הכנה במבחנה של אקספלנטים של סחוס מפרקי בקר המתבגרים באופן פעיל להדמיית ניגודיות שלב רנטגן

פרוטוקול זה מתאר הכנת סחוס מפרקי בקר במבחנה להדמיה ברזולוציה גבוהה עם צילומי רנטגן. אקספלנטים אלה עוברים באופן פעיל התבגרות לאחר הלידה. אנו מתארים כאן את השלבים הדרושים מהביופסיה לניתוח נתונים של הדמיית ניגודיות שלב רנטגן תלת מימדית, עוברת דרך תרבית אקספלנט, קיבוע רקמות והכנת סינכרוטרון.

הבנת המנגנונים העומדים בבסיס התבגרות הסחוס המפרקי לאחר הלידה היא בעלת חשיבות מכרעת לתכנון הדור הבא של אסטרטגיות הנדסת רקמות ופוטנציאל לתיקון סחוס חולה או פגום. באופן כללי, התבגרות לאחר הלידה של הסחוס המפרקי, שהיא שינוי סיטונאי במבנה הקולגן ובתפקוד הרקמה כדי להתאים לצמיחת האורגניזם, מתרחשת על פני טווח זמן שנע בין חודשים לשנים. לעומת זאת, פירוק הארגון המבני של הסחוס המתרחש גם על פני טווחי זמן ארוכים הוא סימן ההיכר של ניוון רקמות. היכולת שלנו לחקור את התהליכים הביולוגיים הללו בפירוט שופרה על ידי הממצאים שגורמי גדילה יכולים לגרום להתבגרות מוקדמת במבחנה של סחוס מפרקי לא בשל. השינויים ההתפתחותיים והקשורים למחלות המתרחשים במפרק מערבים עצם וסחוס ויכולת לדמות רקמות אלה תגדיל משמעותית את ההבנה שלנו לגבי תפקידיהם השזורים זה בזה.

הדמיה בו-זמנית של שינויים ברקמות רכות, סחוס ועצמות היא כיום אתגר שיש להתגבר עליו עבור שיטות הדמיה פרה-קליניות קונבנציונליות המשמשות למעקב אחר מחלות מפרקים. שיטות הדמיית ניגודיות פאזה של קרני רנטגן תלת מימדיות (PCI) נמצאות בפיתוח תמידי במשך 20 שנה בשל ביצועים גבוהים להדמיית עצמים בצפיפות נמוכה ויכולתם לספק מידע נוסף בהשוואה להדמיית רנטגן קונבנציונלית.

בפרוטוקול זה אנו מפרטים את ההליך המשמש בניסויים שלנו מביופסיה של הסחוס, יצירת סחוס בוגר במבחנה ועד לניתוח נתונים של תמונה שנאספה באמצעות הדמיית ניגודיות פאזה של קרני רנטגן.

סחוס מפרקי לא בשל הוא תמיכה מספקת ליזום שינויים מורפולוגיים, מבניים וביו-מולקולריים¹ על מנת להשיג תפקוד ספציפי למפרק בוגר. השינוי העיקרי הוא ארגון מחדש של סיבי קולגן מאחד המציג אוריינטציה מקבילה ביחס לפני השטח בסחוס לא בוגר לכזה שבו סיבים עמוקים יותר ברקמה מאונכים בסחוס בוגר. פסאודו-ריבוד של סחוס בוגר ניכר באמצעות ארגון מחדש של כונדרוציטים תושבים לאורך כיוון כיוון סיבי הקולגן, כאשר תאים על פני השטח דמויי דיסק ומקבילים לפני השטח ובאזורים העמוקים יותר, התאים הופכים בהדרגה גדולים יותר ומאורגנים בעמודות. ידוע כי התבגרות לאחר הלידה מתרחשת על פני חודשים רבים ומסתיימת למעשה בסוף ההתבגרות המינית, טווח הזמן הארוך נחשב כמקשה על חקר המעבר ההתפתחותי החשוב הזה במקרה הטוב או בלתי אפשרי מבחינה טכנית לחקור בפירוט². התקדמות מסוימת בפתרון לבעיה זו נעשתה באמצעות הממצא שגורם גדילה פיברובלסטים-2 וגורם גדילה טרנספורמטיבי-β1 יחד מסוגלים לגרום לשינויים פיזיולוגיים ומורפולוגיים חשובים המשכפלים את הבשלת הסחוס המפרקי ^2,3 (איור 1). התבגרות במבחנה הנגרמת על ידי גורם גדילה מתרחשת תוך שלושה שבועות ואינה דורשת קלט ביומכני כלשהו. לאחר התרבית, ביטוי קולגן מסוג II מופחת באופן משמעותי והיחס בין קישורים צולבים של קולגן דו-ערכי בוגר לדו-ערכי לא בוגר גדל כפי שניתן לראות בסחוס מתבגר. כמו כן, הארגון של המטריצה החוץ-תאית וסיבי הקולגן קרוב יותר לזה שנראה בסחוס בוגר, אם כי היבט זה של המעבר אינו שלם. מבחינה ביוכימית, הרכב הסחוס שטופל בגורם גדילה מחקה סחוס מפרקי בוגר³.

