Preparación in vitro de explantes de cartílago articular bovino en maduración activa para la obtención de imágenes con contraste en fase de rayos X

Este protocolo describe la preparación del cartílago articular bovino in vitro para la obtención de imágenes en alta resolución con rayos X. Estos explantes se someten activamente a la maduración postnatal. Describimos aquí los pasos necesarios desde la biopsia hasta el análisis de datos de las imágenes de contraste de fase de rayos X en 3D, pasando por el cultivo de explantes, la fijación de tejidos y la preparación del sincrotrón.

Comprender los mecanismos que sustentan la maduración postnatal del cartílago articular es de crucial importancia para diseñar la próxima generación de estrategias de ingeniería de tejidos y potencialmente reparar el cartílago enfermo o dañado. En general, la maduración postnatal del cartílago articular, que es un cambio total en la estructura del colágeno y la función del tejido para acomodar el crecimiento del organismo, ocurre en una escala de tiempo que va de meses a años. Por el contrario, la disolución de la organización estructural del cartílago, que también se produce a lo largo de largos períodos de tiempo, es el sello distintivo de la degeneración de los tejidos. Nuestra capacidad para estudiar estos procesos biológicos en detalle se ha visto reforzada por los hallazgos de que los factores de crecimiento pueden inducir una maduración precoz in vitro del cartílago articular inmaduro. Los cambios relacionados con el desarrollo y la enfermedad que ocurren en la articulación involucran hueso y cartílago, y la capacidad de co-imagen de estos tejidos aumentaría significativamente nuestra comprensión de sus funciones entrelazadas.

La visualización simultánea de los cambios en los tejidos blandos, cartílagos y huesos es hoy en día un reto a superar para las modalidades convencionales de imagen preclínica utilizadas para el seguimiento de las enfermedades articulares. Los métodos tridimensionales de imágenes de contraste de fase (PCI) de rayos X han estado en constante desarrollo durante 20 años debido al alto rendimiento para obtener imágenes de objetos de baja densidad y su capacidad para proporcionar información adicional en comparación con las imágenes de rayos X convencionales.

En este protocolo detallamos el procedimiento utilizado en nuestros experimentos, desde la biopsia del cartílago, la generación de cartílago maduro in vitro hasta el análisis de los datos de la imagen recogida mediante contraste de fase de rayos X.

El cartílago articular inmaduro es un soporte adecuado para iniciar cambios morfológicos, estructurales y biomoleculares¹ con el fin de obtener una función articular adulta específica. El cambio principal es la reorganización de las fibrillas de colágeno, que pasan de una que muestra una orientación paralela con respecto a la superficie en el cartílago inmaduro a una en la que las fibrillas más profundas del tejido son perpendiculares en el cartílago maduro. La pseudoestratificación del cartílago adulto es evidente a través de la reorganización de los condrocitos residentes a lo largo de la dirección de la orientación de las fibrillas de colágeno, con células en la superficie en forma de disco y paralelas a la superficie, y en las zonas más profundas, las células se vuelven progresivamente más grandes y organizadas en columnas. Se sabe que la maduración postnatal ocurre a lo largo de muchos meses y se completa esencialmente al final de la pubertad, se pensó que la larga escala de tiempo hacía que el estudio de esta importante transición del desarrollo en el mejor de los casos fuera difícil o técnicamente imposible de estudiar en detalle². Algunos avances en la solución de este problema se han realizado a través del hallazgo de que el factor de crecimiento de fibroblastos-2 y el factor de crecimiento transformante-β1 juntos son capaces de inducir cambios fisiológicos y morfológicos importantes que replican la maduración del cartílago articular ^2,3 (Figura 1). La maduración in vitro inducida por el factor de crecimiento se produce en tres semanas y no requiere ningún aporte biomecánico. Después del cultivo, la expresión de colágeno tipo II se reduce significativamente y la proporción de enlaces cruzados de colágeno trivalente maduro a divalente inmaduro aumenta, como se observa en el cartílago maduro. Además, la organización de la matriz extracelular y las fibrillas de colágeno es más cercana a la observada en el cartílago maduro, aunque esta faceta de transición no está completa. Bioquímicamente, la composición del cartílago tratado con factor de crecimiento es similar a la de un cartílago articular adulto³.

