Preparação in vitro de explantes de cartilagem articular bovina em maturação ativa para imagens de contraste de fase de raios-X

Este protocolo descreve a preparação de cartilagem articular bovina in vitro para imagens em alta resolução com raios-X. Esses explantes sofrem ativamente de maturação pós-natal. Descrevemos aqui as etapas necessárias desde a biópsia até a análise dos dados da imagem de contraste de fase de raios-X 3D, passando pela cultura do explante, fixação tecidual e preparo síncrotron.

Compreender os mecanismos que sustentam a maturação pós-natal da cartilagem articular é de importância crucial para projetar a próxima geração de estratégias de engenharia de tecidos e potencialmente reparar a cartilagem doente ou danificada. Em geral, a maturação pós-natal da cartilagem articular, que é uma mudança total na estrutura do colágeno e na função do tecido para acomodar o crescimento do organismo, ocorre em uma escala de tempo que varia de meses a anos. Por outro lado, a dissolução da organização estrutural da cartilagem que também ocorre em longas escalas de tempo é a marca registrada da degeneração do tecido. Nossa capacidade de estudar esses processos biológicos em detalhes foi aprimorada pelas descobertas de que os fatores de crescimento podem induzir a maturação precoce in vitro da cartilagem articular imatura. As mudanças relacionadas ao desenvolvimento e à doença que ocorrem na articulação envolvem osso e cartilagem e a capacidade de co-imagem desses tecidos aumentaria significativamente nossa compreensão de seus papéis interligados.

A visualização simultânea de alterações de tecidos moles, cartilagens e ossos é hoje um desafio a ser superado pelas modalidades convencionais de imagem pré-clínica utilizadas para o acompanhamento da doença articular. Os métodos tridimensionais de imagem de contraste de fase de raios-X (PCI) estão em desenvolvimento contínuo há 20 anos devido ao alto desempenho para imagens de objetos de baixa densidade e sua capacidade de fornecer informações adicionais em comparação com as imagens convencionais de raios-X.

Neste protocolo detalhamos o procedimento utilizado em nossos experimentos desde a biópsia da cartilagem, geração de cartilagem amadurecida in vitro até a análise dos dados da imagem coletada por meio de imagens de contraste de fase de raios-X.

A cartilagem articular imatura é um suporte adequado para iniciar alterações morfológicas, estruturais e biomoleculares¹ para obter uma função articular específica do adulto. A principal mudança é a reorganização das fibrilas de colágeno de uma que exibe uma orientação paralela em relação à superfície da cartilagem imatura para uma em que as fibrilas mais profundas no tecido são perpendiculares na cartilagem madura. A pseudo-estratificação da cartilagem adulta é evidente através da reorganização dos condrócitos residentes ao longo da direção da orientação das fibrilas de colágeno, com células na superfície em forma de disco e paralelas à superfície e nas zonas mais profundas, células tornando-se progressivamente maiores e organizadas em colunas. Sabe-se que a maturação pós-natal ocorre ao longo de muitos meses e é essencialmente concluída no final da puberdade, a longa escala de tempo foi pensada para tornar o estudo dessa importante transição de desenvolvimento, na melhor das hipóteses, difícil ou tecnicamente impossível de estudar em detalhes². Alguns avanços na solução desse problema foram feitos por meio da constatação de que o fator de crescimento de fibroblastos-2 e o fator de crescimento transformador-β1 juntos são capazes de induzir alterações fisiológicas e morfológicas importantes que replicam a maturação da cartilagem articular ^2,3 (Figura 1). A maturação in vitro induzida pelo fator de crescimento ocorre dentro de três semanas e não requer nenhum insumo biomecânico. Após a cultura, a expressão do colágeno tipo II é significativamente reduzida e a proporção de ligações cruzadas de colágeno trivalente maduro para divalente imaturo aumenta, como é visto na cartilagem em maturação. Além disso, a organização da matriz extracelular e das fibrilas de colágeno é mais próxima daquela observada na cartilagem madura, embora essa faceta da transição não seja completa. Bioquimicamente, a composição da cartilagem tratada com fator de crescimento está mimetizando uma cartilagem articular adulta³.