המודל המשמש במאמר מבוסס על in vitro תרבית של צמחים בקוטר 4 או 6 מ"מ שנכרתו בתנאים סטריליים מההיבט הצדדי של הקונדיל המדיאלי המפרק metacarpophalangeal מבקר זכר לא בוגר (בן 7 ימים). שכבה דקה של סחוס מסוייד ועצם תת-כונדרלית נשמרה על ההיבט הבסיסי של כל אקספלנט. הסחוס המפרקי תורבת במדיום קלאסי נטול סרום, מדיום הנשרים המותאם של דולבקו (גלוקוז גבוה 4.5 גרם/ליטר) בו נוספו אינסולין-טרנספרין-סלניום (ITS), 10 מ"מ HEPES buffer pH 7.4, חומצה אסקורבית ו-50 מיקרוגרם/מ"ל גנטמיצין. מדיום תרבית זה מתווסף לגורם גדילה פיברובלסטים 2 (FGF-2) ו-10 ננוגרם/מ"ל גורם גדילה טרנספורמציה β1 (TGF-β1) המתחדשים כל שלושה ימים עם שינויי מדיה². הבשלת סחוס מואצת מאוד נגרמת על ידי שילוב גורמי גדילה. שינויים אלה מתרחשים תוך 21 יום. גירוי גורמי גדילה גורם בנוסף גורם לאפופטוזיס וספיגה מההיבט הבסיסי והתפשטות תאים בכונדרוציטים על פני השטח³. הרכב מדיום התרבות מתואר ב טבלה 1. בעקבות המודל שפותח על ידי Khan et al. 2011²צמחי סחוס מפרקיים מתורבתים עם TGF-β1 בריכוז של 10 ננוגרם/מיקרוליטר ו-FGF2 בריכוז של 100 ננוגרם/מיקרוליטר (ריכוזי מלאי 10 מיקרוגרם/מ"ל ו-100 מיקרוגרם/מ"ל מומסים בתמיסת מלח חוצצת פוספט/0.1% BSA)., 1 מיקרוליטר מכל גורם גדילה משמש לכל 1 מ"ל של המדיום. DMEM-F12 עם L-גלוטמין וגלוקוז גבוה הוא מדיום מלאכותי אשר, לאחר תוספת אינסולין, טרנספרין וסלניום (ITS), חומצה אסקורבית, גנטמיצין ו-HEPES מספק תוספת מדיום מלאה עם כל דרישות הגידול הפיזיולוגיות הספציפיות לקווי התאים השונים ולתרביות אקספלנט. DMEM-F12 מורכב ממספר מלחים אנאורגניים מגוונים (כלומר, NaCl, KCl, CaCl₂, MgCl,₂נה,₂פו₄), גלוקוז, חומצות אמינו (מקורות חנקן), ויטמינים, גורמים משלימים ומים. מלחים אלה מספקים תשומות אנרגטיות נאותות לשמירה על הישרדות התאים וצמיחה תקינה בתרבית. היונים המינרליים תורמים לשמירה על האוסמולריות קרוב לסביבה הפיזיולוגית הטבעית. הריכוז הגבוה יותר של גלוקוז (4.5 גרם/ליטר) משמש כאשר כונדרוציטים נושמים בעיקר באמצעות גליקוליזה. נעשה שימוש בתוסף בינוני F12 מכיוון שהוא מציע מספר מקורות של סולפט, CuSO₄FeSO,₄ZnSO,₄ ו-MgSO₄ נדרש לסינתזה של גליקוזאמינוגליקן גופרתי. כפי שנבדק על ידי אינדיקטורים צבעוניים (כאן פנול אדום) ו- CO₂/HCO^-₃ בשילוב עם פוספטים, ה-pH נשאר קבוע בערך קרוב ל-7.4. מסלול הנשימה העיקרי המשמש את הכונדרוציטים הוא גליקוליזה כאשר חומצה לקטית היא התוצר הסופי הגורם לעלייה ב-pH, לכן, בהיעדר כוחות ביומכניים שיסייעו בהסרת חומצה לקטית המיוצרת מקומית, HEPES פועל לשמירה על סביבה מבודדת לתהליכים פיזיולוגיים. גנטמיצין הוא אנטיביוטיקה אמינוגליקוזידית השולטת בזיהום חיידקי חיצוני באמצעות עיכוב גדילה. חומצה אסקורבית משמשת כהשלמה בינונית לפעולתה האנטי-אוקסידנטית⁴. חומצה אסקורבית היא קו-פקטור לאנזימים, פרוליל הידרוקסילאז, המתפקדים להידרוקסילט שאריות פרולין בקולגן המייצב את המבנה הסליל המשולש שלו. הטרנספרין משמש בדרך כלל כנוגד חמצון חוץ-תאי (רעילות והפחתת ROS)^5,6. הוא מתווסף גם למדיום התרבות בשל יכולתו לספק ולהקל על אחסון והובלת ברזל חוץ-תאי בתרבית תאים. טרנספרין קושר ברזל כל כך חזק בתנאים פיזיולוגיים שלמעשה לא קיים ברזל חופשי כדי לזרז את ייצור הרדיקלים החופשיים⁷. איתות הורמון האינסולין מהקולטן הקשור שלו מגביר את הספיגה של מספר אלמנטים כמו גלוקוז, חומצות אמינו. הוא מעורב גם במספר תהליכים כגון הובלה תוך-תאית, ליפוגנזה, חלבון וסינתזות של חומצות גרעין. לאינסולין יש השפעה מעודדת גדילה. סלניום קיים בנוסף בתמיסה המרוכבת "אינסולין-טרנספרין-סלניום", כנתרן סלניט. הוא משמש בעיקר כקופקטור לחלבונים (seleno-) כגון gluthatione peroxidase (GPX), כחומר נוגד חמצון משלים בתרבית. ב in vitro נראה כי כונדרוציטים מפרקיים, ITS משפרים את התפשטות התאים ושימור הפנוטיפ על ידי עיכוב ביטוי הגנים הקשורים לדה-דיפרנציאציה תאית והתמיינות היפרטרופית⁸. גורמי גדילה כמו גורם גדילה פיברובלסטים-2 וגורם גדילה טרנספורמטיבי-β1 מתווספים למדיום התרבית. הם משמשים כדי לגרום ולווסת התמיינות תאים, גדילה, ריפוי והתפתחות^2,3. FGF-2 ו-TGF-β1 בשילוב גם מקדמים בעוצמה שגשוג תאים בתאים וברקמות מתורבתים⁹.