El modelo utilizado en el artículo se basa en un in vitro Cultivo de explantes de 4 o 6 mm de diámetro que fueron extirpados en condiciones estériles de la cara lateral del cóndilo medial de la articulación metacarpofalángica de novillos bovinos machos inmaduros (7 días de edad). Se mantuvo una fina capa de cartílago calcificado y hueso subcondral en la cara basal de cada explante. El cartílago articular se cultivó en un medio clásico sin suero, Dulbecco's Eagles, modificado (glucosa alta 4,5 g/L), en el que se añadieron insulina-transferrina-selenio (ITS), 10 mM de tampón HEPES, pH 7,4, ácido ascórbico y gentamicina 50 μg/mL. Este medio de cultivo se complementa con 100 ng/mL de factor de crecimiento de fibroblastos 2 (FGF-2) y 10 ng/mL de factor de crecimiento transformante β1 (TGF-β1) que se reponen cada tercer día con cambios de medio². La maduración altamente acelerada del cartílago es inducida por la combinación de factores de crecimiento. Estos cambios se producen en un plazo de 21 días. La estimulación del factor de crecimiento induce adicionalmente la apoptosis y la resorción del aspecto basal y la proliferación celular en los condrocitos de superficie³. La composición del medio de cultivo se describe en Tabla 1. Siguiendo el modelo desarrollado por Khan et al. 2011², los explantes de cartílago articular se cultivan con TGF-β1 a una concentración de 10 ng/μL y FGF2 a una concentración de 100 ng/μL (concentraciones de stock de 10 μg/mL y 100 μg/mL disueltos en solución salina tamponada con fosfato/0,1% BSA). Se utiliza 1 μL de cada factor de crecimiento por 1 mL del medio. DMEM-F12 con L-glutamina y alta glucosa es un medio artificial que, una vez suplementado con insulina, transferrina y selenio (ITS), ácido ascórbico, gentamicina y HEPES, proporciona una suplementación completa del medio con todos los requerimientos fisiológicos de crecimiento específicos de las diferentes líneas celulares y cultivos de explantes. DMEM-F12 se compone de varias sales inorgánicas diversas (es decir, NaCl, KCl, CaCl₂, MgCl₂, NaH₂PO₄), glucosa, aminoácidos (fuentes de nitrógeno), vitaminas, cofactores y agua. Esas sales proporcionan insumos energéticos adecuados para sostener la supervivencia celular y el crecimiento normal en cultivo. Los iones minerales contribuyen a mantener la osmolaridad cerca del entorno fisiológico natural. La mayor concentración de glucosa (4,5 g/L) se utiliza ya que los condrocitos respiran principalmente a través de la glucólisis. La suplementación con medio F12 se utiliza porque ofrece varias fuentes de sulfato, CuSO₄, FeSO₄, ZnSO₄ y MgSO₄ necesario para la síntesis de glicosaminoglicanos sulfatados. Como se verifica mediante indicadores de colores (aquí rojo fenol) y CO₂/HCO^-₃ tampón combinado con fosfatos, el pH permanece constante a un valor cercano a 7,4. La principal vía respiratoria utilizada por los condrocitos es la glucólisis, donde el ácido láctico es el producto final que provoca un aumento del pH, por lo tanto, en ausencia de fuerzas biomecánicas que ayudarían a eliminar el ácido láctico producido localmente, HEPES actúa para mantener un entorno amortiguado para los procesos fisiológicos. La gentamicina es un antibiótico aminoglucósido que controla la contaminación bacteriana externa mediante la inhibición del crecimiento. El ácido ascórbico se utiliza como complemento medio por su acción antioxidante⁴. El ácido ascórbico es un cofactor de las enzimas, las prolil hidroxilasas, que funcionan para hidroxilar los residuos de prolina en el colágeno, estabilizando su estructura triple helicoidal. La transferrina suele servir como antioxidante extracelular (toxicidad y reducciones de ROS)^5,6. También se añade al medio de cultivo por su capacidad para proporcionar y facilitar el almacenamiento y transporte de hierro extracelular en el cultivo celular. La transferrina se une al hierro tan fuertemente en condiciones fisiológicas que prácticamente no existe hierro libre para catalizar la producción de radicales libres⁷. La señalización de la hormona insulina desde su receptor unido aumenta la absorción de varios elementos como la glucosa y los aminoácidos. También interviene en varios procesos, como el transporte intracelular, la lipogénesis, la síntesis de proteínas y ácidos nucleicos. La insulina tiene un efecto promotor del crecimiento. El selenio está presente adicionalmente en la solución compuesta "insulina-transferrina-selenio", como selenito de sodio. Se utiliza principalmente como cofactor para proteínas (seleno-) como la gluthationa peroxidasa (GPX), como agente antioxidante suplementario en el cultivo. En in vitro condrocitos articulares, ITS parece mejorar la proliferación celular y la preservación del fenotipo al inhibir la expresión génica relacionada con la desdiferenciación celular y la diferenciación hipertrófica⁸. Al medio de cultivo se añaden factores de crecimiento como el factor de crecimiento de fibroblastos-2 y el factor de crecimiento transformante β1. Se utilizan para inducir y regular la diferenciación, el crecimiento, la curación y el desarrollo celular^2,3. FGF-2 y TGF-β1 en combinación también promueven potentemente la proliferación celular en células y tejidos cultivados⁹.

