A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Method Article
פרוטוקול זה מתאר הכנת סחוס מפרקי בקר במבחנה להדמיה ברזולוציה גבוהה עם צילומי רנטגן. אקספלנטים אלה עוברים באופן פעיל התבגרות לאחר הלידה. אנו מתארים כאן את השלבים הדרושים מהביופסיה לניתוח נתונים של הדמיית ניגודיות שלב רנטגן תלת מימדית, עוברת דרך תרבית אקספלנט, קיבוע רקמות והכנת סינכרוטרון.
הבנת המנגנונים העומדים בבסיס התבגרות הסחוס המפרקי לאחר הלידה היא בעלת חשיבות מכרעת לתכנון הדור הבא של אסטרטגיות הנדסת רקמות ופוטנציאל לתיקון סחוס חולה או פגום. באופן כללי, התבגרות לאחר הלידה של הסחוס המפרקי, שהיא שינוי סיטונאי במבנה הקולגן ובתפקוד הרקמה כדי להתאים לצמיחת האורגניזם, מתרחשת על פני טווח זמן שנע בין חודשים לשנים. לעומת זאת, פירוק הארגון המבני של הסחוס המתרחש גם על פני טווחי זמן ארוכים הוא סימן ההיכר של ניוון רקמות. היכולת שלנו לחקור את התהליכים הביולוגיים הללו בפירוט שופרה על ידי הממצאים שגורמי גדילה יכולים לגרום להתבגרות מוקדמת במבחנה של סחוס מפרקי לא בשל. השינויים ההתפתחותיים והקשורים למחלות המתרחשים במפרק מערבים עצם וסחוס ויכולת לדמות רקמות אלה תגדיל משמעותית את ההבנה שלנו לגבי תפקידיהם השזורים זה בזה.
הדמיה בו-זמנית של שינויים ברקמות רכות, סחוס ועצמות היא כיום אתגר שיש להתגבר עליו עבור שיטות הדמיה פרה-קליניות קונבנציונליות המשמשות למעקב אחר מחלות מפרקים. שיטות הדמיית ניגודיות פאזה של קרני רנטגן תלת מימדיות (PCI) נמצאות בפיתוח תמידי במשך 20 שנה בשל ביצועים גבוהים להדמיית עצמים בצפיפות נמוכה ויכולתם לספק מידע נוסף בהשוואה להדמיית רנטגן קונבנציונלית.
בפרוטוקול זה אנו מפרטים את ההליך המשמש בניסויים שלנו מביופסיה של הסחוס, יצירת סחוס בוגר במבחנה ועד לניתוח נתונים של תמונה שנאספה באמצעות הדמיית ניגודיות פאזה של קרני רנטגן.
סחוס מפרקי לא בשל הוא תמיכה מספקת ליזום שינויים מורפולוגיים, מבניים וביו-מולקולריים1 על מנת להשיג תפקוד ספציפי למפרק בוגר. השינוי העיקרי הוא ארגון מחדש של סיבי קולגן מאחד המציג אוריינטציה מקבילה ביחס לפני השטח בסחוס לא בוגר לכזה שבו סיבים עמוקים יותר ברקמה מאונכים בסחוס בוגר. פסאודו-ריבוד של סחוס בוגר ניכר באמצעות ארגון מחדש של כונדרוציטים תושבים לאורך כיוון כיוון סיבי הקולגן, כאשר תאים על פני השטח דמויי דיסק ומקבילים לפני השטח ובאזורים העמוקים יותר, התאים הופכים בהדרגה גדולים יותר ומאורגנים בעמודות. ידוע כי התבגרות לאחר הלידה מתרחשת על פני חודשים רבים ומסתיימת למעשה בסוף ההתבגרות המינית, טווח הזמן הארוך נחשב כמקשה על חקר המעבר ההתפתחותי החשוב הזה במקרה הטוב או בלתי אפשרי מבחינה טכנית לחקור בפירוט2. התקדמות מסוימת בפתרון לבעיה זו נעשתה באמצעות הממצא שגורם גדילה פיברובלסטים-2 וגורם גדילה טרנספורמטיבי-β1 יחד מסוגלים לגרום לשינויים פיזיולוגיים ומורפולוגיים חשובים המשכפלים את הבשלת הסחוס המפרקי 2,3 (איור 1). התבגרות במבחנה הנגרמת על ידי גורם גדילה מתרחשת תוך שלושה שבועות ואינה דורשת קלט ביומכני כלשהו. לאחר התרבית, ביטוי קולגן מסוג II מופחת באופן משמעותי והיחס בין קישורים צולבים של קולגן דו-ערכי בוגר לדו-ערכי לא בוגר גדל כפי שניתן לראות בסחוס מתבגר. כמו כן, הארגון של המטריצה החוץ-תאית וסיבי הקולגן קרוב יותר לזה שנראה בסחוס בוגר, אם כי היבט זה של המעבר אינו שלם. מבחינה ביוכימית, הרכב הסחוס שטופל בגורם גדילה מחקה סחוס מפרקי בוגר3.
