viability and function of the encapsulated tissue10. While we methacrylate our PEG with the method described below, PEGDM can also be directly purchased from vendors such as Sigma.
An inherent consequence of encapsulation is isolation of the cells from a vascular network. Supply of nutrients, notably oxygen, is therefore reduced and limited by diffusion. This reduced oxygen availability may especially impact &beta;-cells whose insulin secretory function is highly dependent on oxygen11-13. Capsule composition and geometry will also impact diffusion rates and lengths for oxygen. Therefore, we also describe a technique for identifying hypoxic cells within our PEG capsules. Infection of the cells with a recombinant adenovirus allows for a fluorescent signal to be produced when intracellular hypoxia-inducible factor (HIF) pathways are activated14. As HIFs are the primary regulators of the transcriptional response to hypoxia, they represent an ideal target marker for detection of hypoxic signaling15. This approach allows for easy and rapid detection of hypoxic cells. Briefly, the adenovirus has the sequence for a red fluorescent protein (Ds Red DR from Clontech) under the control of a hypoxia-responsive element (HRE) trimer. Stabilization of HIF-1 by low oxygen conditions will drive transcription of the fluorescent protein (Figure 1). Additional details on the construction of this virus have been published previously15. The virus is stored in 10% glycerol at -80&deg; C as many 150 &mu;L aliquots in 1.5 mL centrifuge tubes at a concentration of 3.4 x 1010 pfu/mL. 
Previous studies in our lab have shown that MIN6 cells encapsulated as aggregates maintain their viability throughout 4 weeks of culture in 20% oxygen. MIN6 aggregates cultured at 2 or 1% oxygen showed both signs of necrotic cells (still about 85-90% viable) by staining with ethidium bromide as well as morphological changes relative to cells in 20% oxygen. The smooth spherical shape of the aggregates displayed at 20% was lost and aggregates appeared more like disorganized groups of cells. While the low oxygen stress does not cause a pronounced drop in viability, it is clearly impacting MIN6 aggregation and function as measured by glucose-stimulated insulin secretion15. Western blot analysis of encapsulated cells in 20% and 1% oxygen also showed a significant increase in HIF-1&alpha; for cells cultured in the low oxygen conditions which correlates with the expression of the DsRed DR protein.

A method for photo-encapsulation of cells in a crosslinked PEG hydrogel is described. Hypoxic signaling within encapsulated murine insulinoma (MIN6) aggregates is tracked using a fluorescent marker system. This system allows serial examination of cells within a hydrogel scaffold and correlation of hypoxic signaling with changes in cell phenotype.

Tracking Hypoxische Signaling in Encapsulated Zellaggregate

In Diabetes mellitus type 1, autoimmune destruction of the pancreatic &beta;-cells results in loss of insulin production and potentially lethal ...

Biotechnik

Proteomic Analysis of Human Macrophage Polarization Under a Low Oxygen Environment

Macrophages are innate immune cells involved in a number of physiological functions ranging from responses to infectious pathogens to tissue homeostasis. The various functions of these cells are related to their activation states, which is also called polarization. The precise molecular description of these various polarizations is a priority in the field of macrophage biology. It is currently acknowledged that a multidimensional approach is necessary to describe how polarization is controlled by environmental signals. In this report, we describe a protocol designed to obtain the proteomic signature of various polarizations in human macrophages. This protocol is based on a label-free quantification of macrophage protein expression obtained from in-gel fractionated and Lys C/trypsin-digested cellular lysis content. We also provide a protocol based on in-solution digestion and isoelectric focusing fractionation to use as an alternative. Because oxygen concentration is a relevant environmental parameter in tissues, we use this protocol to explore how atmospheric composition or a low oxygen environment affects the classification of macrophage polarization.

We present a protocol to obtain proteomic signatures of human macrophages and apply this to determination of the impact of a low oxygen environment on macrophage polarization.

Proteomic Analysen der menschlichen Makrophagen Polarisierung in einer sauerstoffarmen Umgebung

Macrophages are innate immune cells involved in a number of physiological functions ranging from responses to infectious pathogens to tissue homeostasis. ...