Este modelo de maduración in vitro del cartílago articular es útil por tres razones principales. En primer lugar, la transición acelerada de la fase de desarrollo en este modelo nos permite estudiar cambios imperceptibles que ocurren a lo largo de muchos meses en modelos in vivo, como la expresión elevada de lysl oxidasa-L1 durante la maduración¹⁰. En segundo lugar, la ingeniería de tejidos del cartílago articular se ve afectada por el hecho de que se produce un cartílago con una morfología y estructura isotrópica que es funcionalmente deficiente cuando se trasplanta a las articulaciones para reparar defectos focales. Comprender cómo inducir cambios madurativos acelerará el desarrollo de dispositivos implantables completamente funcionales. En tercer lugar, y pertinente para este estudio, existen afecciones articulares degenerativas, como la enfermedad de Kashin-Beck, que ocurren durante la infancia y que conducen a deformidades articulares graves en la edad adulta. Esta enfermedad en particular está fuertemente asociada a áreas geográficas (China) con deficiencias endémicas de selenio y yodo que pueden afectar a decenas de millones de habitantes 11,12,13. El examen de los defectos esqueléticos en la enfermedad de Kashin-Beck muestra que ocurre peripuberal, lo que implica una perturbación de los procesos de maduración esqueléticos. Por lo tanto, para comprender mejor el papel del selenio en el cartílago articular (CA), se requiere un modelo sólido para el crecimiento y desarrollo del cartílago. Un modelo de maduración inducido por el factor de crecimiento in vitro proporciona un punto de partida útil para los estudios sobre el crecimiento y el metabolismo del cartílago articular durante la maduración en presencia o ausencia de iones de selenio 14,15,16. Nuestro conocimiento de los efectos de la deficiencia de selenio (Se) en procesos biológicos complejos e interrelacionados sigue siendo muy escaso. El principal problema radica en el hecho de que el selenio sigue siendo un elemento a estudiar debido a su rango de acción restrictiva (concentración requerida entre 40 y 400 μg/kg¹⁷) y a la muy baja concentración involucrada. El modelo de maduración acelerada que utiliza cartílago bovino inmaduro ofrece una capacidad sin precedentes para observar los cambios biológicos que ocurren durante una fase importante del desarrollo. La concentración de SS en los organismos está estrictamente controlada, y este modelo es un punto de partida para desarrollar técnicas de imagen que permitan su seguimiento preciso durante la maduración. Estas técnicas podrían ser una herramienta poderosa para estudiar estrategias para prevenir la degradación de la CA y, potencialmente, para desarrollar la base de nuevas terapias basadas en la medicina regenerativa.