המודל המשמש במאמר מבוסס על in vitro תרבית של צמחים בקוטר 4 או 6 מ"מ שנכרתו בתנאים סטריליים מההיבט הצדדי של הקונדיל המדיאלי המפרק metacarpophalangeal מבקר זכר לא בוגר (בן 7 ימים). שכבה דקה של סחוס מסוייד ועצם תת-כונדרלית נשמרה על ההיבט הבסיסי של כל אקספלנט. הסחוס המפרקי תורבת במדיום קלאסי נטול סרום, מדיום הנשרים המותאם של דולבקו (גלוקוז גבוה 4.5 גרם/ליטר) בו נוספו אינסולין-טרנספרין-סלניום (ITS), 10 מ"מ HEPES buffer pH 7.4, חומצה אסקורבית ו-50 מיקרוגרם/מ"ל גנטמיצין. מדיום תרבית זה מתווסף לגורם גדילה פיברובלסטים 2 (FGF-2) ו-10 ננוגרם/מ"ל גורם גדילה טרנספורמציה β1 (TGF-β1) המתחדשים כל שלושה ימים עם שינויי מדיה2. הבשלת סחוס מואצת מאוד נגרמת על ידי שילוב גורמי גדילה. שינויים אלה מתרחשים תוך 21 יום. גירוי גורמי גדילה גורם בנוסף גורם לאפופטוזיס וספיגה מההיבט הבסיסי והתפשטות תאים בכונדרוציטים על פני השטח3. הרכב מדיום התרבות מתואר ב טבלה 1. בעקבות המודל שפותח על ידי Khan et al. 20112צמחי סחוס מפרקיים מתורבתים עם TGF-β1 בריכוז של 10 ננוגרם/מיקרוליטר ו-FGF2 בריכוז של 100 ננוגרם/מיקרוליטר (ריכוזי מלאי 10 מיקרוגרם/מ"ל ו-100 מיקרוגרם/מ"ל מומסים בתמיסת מלח חוצצת פוספט/0.1% BSA)., 1 מיקרוליטר מכל גורם גדילה משמש לכל 1 מ"ל של המדיום. DMEM-F12 עם L-גלוטמין וגלוקוז גבוה הוא מדיום מלאכותי אשר, לאחר תוספת אינסולין, טרנספרין וסלניום (ITS), חומצה אסקורבית, גנטמיצין ו-HEPES מספק תוספת מדיום מלאה עם כל דרישות הגידול הפיזיולוגיות הספציפיות לקווי התאים השונים ולתרביות אקספלנט. DMEM-F12 מורכב ממספר מלחים אנאורגניים מגוונים (כלומר, NaCl, KCl, CaCl2, MgCl,2נה,2פו4), גלוקוז, חומצות אמינו (מקורות חנקן), ויטמינים, גורמים משלימים ומים. מלחים אלה מספקים תשומות אנרגטיות נאותות לשמירה על הישרדות התאים וצמיחה תקינה בתרבית. היונים המינרליים תורמים לשמירה על האוסמולריות קרוב לסביבה הפיזיולוגית הטבעית. הריכוז הגבוה יותר של גלוקוז (4.5 גרם/ליטר) משמש כאשר כונדרוציטים נושמים בעיקר באמצעות גליקוליזה. נעשה שימוש בתוסף בינוני F12 מכיוון שהוא מציע מספר מקורות של סולפט, CuSO4FeSO,4ZnSO,4 ו-MgSO4 נדרש לסינתזה של גליקוזאמינוגליקן גופרתי. כפי שנבדק על ידי אינדיקטורים צבעוניים (כאן פנול אדום) ו- CO2/HCO-3 בשילוב עם פוספטים, ה-pH נשאר קבוע בערך קרוב ל-7.4. מסלול הנשימה העיקרי המשמש את הכונדרוציטים הוא גליקוליזה כאשר חומצה לקטית היא התוצר הסופי הגורם לעלייה ב-pH, לכן, בהיעדר כוחות ביומכניים שיסייעו בהסרת חומצה לקטית המיוצרת מקומית, HEPES פועל לשמירה על סביבה מבודדת לתהליכים פיזיולוגיים. גנטמיצין הוא אנטיביוטיקה