Biochemie

Stabile Isotopenverfolgung und LC-MS-Analyse zur Messung von DHODH- und SDH-Aktivitäten

Oxygen-Independent Assays to Measure Mitochondrial Function in Mammals

The flow of electrons in the mitochondrial electron transport chain (ETC) supports multifaceted biosynthetic, bioenergetic, and signaling functions in mammalian cells. As oxygen (O2) is the most ubiquitous terminal electron acceptor for the mammalian ETC, the O2 consumption rate is frequently used as a proxy for mitochondrial function. However, emerging research demonstrates that this parameter is not always indicative of mitochondrial function, as fumarate can be employed as an alternative electron acceptor to sustain mitochondrial functions in hypoxia. This article compiles a series of protocols that allow researchers to measure mitochondrial function independently of the O2 consumption rate. These assays are particularly useful when studying mitochondrial function in hypoxic environments. Specifically, we describe methods to measure mitochondrial ATP production, de novo pyrimidine biosynthesis, NADH oxidation by complex I, and superoxide production. In combination with classical respirometry experiments, these orthogonal and economical assays will provide researchers with a more comprehensive assessment of mitochondrial function in their system of interest.

Autor im Rampenlicht: Sauerstoffunabhängige Assays zur Messung der mitochondrialen Funktion bei Säugetieren  

Here, we present a compilation of assays to directly measure mitochondrial function in mammalian cells independently of their ability to consume molecular oxygen.

Sauerstoffunabhängige Assays zur Messung der mitochondrialen Funktion bei Säugetieren

The flow of electrons in the mitochondrial electron transport chain (ETC) supports multifaceted biosynthetic, bioenergetic, and signaling functions in ...

Respirometric Oxidative Phosphorylation Assessment in Saponin-permeabilized Cardiac Fibers

Investigation of mitochondrial function represents an important parameter of cardiac physiology as mitochondria are involved in energy metabolism, oxidative stress, apoptosis, aging, mitochondrial encephalomyopathies and drug toxicity. Given this, technologies to measure cardiac mitochondrial function are in demand. One technique that employs an integrative approach to measure mitochondrial function is respirometric oxidative phosphorylation (OXPHOS) analysis.
The principle of respirometric OXPHOS assessment is centered around measuring oxygen concentration utilizing a Clark electrode. As the permeabilized fiber bundle consumes oxygen, oxygen concentration in the closed chamber declines. Using selected substrate-inhibitor-uncoupler titration protocols, electrons are provided to specific sites of the electron transport chain, allowing evaluation of mitochondrial function. Prior to respirometric analysis of mitochondrial function, mechanical and chemical preparatory techniques are utilized to permeabilize the sarcolemma of muscle fibers. Chemical permeabilization employs saponin to selectively perforate the cell membrane while maintaining cellular architecture.
This paper thoroughly describes the steps involved in preparing saponin-skinned cardiac fibers for oxygen consumption measurements to evaluate mitochondrial OXPHOS. Additionally, troubleshooting advice as well as specific substrates, inhibitors and uncouplers that may be used to determine mitochondria function at specific sites of the electron transport chain are provided. Importantly, the described protocol may be easily applied to cardiac and skeletal tissue of various animal models and human samples.

Saponin-permeabilized fiber preparation in conjunction with respirometric oxidative phosphorylation analysis provides integrative assessment of mitochondrial function. Mitochondrial respiration in physiological and pathological states can reflect various regulatory influences including mitochondrial interactions, morphology and biochemistry.

Respirometrische Oxidative Phosphorylierung Assessment in Saponin-permeabilisierten Cardiac Fibers

Investigation of mitochondrial function represents an important parameter of cardiac physiology as mitochondria are involved in energy metabolism, ...

Biologie

Intra-cardiac Side-Firing Light Catheter for Monitoring Cellular Metabolism using Transmural Absorbance Spectroscopy of Perfused Mammalian Hearts

Absorbance spectroscopy of cardiac muscle provides non-destructive assessment of cytosolic and mitochondrial oxygenation via myoglobin and cytochrome absorbance respectively. In addition, numerous aspects of the mitochondrial metabolic status such as membrane potential and substrate entry can also be estimated. To perform cardiac wall transmission optical spectroscopy, a commercially available side-firing optical fiber catheter is placed in the left ventricle of the isolated perfused heart as a light source. Light passing through the heart wall is collected with an external optical fiber to perform optical spectroscopy of the heart in near real- time. The transmission approach avoids numerous surface scattering interference occurring in widely used reflection approaches. Changes in transmural absorbance spectra were deconvolved using a library of chromophore reference spectra, providing quantitative measures of all the known cardiac chromophores simultaneously. This spectral deconvolution approach eliminated intrinsic errors that may result from using common dual wavelength methods applied to overlapping absorbance spectra, as well as provided a quantitative evaluation of the goodness of fit. A custom program was designed for data acquisition and analysis, which permitted the investigator to monitor the metabolic state of the preparation during the experiment. These relatively simple additions to the standard heart perfusion system provide a unique insight into the metabolic state of the heart wall in addition to conventional measures of contraction, perfusion, and substrate/oxygen extraction.

Here we introduce a method for using an intra-ventricle optical catheter in perfused hearts to perform absorbance spectroscopy across the heart wall. The data obtained provides robust information on tissue oxygen tension as well as substrate utilization and membrane potential simultaneously with cardiac performance measures in this ubiquitous preparation.

Intrakardialer Side-Firing Light Katheter zur Überwachung des Zellstoffwechsels mit transmuraaler Absorptionsspektroskopie von perfundierten Säugetierherzen

Absorbance spectroscopy of cardiac muscle provides non-destructive assessment of cytosolic and mitochondrial oxygenation via myoglobin and cytochrome ...

Biochemical Titration of Glycogen In vitro

Glycogen is the main energetic polymer of glucose in vertebrate animals and plays a crucial role in whole body metabolism as well as in cellular metabolism. Many methods to detect glycogen already exist but only a few are quantitative. We describe here a method using the Abcam Glycogen assay kit, which is based on specific degradation of glycogen to glucose by glucoamylase. Glucose is then specifically oxidized to a product that reacts with the OxiRed probe to produce fluorescence. Titration is accurate, sensitive and can be achieved on cell extracts or tissue sections. However, in contrast to other techniques, it does not give information about the distribution of glycogen in the cell. As an example of this technique, we describe here the titration of glycogen in two cell lines, Chinese hamster lung fibroblast CCL39 and human colon carcinoma LS174, incubated in normoxia (21% O2) versus hypoxia (1% O2). We hypothesized that hypoxia is a signal that prepares cells to synthesize and store glycogen in order to survive1.

Biochemical Titration of Glycogen In vitro

We describe here an accurate, reproducible and convenient biochemical method for titration of glycogen in vitro. This technique uses the Abcam Glycogen assay kit and is based on successive hydrolysis of glycogen to glucose and glucose titration by fluorescence.

Biochemische Titration von Glykogen<em&gt; In-vitro-</em

Glycogen is the main energetic polymer of glucose in vertebrate animals and plays a crucial role in whole body metabolism as well as in cellular ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

Analyse der globalen RNA-Synthese auf der Einzelzellebene folgende Hypoxie

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

Analyse von Cap-bindende Proteine in menschlichen Zellen zu Physiologische Sauerstoffbedingungen ausgesetzt

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Messung der mRNA-Niveaus im Laufe der Zeit während der Hefe S. Cerevisiae hypoxischen Antwort

Tracking Hypoxische Signaling in Encapsulated Zellaggregate

Proteomic Analysen der menschlichen Makrophagen Polarisierung in einer sauerstoffarmen Umgebung

Sauerstoffunabhängige Assays zur Messung der mitochondrialen Funktion bei Säugetieren

Sauerstoffunabhängige Assays zur Messung der mitochondrialen Funktion bei Säugetieren

Sauerstoffunabhängige Assays zur Messung der mitochondrialen Funktion bei Säugetieren

Respirometrische Oxidative Phosphorylierung Assessment in Saponin-permeabilisierten Cardiac Fibers

Intrakardialer Side-Firing Light Katheter zur Überwachung des Zellstoffwechsels mit transmuraaler Absorptionsspektroskopie von perfundierten Säugetierherzen

Biochemische Titration von Glykogen

Analyse der globalen RNA-Synthese auf der Einzelzellebene folgende Hypoxie

Analyse von Cap-bindende Proteine ​​in menschlichen Zellen zu Physiologische Sauerstoffbedingungen ausgesetzt

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Messung der mRNA-Niveaus im Laufe der Zeit während der Hefe S. Cerevisiae hypoxischen Antwort

Tracking Hypoxische Signaling in Encapsulated Zellaggregate

Proteomic Analysen der menschlichen Makrophagen Polarisierung in einer sauerstoffarmen Umgebung

Sauerstoffunabhängige Assays zur Messung der mitochondrialen Funktion bei Säugetieren

Sauerstoffunabhängige Assays zur Messung der mitochondrialen Funktion bei Säugetieren

Sauerstoffunabhängige Assays zur Messung der mitochondrialen Funktion bei Säugetieren

Respirometrische Oxidative Phosphorylierung Assessment in Saponin-permeabilisierten Cardiac Fibers

Intrakardialer Side-Firing Light Katheter zur Überwachung des Zellstoffwechsels mit transmuraaler Absorptionsspektroskopie von perfundierten Säugetierherzen

Biochemische Titration von Glykogen

Analyse der globalen RNA-Synthese auf der Einzelzellebene folgende Hypoxie

Analyse von Cap-bindende Proteine in menschlichen Zellen zu Physiologische Sauerstoffbedingungen ausgesetzt