מודל התבגרות מבחנה זה של סחוס מפרקי שימושי משלוש סיבות עיקריות. ראשית, מעבר השלב ההתפתחותי המואץ במודל זה מאפשר לנו לחקור שינויים בלתי מורגשים המתרחשים לאורך חודשים רבים במודלים in vivo כגון ביטוי מוגבר של lysl oxidase-L1 במהלך ההתבגרות¹⁰. שנית, הנדסת רקמות של סחוס מפרקי סובלת מהעובדה שנוצר סחוס בעל מורפולוגיה ומבנה איזוטרופיים שהוא חסר תפקודי כאשר הוא מושתל במפרקים לתיקון פגמים מוקדיים. ההבנה כיצד לגרום לשינויים בשלים תאיץ את הפיתוח של מכשירים מושתלים מתפקדים במלואם. שלישית ורלוונטית למחקר זה, ישנם מצבי מפרקים ניווניים כמו מחלת קאשין-בק המתרחשים במהלך הילדות ומובילים לעיוותים חמורים במפרקים בבגרות. מחלה מסוימת זו קשורה מאוד לאזורים גיאוגרפיים (סין) עם מחסור אנדמי בסלניום ויוד שעלול להשפיע על עשרות מיליוני תושבים 11,12,13. בחינת ליקויי שלד במחלת קאשין-בק מראה כי היא מתרחשת לפני גיל ההתבגרות, מה שמרמז על הפרעה בתהליכי התבגרות השלד. לכן, כדי להבין עוד יותר את תפקידו של סלניום בסחוס מפרקי (AC) נדרש מודל חזק לצמיחה והתפתחות של סחוס. מודל התבגרות המושרה על ידי גורם גדילה במבחנה מספק נקודת התחלה שימושית למחקרים על צמיחה ומטבוליזם של סחוס מפרקי במהלך ההתבגרות בנוכחות או היעדר יוני סלניום 14,15,16. הידע שלנו על ההשפעות של מחסור בסלניום (Se) על תהליכים ביולוגיים מורכבים וקשורים זה לזה נותר דל מאוד. הבעיה העיקרית נעוצה בעובדה שסלניום נותר יסוד למחקר בשל טווח הפעולה המגביל שלו (הריכוז הנדרש בין 40 ל-400 מיקרוגרם/ק"ג¹⁷) והריכוז הנמוך מאוד הכרוך בכך. מודל ההתבגרות המואצת באמצעות סחוס בקר לא בוגר מציע יכולת חסרת תקדים להסתכל על שינויים ביולוגיים המתרחשים בשלב חשוב של ההתפתחות. ריכוז ה-Se באורגניזמים נשלט היטב, ומודל זה הוא נקודת מוצא לפיתוח טכניקות הדמיה המאפשרות מעקב מדויק אחריו במהלך ההתבגרות. טכניקות אלה יכולות להיות כלי רב עוצמה לחקר אסטרטגיות למניעת פירוק AC ופוטנציאלית לפתח את הבסיס לטיפולים חדשים מבוססי רפואה רגנרטיבית.

הדמיה סימולטנית של שינויים ברקמות רכות, סחוס ועצם היא אתגר מרכזי בשיטות הדמיה פרה-קליניות קונבנציונליות. זה אכן יהיה עזרה חשובה למעקב אחר מחלות מפרקים^18,19 . כדוגמה, מיקרו טומוגרפיה ממוחשבת קונבנציונלית של רנטגן (μCT) מציגה ביצועים גרועים לרקמות רכות המגבילים את השימוש בה לתיאור פגמים בעצם, אוסטאופיטים והדמיה עקיפה של סחוס. הדמיית תהודה מגנטית (MRI), לעומת זאת, משמשת באופן קונבנציונלי להדמיית רקמות רכות למרות יכולתה הנמוכה לעבד במדויק שינויים בעצם (למשל, מיקרו-הסתיידויות) בשלבים הראשונים של מחלות. היכולת להיות רגיש לעצמות ולסחוסים, ולהבחין בין התאים המרכיבים את הסחוס, כונדרוציטים, היא בעלת חשיבות עצומה. הדמיית ניגודיות פאזה (PCI) מסתמכת על המאפיין שמדד השבירה של קרני רנטגן של חומרים יכול להיות גדול פי אלף ממדד הספיגה של יסודות אור. זה מייצר ניגודיות גבוהה יותר לרקמות רכות בהשוואה לשיטות הקונבנציונליות המבוססות על ספיגת הסוליה. לכן, PCI מסוגל לדמות את כל הרקמות המרכיבות את המפרק בעלות ייצוג בו-זמני של רקמות סופגות גבוה (למשל, עצמות) ופחות סופגות (למשל, סחוס סיבי, רצועות, גידים, מניסקוס ורקמות רכות קשורות (ממברנות סינוביאליות ושרירים))18,19,20,21.

כפי שהודגם ^ב-ref.20, PCI רנטגן עולה על שיטות ההדמיה הפרה-קליניות האחרות לסחוס. מטרת פרוטוקול זה היא לפרט את ההליך ולהראות כמה תוצאות מייצגות. תוכנית ההשפעה של גורמי גדילה על צמח סחוס לא בשל מוצגת באיור 1.

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי ועדת המחקר האתי של אוניברסיטת סוונסי וחומרי הביופסיה נרכשו ברישיון מהמחלקה לאיכות הסביבה, מזון ועניינים כפריים (DEFRA), בריטניה. פרוטוקול זה עוקב אחר הנחיות הטיפול בבעלי חיים של המוסדות שלנו.

1. להוציא תרביות

1. הכנת הצמחים מקרקפת רגלי בקר
   1. הכינו מגן סופג ואזמל, אזמל כירורגי סטנדרטי עם להב אזמל #10.
   2. מרססים את כל החומרים בתמיסת אתנול 70%.
   3. השרו את רגל הבקר (בקר זכר בן 7 ימים שהתקבל מבית המטבחיים באישור וטרינרי) במים כדי להסיר את כל הדם והבוץ.
   4. נקו את הרגל עם סבון ושפשפו בעזרת מברשת.
   5. כאשר הוא נקי כראוי, יש לרסס את הרגל באתנול 70%.
   6. הניחו אותו על נייר סופג.
   7. חותכים סביב כפות הרגליים בעזרת אזמל.
   8. עקבו אחר קו עדין לאורך הרגל.
   9. היזהר במיוחד באזור המפרק.
   10. יש להסיר את עור הרגל בזהירות לאורך קו האזמל לאורכו.
   11. הכניסו את הפסולת (עור, טישו משומש, נייר וכפפות) לשקית אשפה קלינית.
   12. נקה/צחצח את הרגל בסבון ועיקר שוב באתנול לאחר הסרת העור.
   13. אל תפגע באזור הקרוב לחלל המפרק. אם החלל נפתח או ניזוק מחדירת דם, הוא כבר לא סטרילי ולא ניתן להשתמש ברגל.
   14. מניחים את הרגל בנייר כסף שרוסס באתנול 70%.
   15. הנח את כפפות הלטקס בגודל המתאים על קצות הרגל כדי למנוע יציאת דם מהקצה הפרוקסימלי או זיהום אפשרי מהפרסה.
   16. השלך את חומרי הפסולת בצורה המתאימה בהתאם לכללים המוסדיים.
2. מיצוי ותרבות אקספלנט
   הערה: יש להשיג את האקספלנטים מהחלק הפנימי של המפרק (איור 2שני שלבים ראשונים)., כדי להיות בתנאים דומים, יש לנקב ארבעה (או שישה) צמחים מאותו אזור על מנת ליישם את ארבעת (או שישה) הטיפולים השונים על דגימות בעלות צורה ומאפיינים כמעט זהים.
   1. פתח את מכסה המנוע הלמינרי 25 דקות לפני השימוש, נקה עם אלכוהול 70%.
   2. הכניסו את מדיום התרבות לחימום באמבט מים.
   3. הכינו צלחת 24 בארות עם 1.5 מ"ל של מדיום בסיסי, DMEM-F12 בלבד (מדיום כביסה) בכל באר.
   4. הכינו צלחת באר נוספת עם 1.5 מ"ל מדיום תרבות שלם. יש לאחסן בחממת תרבית בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עד לשימוש
   5. הכן את החומר על מתלה: צינור אוניברסלי אחד עם 70% אתנול וצינור אוניברסלי נוסף עם מדיום כביסה.
   6. הכינו אזמל ואגרוף ביופסיה בגודל 4 או 6 מ"מ (מונח בצינור האוניברסלי של האלכוהול).
   7. שים את הצינורות והחומרים מתחת למכסה המנוע.
   8. שים מגן סופג מרוסס עם 70% אתנול מתחת למכסה המנוע.
   9. הכינו כמה טישו מרוססים באתנול 70%.
   10. קח צלחת נתיחה, כסה אותה בנייר כסף.
   11. מוציאים מהמקרר (4 מעלות צלזיוס) את אותן רגליים שהוכנו קודם לכן ומרססים אותן באתנול של 70%.
   12. השלך שקיות מסוכנות וקליניות ליד מכסה המנוע כדי לבצע חיטוי של הפסולת מאוחר יותר.
   13. יש לרסס את כף הרגל ב-70% אתנול.
   14. הזז את המפרק כדי למצוא את קו האמצע של המפרק שבו יש לבצע את החתך. עשו זאת מתחת למכסה המנוע.
   15. קח את האזמל הסטרילי.
   16. חותכים בזהירות לאורך קו האמצע בעקבות קווי המתאר של קצוות המפרק. אל תיגע בסחוס הקונדיל המדיאלי של המפרק המטאקרפופלנגאלי.
   17. חותכים בזהירות את הרצועה בעת פתיחת המפרק.
   18. זרוק את החלק התחתון של כפות הרגליים בשקית חיטוי.
   19. הסר את כל הרקמות האחרות על מנת לחשוף את כל הסחוס של המפרק (איור 2).
       הערה: היזהר לא לגעת בשום דבר בכפות הרגליים.
   20. מניחים את האזמל ואגרוף הביופסיה באלכוהול ולאחר מכן במדיום הכביסה.
   21. צרו כמה עיגולים עם האגרוף הזה (4-5 לכל פנים) עם קצת כוח לאורך הפנים הפנימיות של העצמות.
   22. מניחים את הביו-פונץ' באלכוהול בסיום כדי לנקות אותו.
   23. קח אזמל וחתוך (עקוב אחר קו) בין כל עיגול ולאורך הקו המרכזי של העצם.
   24. כדי להוציא את הסחוס יש לחתוך אנכית על אחד מגבולות ביופסיית המעגל, ואז לחתוך אופקית את העצם התת-כונדרלית בזהירות רבה.
   25. כדי להסיר את צמח הסחוס שנחתך אופקית מתחת לקו האגרוף לאורך העצם התת-כונדרלית והסחוס המסוייד, האקספלנטים יצוצו החוצה.
       הערה: הוצאות צריכות להיות בעובי אחיד, במידת האפשר.
   26. מניחים את האקספלנט בצלחת הבאר המלאה ב -1.5 מ"ל של מדיום כביסה.
       הערה: בצע תמיד בקרה וטיפול ניסיוניים בצמחים המגיעים מאותו מיקום במפרק.
   27. בדוק שהאקספלנט מכוון היטב נכון. פני השטח של האקספלנט צריכים להיות פונים כלפי מעלה וחלק העצם התת-כונדרלי של האקספלנט צריך לפנות לתחתית צלחת הבאר.
   28. שמור את צלחת הבאר סגורה בין כל ביופסיה.
   29. הסר את אמצעי הכביסה.
   30. שוטפים שוב עם מדיום כביסה. יש להשאיר בכביסה בינונית למשך 2-3 שעות. שאריות עצם, לדם יהיה זמן לזרום החוצה במדיום.
   31. מעבירים את האקספלנטים בצלחת באר חדשה המכילה את מדיום התרבות השלם. היזהר: אל תיגע בשום דבר עם הפיפטה.
   32. בדוק שהצמחים עדיין במצב הנכון (עצם הפונה לחלק התחתון של צלחת הבאר).
   33. נקו הכל וזרקו את הפסולת הקלינית במקום מתאים.
   34. לאחר הנחת האקספלנטים בתרבית בחממה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO₂, החלף את מדיום התרבית האקספלנט כל יומיים במדיום טרי וחם כדי לקיים את הצרכים המגוונים של התאים/רקמות. בדוק שהצמחים עדיין במצב הנכון (עצם הפונה לחלק התחתון של צלחת הבאר).
3. קיבוע לדוגמא (אופציונלי)
   הערה: בצע שלב זה רק לאחר סיום תרבית התאים, כלומר לאחר 3 שבועות של תרבית. לאחר מכן הגיעו הצמחים לשלב הבשלה.
   1. שטפו את האקספלנטים עם DMEM-F12 עם פיפטה מתחת למכסה המנוע של תרבית הרקמות.
   2. שטפו את הצמחים פעמיים עם PBS עם פיפטה מתחת למכסה המנוע של תרבית הרקמות.
   3. תקן אותם למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס על ידי השרייה ב-10% NBFS (מלח פורמלין ניטרלי).
   4. הנח את האקספלנטים הקבועים ב-PBS בצינור מיקרו-צנטריפוגה
   5. אחסן את הצמחים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. צמחים קבועים יכולים להישאר בתנאים אלה עד 6 חודשים.