אמינוגליקוזידית השולטת בזיהום חיידקי חיצוני באמצעות עיכוב גדילה. חומצה אסקורבית משמשת כהשלמה בינונית לפעולתה האנטי-אוקסידנטית4. חומצה אסקורבית היא קו-פקטור לאנזימים, פרוליל הידרוקסילאז, המתפקדים להידרוקסילט שאריות פרולין בקולגן המייצב את המבנה הסליל המשולש שלו. הטרנספרין משמש בדרך כלל כנוגד חמצון חוץ-תאי (רעילות והפחתת ROS)5,6. הוא מתווסף גם למדיום התרבות בשל יכולתו לספק ולהקל על אחסון והובלת ברזל חוץ-תאי בתרבית תאים. טרנספרין קושר ברזל כל כך חזק בתנאים פיזיולוגיים שלמעשה לא קיים ברזל חופשי כדי לזרז את ייצור הרדיקלים החופשיים7. איתות הורמון האינסולין מהקולטן הקשור שלו מגביר את הספיגה של מספר אלמנטים כמו גלוקוז, חומצות אמינו. הוא מעורב גם במספר תהליכים כגון הובלה תוך-תאית, ליפוגנזה, חלבון וסינתזות של חומצות גרעין. לאינסולין יש השפעה מעודדת גדילה. סלניום קיים בנוסף בתמיסה המרוכבת "אינסולין-טרנספרין-סלניום", כנתרן סלניט. הוא משמש בעיקר כקופקטור לחלבונים (seleno-) כגון gluthatione peroxidase (GPX), כחומר נוגד חמצון משלים בתרבית. ב in vitro נראה כי כונדרוציטים מפרקיים, ITS משפרים את התפשטות התאים ושימור הפנוטיפ על ידי עיכוב ביטוי הגנים הקשורים לדה-דיפרנציאציה תאית והתמיינות היפרטרופית8. גורמי גדילה כמו גורם גדילה פיברובלסטים-2 וגורם גדילה טרנספורמטיבי-β1 מתווספים למדיום התרבית. הם משמשים כדי לגרום ולווסת התמיינות תאים, גדילה, ריפוי והתפתחות2,3. FGF-2 ו-TGF-β1 בשילוב גם מקדמים בעוצמה שגשוג תאים בתאים וברקמות מתורבתים9.
מודל התבגרות מבחנה זה של סחוס מפרקי שימושי משלוש סיבות עיקריות. ראשית, מעבר השלב ההתפתחותי המואץ במודל זה מאפשר לנו לחקור שינויים בלתי מורגשים המתרחשים לאורך חודשים רבים במודלים in vivo כגון ביטוי מוגבר של lysl oxidase-L1 במהלך ההתבגרות10. שנית, הנדסת רקמות של סחוס מפרקי סובלת מהעובדה שנוצר סחוס בעל מורפולוגיה ומבנה איזוטרופיים שהוא חסר תפקודי כאשר הוא מושתל במפרקים לתיקון פגמים מוקדיים. ההבנה כיצד לגרום לשינויים בשלים תאיץ את הפיתוח של מכשירים מושתלים מתפקדים במלואם. שלישית ורלוונטית למחקר זה, ישנם מצבי מפרקים ניווניים כמו מחלת קאשין-בק המתרחשים במהלך הילדות ומובילים לעיוותים חמורים במפרקים בבגרות. מחלה מסוימת זו קשורה מאוד לאזורים גיאוגרפיים (סין) עם מחסור אנדמי בסלניום ויוד שעלול להשפיע על עשרות מיליוני תושבים 11,12,13. בחינת ליקויי שלד במחלת קאשין-בק מראה כי היא מתרחשת לפני גיל ההתבגרות, מה שמרמז על הפרעה בתהליכי התבגרות השלד. לכן, כדי להבין עוד יותר את תפקידו של סלניום בסחוס מפרקי (AC) נדרש מודל חזק לצמיחה והתפתחות של סחוס. מודל התבגרות המושרה