O modelo usado no artigo é baseado em um in vitro Cultura de explantes de 4 ou 6 mm de diâmetro que foram excisados em condições estéreis da face lateral do côndilo medial da articulação metacarpofalângica de novilhos bovinos machos imaturos (7 dias de idade). Uma fina camada de cartilagem calcificada e osso subcondral foi mantida na face basal de cada explante. A cartilagem articular foi cultivada em meio soro-livre clássico de Dulbecco modificado com Eagles (glicose alta 4,5 g/L) no qual foram adicionados insulina-transferrina-selênio (ITS), tampão HEPES 10 mM pH 7,4, ácido ascórbico e gentamicina 50 μg/mL. Este meio de cultura é suplementado com fator de crescimento de fibroblastos 2 de 100 ng/mL (FGF-2) e fator de crescimento transformador β1 de 10 ng/mL (TGF-β1) que são reabastecidos a cada três dias com mudanças de meio². A maturação altamente acelerada da cartilagem é induzida pela combinação de fatores de crescimento. Essas alterações ocorrem dentro de 21 dias. A estimulação do fator de crescimento também induz apoptose e reabsorção do aspecto basal e proliferação celular nos condrócitos superficiais³. A composição do meio de cultura é descrita em Tabela 1. Seguindo o modelo desenvolvido por Khan et al. 2011², os explantes de cartilagem articular são cultivados com TGF-β1 na concentração de 10 ng/μL e FGF2 na concentração de 100 ng/μL (concentrações de estoque de 10 μg/mL e 100 μg/mL dissolvidos em solução salina tamponada com fosfato/0,1% de BSA). Utiliza-se 1 μL de cada fator de crescimento por 1 ml do meio. O DMEM-F12 com L-glutamina e glicose elevada é um meio artificial que, uma vez suplementado com insulina, transferrina e selênio (ITS), ácido ascórbico, gentamicina e HEPES, fornece uma suplementação completa do meio com todos os requisitos fisiológicos de crescimento específicos para as diferentes linhagens celulares e culturas de explantes. O DMEM-F12 é composto por vários sais inorgânicos diversos (ou seja, NaCl, KCl, CaCl₂, MgCl₂, NaH₂PO₄), glicose, aminoácidos (fontes de nitrogênio), vitaminas, cofatores e água. Esses sais fornecem insumos energéticos adequados para sustentar a sobrevivência celular e o crescimento normal em cultura. Os íons minerais contribuem para manter a osmolaridade próxima ao ambiente fisiológico natural. A maior concentração de glicose (4,5 g/L) é usada porque os condrócitos respiram principalmente através da glicólise. A suplementação do meio F12 é utilizada porque oferece várias fontes de sulfato, CuSO₄, FeSO₄, ZnSO₄ e MgSO₄ necessário para a síntese de glicosaminoglicanos sulfatados. Conforme verificado por indicadores coloridos (aqui vermelho de fenol) e CO₂/HCO^-₃ tampão combinado com fosfatos, o pH permanece constante em um valor próximo a 7,4. A principal via respiratória utilizada pelos condrócitos é a glicólise, onde o ácido lático é o produto final que causa um aumento no pH, portanto, na ausência de forças biomecânicas que ajudariam a remover o ácido lático produzido localmente, o HEPES atua para manter um ambiente tamponado para processos fisiológicos. A gentamicina é um antibiótico aminoglicosídeo que controla a contaminação bacteriana externa por meio da inibição do crescimento. O ácido ascórbico é usado como complemento médio por sua ação antioxidante⁴. O ácido ascórbico é um cofator para enzimas, prolil hidroxilases, que funcionam para hidroxilar resíduos de prolina no colágeno, estabilizando sua estrutura helicoidal tripla. A transferrina geralmente serve como antioxidante extracelular (toxicidade e reduções de ROS)^5,6. Também é adicionado ao meio de cultura por sua capacidade de fornecer e facilitar o armazenamento e transporte de ferro extracelular em cultura de células. A transferrina se liga ao ferro com tanta força em condições fisiológicas que praticamente não existe ferro livre para catalisar a produção de radicais livres⁷. A sinalização do hormônio insulina a partir de seu receptor ligado aumenta a absorção de vários elementos, como glicose, aminoácidos. Também está envolvido em vários processos, como transporte intracelular, lipogênese, síntese de proteínas e ácidos nucleicos. A insulina tem um efeito promotor de crescimento. O selênio está presente adicionalmente na solução composta "insulina-transferrina-selênio", como selenito de sódio. É usado principalmente como cofator para proteínas (seleno-) como a gluthatione peroxidase (GPX), como agente antioxidante suplementar na cultura. Em in vitro condrócitos articulares, o ITS parece aumentar a proliferação celular e a preservação do fenótipo, inibindo a expressão gênica relacionada à desdiferenciação celular e diferenciação hipertrófica⁸. Fatores de crescimento como o fator de crescimento de fibroblastos-2 e o fator de crescimento transformador-β1 são adicionados ao meio de cultura. Eles são usados para induzir e regular a diferenciação, crescimento, cura e desenvolvimento celular^2,3. FGF-2 e TGF-β1 em combinação também promovem potentemente a proliferação celular em células e tecidos cultivados⁹.

Este modelo de maturação in vitro da cartilagem articular é útil por três razões principais. Primeiro, a transição acelerada da fase de desenvolvimento neste modelo nos permite estudar mudanças imperceptíveis que ocorrem ao longo de muitos meses em modelos in vivo, como a expressão elevada de lisil oxidase-L1 durante a maturação¹⁰. Em segundo lugar, a engenharia de tecidos da cartilagem articular sofre com o fato de que é produzida cartilagem com morfologia e estrutura isotrópicas que são funcionalmente deficientes quando transplantadas para articulações para reparar defeitos focais. Entender como induzir mudanças maturacionais acelerará o desenvolvimento de dispositivos implantáveis totalmente funcionais. Em terceiro lugar e pertinente a este estudo, existem condições articulares degenerativas, como a doença de Kashin-Beck, que ocorrem durante a infância e que levam a deformidades articulares graves na idade adulta. Esta doença em particular está fortemente associada a áreas geográficas (China) com deficiências endêmicas de selênio e iodo potencialmente afetando dezenas de milhões de habitantes 11,12,13. O exame de defeitos esqueléticos na doença de Kashin-Beck mostra que ela ocorre peri-pubertalmente, implicando perturbação dos processos maturacionais esqueléticos. Portanto, para entender melhor o papel do selênio na cartilagem articular (CA), é necessário um modelo robusto para o crescimento e desenvolvimento da cartilagem. Um modelo de maturação induzido por fator de crescimento in vitro fornece um ponto de partida útil para estudos sobre o crescimento e metabolismo da cartilagem articular durante a maturação na presença ou ausência de íons selênio 14,15,16. Nosso conhecimento dos efeitos da deficiência de selênio (Se) em processos biológicos complexos e inter-relacionados permanece muito pobre. O principal problema reside no fato de que o selênio continua sendo um elemento a ser estudado devido à sua faixa de ação restritiva (concentração necessária entre 40 e 400 μg/kg¹⁷) e à concentração muito baixa envolvida. O modelo de maturação acelerada usando cartilagem bovina imatura oferece uma capacidade sem precedentes de observar as mudanças biológicas que ocorrem durante uma fase importante do desenvolvimento. A concentração de Se nos organismos é rigidamente controlada, e este modelo é um ponto de partida para o desenvolvimento de técnicas de imagem que permitem seu rastreamento preciso durante a maturação. Essas técnicas poderiam então ser uma ferramenta poderosa para estudar estratégias para prevenir a degradação da CA e, potencialmente, desenvolver a base de novas terapias baseadas em medicina regenerativa.

A visualização simultânea de alterações de tecidos moles, cartilagens e ossos é um grande desafio nas modalidades convencionais de imagem pré-clínica. Isso seria, de fato, uma ajuda importante para o acompanhamento da doença articular^18,19 . Como exemplo, a microtomografia computadorizada de raios X convencional (μCT) apresenta baixo desempenho para tecidos moles que limitam seu uso à representação de defeitos ósseos, osteófitos e visualização indireta da cartilagem. A ressonância magnética (MRI), por outro lado, é convencionalmente empregada para imagens de tecidos moles, apesar de sua baixa capacidade de renderizar com precisão alterações no osso (por exemplo, microcalcificações) durante os estágios iniciais das doenças. A capacidade de ser sensível aos ossos e cartilagens e de distinguir as células constitutivas da cartilagem, os condrócitos, é de tremenda importância. A Imagem de Contraste de Fase (PCI) baseia-se na propriedade de que o índice de refração de raios-X dos materiais pode ser mil vezes maior do que o índice de absorção de elementos leves. Isso gera um contraste maior para os tecidos moles em comparação com os métodos convencionais baseados na absorção da sola. Portanto, a ICP é capaz de visualizar todos os tecidos que constituem a articulação com representação concomitante de tecidos de alta absorção (por exemplo, ossos) e menos absorventes (por exemplo, cartilagem fibrosa, ligamentos, tendões, menisco e tecidos moles associados (membranas sinoviais e músculo))18,19,20,21.

Conforme demonstrado na ^ref.20, a angioplastia de raios-X supera as outras modalidades de imagem pré-clínica para cartilagem. O objetivo deste protocolo é detalhar o procedimento e mostrar alguns resultados representativos. O esquema do efeito dos fatores de crescimento no explante de cartilagem imatura é mostrado na Figura 1.

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê de Pesquisa Ética da Universidade de Swansea e os materiais de biópsia foram adquiridos sob licença do Departamento de Meio Ambiente, Alimentação e Assuntos Rurais (DEFRA), Reino Unido. Este protocolo segue as diretrizes de cuidados com os animais de nossas instituições.

1. Culturas de explante

1. Preparo dos explantes de couro cabeludo de pernas bovinas
   1. Prepare protetor absorvente e bisturi, bisturi cirúrgico padrão com lâmina de bisturi #10.
   2. Pulverize todos os materiais com solução de etanol a 70%.
   3. Mergulhe a perna bovina (novilhos bovinos machos com 7 dias de idade obtidos no matadouro com aprovação veterinária) com água para remover todo o sangue e lama.
   4. Limpe a perna com sabão e esfregue com uma escova.
   5. Quando estiver adequadamente limpo, borrife a perna com etanol a 70%.
   6. Coloque-o em um papel absorvente.
   7. Corte ao redor dos pés com um bisturi.
   8. Trace uma linha delicada ao longo do comprimento da perna.
   9. Tome cuidado extra na zona articular.
   10. Remova a pele da perna cuidadosamente ao longo da linha do bisturi longitudinal.
   11. Coloque os resíduos (pele, lenço usado, papel e luvas) em um saco de lixo clínico.
   12. Limpe/escove a perna com sabão e esterilize com etanol novamente quando a pele for removida.
   13. Não danifique a região próxima à cavidade articular. Se a cavidade estiver aberta ou danificada com infiltração de sangue, ela não é mais estéril e a perna não pode ser usada.
   14. Coloque a perna em uma folha de alumínio que foi pulverizada com etanol a 70%.
   15. Coloque as luvas de látex de tamanho apropriado sobre as extremidades da perna para evitar a saída de sangue da extremidade proximal ou possível contaminação do casco.
   16. Descarte os resíduos de maneira adequada, seguindo as regras institucionais.
2. Extração e cultura de explante
   NOTA: Os explantes devem ser obtidos da parte interna da junta (Figura 2, dois primeiros estágios). Para serem comparáveis, quatro (ou seis) explantes devem ser perfurados da mesma zona para aplicar os quatro (ou seis) tratamentos diferentes em amostras que possuam quase a mesma forma e características.
   1. Abra a coifa de fluxo laminar 25 min antes de usar, limpe com álcool 70%.
   2. Coloque o meio de cultura para aquecer em banho-maria.
   3. Prepare uma placa de 24 poços com 1,5 mL de meio básico, apenas DMEM-F12 (meio de lavagem) em cada poço.
   4. Prepare outra placa de poço com 1,5 mL de meio de cultura completo. Armazenar em incubadora de cultura a 37 °C até o uso
   5. Prepare o material em uma prateleira: um tubo universal com etanol 70% e outro tubo universal com meio de lavagem.
   6. Prepare um bisturi e um punção de biópsia de 4 ou 6 mm (colocado no tubo universal de álcool).
   7. Coloque os tubos e os materiais sob o capô.
   8. Coloque um protetor absorvente borrifado com etanol 70% sob o capô.
   9. Prepare alguns lenços pulverizados com etanol 70%.
   10. Pegue uma placa de dissecação, cubra-a com papel alumínio.
   11. Retire os mesmos pés, previamente preparados, da geladeira (4 °C) e borrife-os com etanol a 70%.
   12. Descarte sacos perigosos e clínicos perto do capô para autoclavar os resíduos posteriormente.
   13. Pulverize o pé com etanol 70%.
   14. Mova a articulação para encontrar a linha média da articulação onde a incisão deve ser feita. Faça isso sob o capô.
   15. Pegue o bisturi estéril.
   16. Corte cuidadosamente ao longo da linha média seguindo o contorno das bordas da junta. Não toque na cartilagem do côndilo medial da articulação metacarpofalângica.
   17. Corte cuidadosamente o ligamento quando a articulação for aberta.
   18. Jogue fora a parte inferior dos pés em um saco de autoclave.
   19. Remova todos os outros tecidos para expor toda a cartilagem da articulação (Figura 2).
       NOTA: Tenha cuidado para não tocar em nada com os pés.
   20. Coloque o bisturi e o punção de biópsia em álcool e depois no meio de lavagem.
   21. Faça alguns círculos com este soco (4-5 por face) com alguma força ao longo das faces internas dos ossos.
   22. Coloque o bio-punch em álcool quando terminar para limpá-lo.
   23. Pegue um bisturi e corte (trace uma linha) entre cada círculo e ao longo da linha central do osso.
   24. Para retirar o explante de cartilagem, corte verticalmente em uma das bordas da biópsia circular e, em seguida, corte horizontalmente no osso subcondral com muito cuidado.
   25. Para remover o explante de cartilagem cortado horizontalmente abaixo da linha de punção ao longo do osso subcondral e da cartilagem calcificada, os explantes sairão para fora.
       NOTA: Os explantes devem ter uma espessura uniforme, se possível.
   26. Coloque o explante na placa do poço cheia de 1,5 mL de meio de lavagem.
       NOTA: Sempre realize o controle experimental e o tratamento de explantes provenientes do mesmo local na articulação.
   27. Verifique se o explante está bem orientado corretamente. A superfície do explante deve estar voltada para cima e a parte óssea subcondral do explante deve estar voltada para o fundo da placa do poço.
   28. Mantenha a placa do poço fechada entre cada biópsia.
   29. Remova o meio de lavagem.
   30. Lave novamente com meio de lavagem. Deixe em meio de lavagem por 2-3 h. Resíduos ósseos, o sangue terá tempo para fluir no meio.
   31. Transferir os explantes para uma nova placa de alvéolo contendo o meio de cultura completo. Tenha cuidado: não toque em nada com a pipeta.
   32. Verifique se os explantes ainda estão na posição correta (osso voltado para a parte inferior da placa do poço).
   33. Limpe tudo e jogue fora o lixo clínico em local adequado.
   34. Uma vez que os explantes são colocados em cultura em uma incubadora a 37 °C com 5% de CO₂, troque o meio de cultura do explante a cada dois dias por meio fresco quente para atender às diversas necessidades das células/tecidos. Verifique se os explantes ainda estão na posição correta (osso voltado para a parte inferior da placa do poço).
3. Fixação da amostra (opcional)
   NOTA: Execute esta etapa apenas no final da cultura de células, o que significa após 3 semanas de cultura. Os explantes atingiram então o estágio de maturação.
   1. Lave os explantes com DMEM-F12 com uma pipeta sob a capa de cultura de tecidos.
   2. Lave os explantes duas vezes com PBS com uma pipeta sob a capa de cultura de tecidos.
   3. Fixe-os durante a noite a 4 ° C mergulhando em 10% de NBFS (solução salina de formalina tampão neutro).
   4. Colocar os explantes fixos em PBS num tubo de microcentrífuga
   5. Conservar os explantes a 4 °C. Os explantes fixos podem permanecer nessas condições por até 6 meses.

2. Preparação da amostra para a sessão de imagem

1. Use pontas de plástico cônicas de tamanho apropriado (geralmente ponta de 1 mL) em relação à amostra e ao campo de visão da câmera.
2. Sele a ponta do cone (aquecendo-a com uma chama) para ter um recipiente de amostra à prova d'água.
3. Encha a ponta com PBS. Segure a amostra com uma pinça e insira-a no tubo. Remova a bolha de ar por agitações lentas.
4. Monte o tubo no estágio de tomografia e alinhe-o fazendo radiografias simples.

3. Sessão de imagem de contraste de fase de raios-X

1. Coloque o detector a 2.5 m da amostra
2. Defina a energia do fóton de raios-X para 17 keV usando um sistema de cristal de silício duplo dentro de uma geometria de Bragg-Bragg.
3. O detector Mount Imaging consistia em uma câmera CMOS científica²² em uma óptica com um tamanho de voxel isotrópico resultante de 3,5 μm na imagem 3D.
4. Use uma tela cintiladora de oxissulfeto de gadolínio de 60 μm de espessura para converter o raio-X em luz visível
5. Coleta de dados: Adquira 2000 projeções durante uma varredura de 360° da amostra com um tempo de exposição de 2 s para cada projeção.
6. Use um algoritmo de recuperação de fase para extrair o sinal de fase conforme descrito na ^ref.23. O algoritmo usa um conhecimento a priori da distribuição complexa do índice de refração dentro da amostra. A hipótese principal, não verificada aqui, é que há um material para reconstruir. Neste caso particular, a razão entre a refração e o índice de absorção foi fixada em 1.200, que foi observada experimentalmente para o melhor comprometimento para a visualização óssea e cartilaginosa.
7. Use o algoritmo de reconstrução de TC de projeção traseira filtrada padrão usando uma implementação baseada em GPU (Unidade de Processamento Gráfico) de código aberto do código PyHST2²⁴.

Uma configuração de imagem baseada em propagação simples foi usada²⁵ , conforme esboçado na Figura 3. Na imagem baseada em propagação síncrotron, um feixe de raios-X coerente ilumina o objeto, dando origem a mudanças de fase espacialmente variáveis¹⁹. À medida que o feixe de raios X se propaga após a amostra, a frente de onda distorcida gera um padrão de características. Ao analisar esses padrões...

Apresentamos um estudo completo desde o preparo da amostra até a visualização das imagens, incluindo os protocolos de aquisição de dados, para o estudo da cartilagem articular de maturação rápida in vitro . Os resultados de uma sessão de imagem síncrotron mostraram a bondade do modelo.

No modelo aqui apresentado, algumas observações e limites devem ser mencionados. Essa "maturação acelerada" ocorre dentro de 21 dias após o cultivo. Para...

Nenhum.

Os autores agradecem ao ESRF por fornecer tempo de feixe interno. Os autores gostariam de agradecer a Eric Ziegler pelas discussões científicas. O experimento PCI descrito foi conduzido na linha de luz BM05 do European Synchrotron Radiation Facility (ESRF), Grenoble, França. O CB agradece ao Explora'doc Auvergne Rhone Alpes e às bolsas de estudo da Universidade de Swansea e da Université Grenoble Alpes pelo financiamento de parte deste estudo.