2. הכנה לדוגמא לפגישת ההדמיה

1. השתמש בקצות פלסטיק חרוטי בגודל מתאים (בדרך כלל קצה של 1 מ"ל) ביחס לדגימה ולשדה הראייה של המצלמה.
2. אטמו את קצה החרוט (על ידי חימום עם להבה) על מנת שיהיה מיכל דגימה חסין מים.
3. מלאו את הקצה ב-PBS. החזק את הדגימה בפינצטה והכנס אותה לצינור. הסר את בועת האוויר על ידי ניעור איטי.
4. הרכיב את הצינור על שלב הטומוגרפיה ויישר אותו על ידי צילום צילומי רנטגן פשוטים.

3. מפגש הדמיית ניגודיות שלב רנטגן

1. הנח את הגלאי במרחק של 2.5 מ' מהדגימה
2. הגדר את אנרגיית הפוטון של קרני רנטגן ל-17 keV באמצעות מערכת גביש סיליקון כפולה בתוך גיאומטריית בראג-בראג.
3. גלאי הדמיה של הר כלל מצלמת CMOS מדעית²² על אופטיקה עם גודל ווקסל איזוטרופי של 3.5 מיקרומטר בתמונה התלת מימדית.
4. השתמש במסך מנצנץ גדוליניום אוקסיסולפיד בעובי 60 מיקרומטר כדי להמיר את קרני הרנטגן לאור נראה
5. איסוף נתונים: רכוש 2000 תחזיות במהלך סריקה של 360 מעלות של המדגם עם זמן חשיפה של 2 שניות לכל הקרנה.
6. השתמש באלגוריתם אחזור הפאזה כדי לחלץ את אות הפאזה כמתואר בהפניה ²³. האלגוריתם משתמש בידע אפריורי של התפלגות מקדם השבירה המורכב בתוך המדגם. ההשערה העיקרית, שלא אומתה כאן, היא שיש חומר אחד לשחזר. במקרה הספציפי הזה, היחס בין השבירה למדד הספיגה נקבע ל-1,200 שנצפה בניסוי לפשרה הטובה ביותר להדמיית עצם וסחוס.
7. השתמש באלגוריתם שחזור CT של הקרנה אחורית מסוננת סטנדרטית באמצעות יישום מבוסס יחידת עיבוד גרפיקה (GPU) בקוד פתוח של קוד PyHST2²⁴.

נעשה שימוש במערך הדמיה פשוט מבוסס התפשטות²⁵ כפי ששורטט באיור 3. בהדמיה מבוססת התפשטות סינכרוטרון, קרן רנטגן קוהרנטית מאירה את האובייקט, וגורמת לשינויי פאזה משתנים מרחבית¹⁹. כאשר קרן הרנטגן מתפשטת לאחר הדגימה, חזית הגל המעוותת יוצ?...

הצגנו מחקר שלם מהכנת הדגימה ועד להדמיית התמונה, כולל פרוטוקולי איסוף הנתונים, לחקר סחוס מפרקי המתבגר במהירות במבחנה . תוצאות של מפגש הדמיית סינכרוטרון הראו את הטוב של המודל.

במודל המוצג כאן יש להזכיר כמה תצפיות ומגבלות. "התבגרות מואצת" זו מתרחשת תוך 21 ?...

ללא.

המחברים מודים ל-ESRF על מתן זמן אלומה בבית. המחברים רוצים להודות לאריק זיגלר על הדיונים המדעיים. ניסוי ה-PCI המתואר נערך בקו האלומה BM05 של המתקן האירופי לקרינת סינכרוטרון (ESRF), גרנובל, צרפת. CB מודה ל-Explora'doc Auvergne Rhone Alpes ולמלגות מאוניברסיטת סוונסי ואוניברסיטת גרנובל אלפ על מימון חלק ממחקר זה.