על ידי גורם גדילה במבחנה מספק נקודת התחלה שימושית למחקרים על צמיחה ומטבוליזם של סחוס מפרקי במהלך ההתבגרות בנוכחות או היעדר יוני סלניום 14,15,16. הידע שלנו על ההשפעות של מחסור בסלניום (Se) על תהליכים ביולוגיים מורכבים וקשורים זה לזה נותר דל מאוד. הבעיה העיקרית נעוצה בעובדה שסלניום נותר יסוד למחקר בשל טווח הפעולה המגביל שלו (הריכוז הנדרש בין 40 ל-400 מיקרוגרם/ק"ג17) והריכוז הנמוך מאוד הכרוך בכך. מודל ההתבגרות המואצת באמצעות סחוס בקר לא בוגר מציע יכולת חסרת תקדים להסתכל על שינויים ביולוגיים המתרחשים בשלב חשוב של ההתפתחות. ריכוז ה-Se באורגניזמים נשלט היטב, ומודל זה הוא נקודת מוצא לפיתוח טכניקות הדמיה המאפשרות מעקב מדויק אחריו במהלך ההתבגרות. טכניקות אלה יכולות להיות כלי רב עוצמה לחקר אסטרטגיות למניעת פירוק AC ופוטנציאלית לפתח את הבסיס לטיפולים חדשים מבוססי רפואה רגנרטיבית.
הדמיה סימולטנית של שינויים ברקמות רכות, סחוס ועצם היא אתגר מרכזי בשיטות הדמיה פרה-קליניות קונבנציונליות. זה אכן יהיה עזרה חשובה למעקב אחר מחלות מפרקים18,19 . כדוגמה, מיקרו טומוגרפיה ממוחשבת קונבנציונלית של רנטגן (μCT) מציגה ביצועים גרועים לרקמות רכות המגבילים את השימוש בה לתיאור פגמים בעצם, אוסטאופיטים והדמיה עקיפה של סחוס. הדמיית תהודה מגנטית (MRI), לעומת זאת, משמשת באופן קונבנציונלי להדמיית רקמות רכות למרות יכולתה הנמוכה לעבד במדויק שינויים בעצם (למשל, מיקרו-הסתיידויות) בשלבים הראשונים של מחלות. היכולת להיות רגיש לעצמות ולסחוסים, ולהבחין בין התאים המרכיבים את הסחוס, כונדרוציטים, היא בעלת חשיבות עצומה. הדמיית ניגודיות פאזה (PCI) מסתמכת על המאפיין שמדד השבירה של קרני רנטגן של חומרים יכול להיות גדול פי אלף ממדד הספיגה של יסודות אור. זה מייצר ניגודיות גבוהה יותר לרקמות רכות בהשוואה לשיטות הקונבנציונליות המבוססות על ספיגת הסוליה. לכן, PCI מסוגל לדמות את כל הרקמות המרכיבות את המפרק בעלות ייצוג בו-זמני של רקמות סופגות גבוה (למשל, עצמות) ופחות סופגות (למשל, סחוס סיבי, רצועות, גידים, מניסקוס ורקמות רכות קשורות (ממברנות סינוביאליות ושרירים))18,19,20,21.
כפי שהודגם ב-ref.20, PCI רנטגן עולה על שיטות ההדמיה הפרה-קליניות האחרות לסחוס. מטרת פרוטוקול זה היא לפרט את ההליך ולהראות כמה תוצאות מייצגות. תוכנית ההשפעה של גורמי גדילה על צמח סחוס לא בשל מוצגת באיור 1.
כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי ועדת המחקר האתי של אוניברסיטת סוונסי וחומרי הביופסיה נרכשו ברישיון מהמחלקה לאיכות הסביבה, מזון ועניינים כפריים (DEFRA), בריטניה. פרוטוקול זה עוקב אחר הנחיות הטיפול בבעלי חיים של המוסדות שלנו.