La visualización simultánea de los cambios en los tejidos blandos, cartílagos y huesos es un desafío importante en las modalidades convencionales de imágenes preclínicas. De hecho, esto sería una ayuda importante para el seguimiento de las enfermedades articulares^18,19 . Por ejemplo, la microtomografía computarizada de rayos X (μCT) convencional presenta un rendimiento deficiente para los tejidos blandos que limita su uso a la representación de defectos óseos, osteofitos y visualización indirecta del cartílago. Por otro lado, la resonancia magnética (RMN) se emplea convencionalmente para obtener imágenes de tejidos blandos a pesar de su escasa capacidad para reproducir con precisión los cambios en el hueso (por ejemplo, microcalcificaciones) durante las etapas iniciales de las enfermedades. La capacidad de ser sensible a los huesos y cartílagos, y de distinguir las células constitutivas del cartílago, los condrocitos, es de tremenda importancia. Las imágenes de contraste de fase (PCI) se basan en la propiedad de que el índice de refracción de los rayos X de los materiales puede ser mil veces mayor que el índice de absorción de los elementos ligeros. Esto genera un mayor contraste para los tejidos blandos en comparación con los métodos convencionales basados en la absorción única. Por lo tanto, la ICP es capaz de obtener imágenes de todos los tejidos que constituyen la articulación teniendo representación concurrente de tejidos de alta absorción (p. ej., huesos) y menos absorbentes (p. ej., cartílago fibroso, ligamentos, tendones, meniscos y tejidos blandos asociados (membranas sinoviales y músculo)⁾18,19,20,21.

Como se ha demostrado en la ^ref.20, la ICP de rayos X supera a las otras modalidades de imagen preclínica para el cartílago. El propósito de este protocolo es detallar el procedimiento y mostrar algunos resultados representativos. En la Figura 1 se muestra el esquema del efecto de los factores de crecimiento en el explante de cartílago inmaduro.

Todos los métodos descritos aquí han sido aprobados por el Comité de Investigación Ética de la Universidad de Swansea y los materiales de biopsia se adquirieron bajo licencia del Departamento de Medio Ambiente, Alimentación y Asuntos Rurales (DEFRA) del Reino Unido. Este protocolo sigue los lineamientos de cuidado animal de nuestras instituciones.

1. Explantar cultivos

1. Preparación de los explantes de cuero cabelludo de patas bovinas
   1. Prepare un protector absorbente y un bisturí, bisturí quirúrgico estándar con hoja de bisturí # 10.
   2. Rocíe todos los materiales con una solución de etanol al 70%.
   3. Remojar la pierna bovina (novillos bovinos machos de 7 días obtenidos del matadero con autorización veterinaria) con agua para eliminar toda la sangre y el barro.
   4. Limpie la pierna con jabón y frote con un cepillo.
   5. Cuando esté adecuadamente limpio, rocíe la pierna con etanol al 70%.
   6. Colócalo sobre un papel absorbente.
   7. Corta alrededor de los pies con un bisturí.
   8. Traza una línea delicada a lo largo de la pierna.
   9. Tenga especial cuidado en la zona de las articulaciones.
   10. Retire la piel de la pierna con cuidado a lo largo de la línea de bisturí a lo largo.
   11. Coloque los residuos (piel, pañuelos usados, papel y guantes) en una bolsa de residuos clínicos.
   12. Limpiar/cepillar la pierna con jabón y esterilizar con etanol de nuevo cuando se haya retirado la piel.
   13. No dañe la región cercana a la cavidad articular. Si la cavidad se abre o se daña con la infiltración de sangre, ya no es estéril y no se puede usar la pierna.
   14. Coloque la pierna en un papel de aluminio que haya sido rociado con etanol al 70%.
   15. Coloque los guantes de látex del tamaño adecuado sobre los extremos de la pierna para evitar la salida de sangre por el extremo proximal o la posible contaminación del casco.
   16. Eliminar los materiales de desecho de la manera adecuada siguiendo las normas institucionales.
2. Extracción y cultivo de explantes
   NOTA: Los explantes deben obtenerse de la parte interna de la junta (Figura 2, dos primeras etapas). Para que las condiciones sean comparables, se deben perforar cuatro (o seis) explantes de la misma zona para aplicar los cuatro (o seis) tratamientos diferentes en muestras que posean casi la misma forma y características.
   1. Abra la campana de flujo laminar 25 min antes de usar, limpie con alcohol al 70%.
   2. Ponga el medio de cultivo a calentar en un baño de agua.
   3. Prepare una placa de 24 pocillos con 1.5 mL de medio básico, solo DMEM-F12 (medio de lavado) en cada pocillo.
   4. Prepare otra placa de pocillo con 1,5 mL de medio de cultivo completo. Almacenar en incubadora de cultivo a 37 °C hasta su uso
   5. Prepare el material en una rejilla: un tubo universal con etanol al 70% y otro tubo universal con medio de lavado.
   6. Prepare un bisturí y un punzón de biopsia de 4 o 6 mm (colocado en el tubo universal con alcohol).
   7. Coloque los tubos y los materiales debajo del capó.
   8. Coloque un protector absorbente rociado con etanol al 70% debajo del capó.
   9. Prepare algunos pañuelos rociados con etanol al 70%.
   10. Tome una placa de disección, cúbrala con papel de aluminio.
   11. Saca de la nevera los mismos pies previamente preparados (4 °C) y rocíalos con etanol al 70%.
   12. Deseche las bolsas peligrosas y clínicas cerca de la campana para esterilizar los desechos en autoclave más tarde.
   13. Rocíe el pie con etanol al 70%.
   14. Mueva la articulación para encontrar la línea media de la articulación donde se debe hacer la incisión. Hazlo bajo el capó.
   15. Toma el bisturí estéril.
   16. Corte con cuidado a lo largo de la línea media siguiendo el contorno de los bordes de la junta. No toque el cartílago del cóndilo medial de la articulación metacarpofalángica.
   17. Cortar con cuidado el ligamento cuando se abra la articulación.
   18. Tira la parte inferior de los pies en una bolsa de autoclave.
   19. Retirar todos los demás tejidos para exponer todo el cartílago de la articulación (Figura 2).
       NOTA: Tenga cuidado de no tocar nada con los pies.
   20. Coloque el bisturí y el punzón de biopsia en alcohol y luego en el medio de lavado.
   21. Haz algunos círculos con este puñetazo (4-5 por cara) con algo de fuerza a lo largo de las caras internas de los huesos.
   22. Coloque el bio-punch en alcohol cuando termine para limpiarlo.
   23. Toma un bisturí y corta (traza una línea) entre cada círculo y a lo largo de la línea central del hueso.
   24. Para extraer el explante de cartílago, corte verticalmente en uno de los bordes de la biopsia circular, luego corte horizontalmente en el hueso subcondral con mucho cuidado.
   25. Para eliminar el explante de cartílago, corte horizontalmente debajo de la línea de punzón a lo largo del hueso subcondral y el cartílago calcificado, los explantes saldrán.
       NOTA: Los explantes deben tener un grosor uniforme, si es posible.
   26. Coloque el explante en la placa de pocillo llena con 1,5 mL de medio de lavado.
       NOTA: Realizar siempre el control experimental y el tratamiento de los explantes procedentes de la misma ubicación en la unión.
   27. Comprobar que el explante está bien orientado correctamente. La superficie del explante debe estar hacia arriba y la parte ósea subcondral del explante debe mirar hacia el fondo de la placa del pocillo.
   28. Mantenga la placa del pocillo cerrada entre cada biopsia.
   29. Retire el medio de lavado.
   30. Lavar de nuevo con medio de lavado. Dejar en medio de lavado durante 2-3 h. Residuos óseos, la sangre tendrá tiempo de fluir en el medio.
   31. Transfiera los explantes a una nueva placa de pocillo que contenga el medio de cultivo completo. Tenga cuidado: no toque nada con la pipeta.
   32. Compruebe que los explantes siguen en la posición correcta (hueso orientado hacia la parte inferior de la placa del pocillo).
   33. Limpie todo y deseche los desechos clínicos en un lugar adecuado.
   34. Una vez que los explantes se colocan en cultivo en una incubadora a 37 °C con 5% de CO₂, cambie el medio de cultivo del explante cada dos días con medio fresco y tibio para satisfacer las diversas necesidades de las células/tejidos. Compruebe que los explantes siguen en la posición correcta (hueso orientado hacia la parte inferior de la placa del pocillo).
3. Fijación de la muestra (opcional)
   NOTA: Realice este paso solo después del final del cultivo celular, es decir, después de 3 semanas de cultivo. Los explantes han alcanzado entonces la etapa de maduración.
   1. Lave los explantes con DMEM-F12 con una pipeta debajo de la campana de cultivo de tejidos.
   2. Lave los explantes dos veces con PBS con una pipeta debajo de la campana de cultivo de tejidos.
   3. Fijarlos durante la noche a 4 °C sumergiéndolos en un 10% de NBFS (Neutral Buffer Formalin Saline).
   4. Coloque los explantes fijos en PBS en un tubo de microcentrífuga
   5. Almacenar los explantes a 4 °C. Los explantes fijos pueden permanecer en estas condiciones hasta 6 meses.

2. Preparación de la muestra para la sesión de imágenes

1. Utilice puntas cónicas de plástico de un tamaño adecuado (generalmente punta de 1 mL) con respecto a la muestra y al campo de visión de la cámara.
2. Selle la punta del cono (calentándola con una llama) para tener un recipiente de muestra a prueba de agua.
3. Llene la punta con PBS. Sostenga la muestra con pinzas e insértela en el tubo. Retire las burbujas de aire agitando lentamente.
4. Monte el tubo en la platina de tomografía y alinéelo tomando radiografías simples.

3. Sesión de imágenes de contraste de fase de rayos X

1. Coloque el detector a 2,5 m de la muestra
2. Establezca la energía del fotón de rayos X en 17 keV utilizando un sistema de doble cristal de silicio dentro de una geometría de Bragg-Bragg.
3. El detector de imágenes de montaje consistió en una cámara CMOS^{científica 22} en una óptica con un tamaño de vóxel isotrópico resultante de 3,5 μm en la imagen 3D.
4. Utilice una pantalla centelleadora de oxisulfuro de gadolinio de 60 μm de grosor para convertir los rayos X en luz visible
5. Recopilación de datos: Adquiera 2000 proyecciones durante un escaneo de 360° de la muestra con un tiempo de exposición de 2 s para cada proyección.
6. Utilice el algoritmo de recuperación de fase para extraer la señal de fase como se describe en la ^ref.23. El algoritmo utiliza un conocimiento a priori de la compleja distribución del índice de refracción dentro de la muestra. La hipótesis principal, no verificada aquí, es que hay un material a reconstruir. En este caso particular, la relación entre la refracción y el índice de absorción se estableció en 1.200, lo que se observó experimentalmente como el mejor compromiso para la visualización de hueso y cartílago.
7. Utilice el algoritmo estándar de reconstrucción de TC de retroproyección filtrada mediante una implementación de código abierto basada en la unidad de procesamiento de gráficos (GPU) del código^{PyHST2 24}.

Se utilizó una configuración sencilla de imágenes basada en la propagación^{25 como} se muestra en la Figura 3. En las imágenes basadas en la propagación de sincrotrón, un haz coherente de rayos X ilumina el objeto, dando lugar a cambios de fase que varían espacialmente¹⁹. A medida que el haz de rayos X se propaga después de la muestra, el frente de onda distorsionado genera un patrón de características...

Presentamos un estudio completo desde la preparación de la muestra hasta la visualización de la imagen, incluyendo los protocolos de adquisición de datos, para el estudio del cartílago articular de maduración rápida in vitro . Los resultados de una sesión de imágenes de sincrotrón mostraron la bondad del modelo.

En el modelo que aquí se presenta, hay que mencionar algunas observaciones y límites. Esta "maduración acelerada" ocurre dentro d...

Ninguno.

Los autores agradecen al ESRF por proporcionar tiempo de transmisión interno. Los autores desean agradecer a Eric Ziegler por las discusiones científicas. El experimento PCI descrito se llevó a cabo en la línea de luz BM05 de la Instalación Europea de Radiación Sincrotrón (ESRF), Grenoble, Francia. CB agradece a Explora'doc Auvergne Rhône Alpes y a las becas de la Universidad de Swansea y la Université Grenoble Alpes por financiar parte de este estudio.