1. להוציא תרביות
2. הכנה לדוגמא לפגישת ההדמיה
3. מפגש הדמיית ניגודיות שלב רנטגן
נעשה שימוש במערך הדמיה פשוט מבוסס התפשטות25 כפי ששורטט באיור 3. בהדמיה מבוססת התפשטות סינכרוטרון, קרן רנטגן קוהרנטית מאירה את האובייקט, וגורמת לשינויי פאזה משתנים מרחבית19. כאשר קרן הרנטגן מתפשטת לאחר הדגימה, חזית הגל המעוותת יוצ?...
הצגנו מחקר שלם מהכנת הדגימה ועד להדמיית התמונה, כולל פרוטוקולי איסוף הנתונים, לחקר סחוס מפרקי המתבגר במהירות במבחנה . תוצאות של מפגש הדמיית סינכרוטרון הראו את הטוב של המודל.
במודל המוצג כאן יש להזכיר כמה תצפיות ומגבלות. "התבגרות מואצת" זו מתרחשת תוך 21 ?...
ללא.
המחברים מודים ל-ESRF על מתן זמן אלומה בבית. המחברים רוצים להודות לאריק זיגלר על הדיונים המדעיים. ניסוי ה-PCI המתואר נערך בקו האלומה BM05 של המתקן האירופי לקרינת סינכרוטרון (ESRF), גרנובל, צרפת. CB מודה ל-Explora'doc Auvergne Rhone Alpes ולמלגות מאוניברסיטת סוונסי ואוניברסיטת גרנובל אלפ על מימון חלק ממחקר זה.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Material : Biological products | |||
DMEM/F-12 (1:1) (1X) + GlutaMAX Dulbecco's Modified Eagle Medium F-12 Nutriment Mixture (Ham) 500mL | Gibco by life technologies | 31331-028 | |
Gentamicin Reagent Solution, 50 mg/mL | Gibco by life technologies | 15750-060 | |
HEPES, special preparation, 1M, pH 7.5 filtered | Sigma | H-3375 | |
ITS, Insulin-Transferrin-Selenium | Gibco by life technologies | 51500-057 | |
L-Ascorbic Acid-2-Phosphate, sesquimagnesium salf hydrate, 95% | Sigma | A8960-5G | |
Neutral Buffer Formalin (NBF) | Sigma Aldrich | HT501128 | |
phosphate buffered saline (PBS) pH 7.4 | Gibco by life technologies | 10010023 | |
Culture equipments: | |||
Absordent Protector,Benchkote | WhatmanTM | Cat No. 2300731, | Polysterene Backed, 460cm*50m |
Accurpette VWR | |||
Autoclavable Disposal Bag | For disposal of contamined plastic laboratory ware neck should be left open to allow penetration of steam, Hazardous Waste, STERILIN (white bag) | ||
biopsy punches | MILTEX by KAI | ref 33-36 | 4 & 6 mm diameter |
Clinical waste for alternative treatment Medium Duty | (UN-approved weight 5kg, Un-closure methods, UN- SH4/Y5/S/II/GB/4/06 (orange bag) | ||
Eppendorf tubes | 0.5mL and 1.5 mL | ||
Falcon tubes | 15mL and 50 mL | ||
free of detectable RNase, DNase, DNA&Pyrogens 1000ul Bevelled Graduated, filter tip | Starlab, TipOne (sterile) | S1122-1830 | |
free of detectable RNase, DNase, DNA&Pyrogens 20µl Bevelled Graduated, filter tip | Starlab, TipOne (sterile) | S1120-1810 | |
free of detectable RNase, DNase, DNA&Pyrogens 200ul Bevelled Graduated, filter tip | Starlab, TipOne (sterile) | S1110-1810 | |
Incubator | Incubator at 37°C, humidified atmosphere with 5% CO2 | ||
Optical microscope | |||
Pipette-boy | 25mL-, 10mL-, and 5mL sterile plastic-pipettes | ||
Pipettes (25-10-5 ml) | CellStar, Greiner Bio-one | ||
Plastic tweezers | Oxford Instrument | AGT 5230 | |
Scalpel | |||
Tips | P1000, P200 and P10 with P1000, P200 and P10 tips (sterile) | ||
Tissue culture hood | |||
Vacuum pump | |||
Water bath 37°C | |||
well plates | 12 & 24 well plates | ||
Protection equipment: | |||
face shield | |||
gloves | |||
lab coat | |||
safety goggles | |||
Data acquisition equipment: | |||
Fiji software | open source Software | ||
PyHST reconstruction toolkit | open source Software |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved