التحضير في المختبر لاستخلاصات الغضروف المفصلي البقري الناضجة بنشاط لتصوير تباين مرحلة الأشعة السينية

Caroline Bissardon; Yadan Zhang; Hélène Rougé Labriet; Sébastien Berujon; Laurent Charlet; Ilyas M. Khan; Emmanuel Brun; Sylvain Bohic

doi:10.3791/61607

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Summary

يصف هذا البروتوكول تحضير الغضروف المفصلي البقري في المختبر للتصوير بدقة عالية بالأشعة السينية. تخضع هذه المكثفات بنشاط لنضج ما بعد الولادة. نصف هنا الخطوات اللازمة من الخزعة إلى تحليل البيانات لتصوير تباين طور الأشعة السينية ثلاثية الأبعاد ، مرورا بزراعة الزرع ، وتثبيت الأنسجة وإعداد السنكروترون.

Abstract

يعد فهم الآليات التي تدعم نضج الغضروف المفصلي بعد الولادة أمرا بالغ الأهمية لتصميم الجيل التالي من استراتيجيات هندسة الأنسجة وربما إصلاح الغضروف المصاب أو التالف. بشكل عام ، يحدث نضوج الغضروف المفصلي بعد الولادة ، وهو تغيير شامل في بنية الكولاجين ووظيفة الأنسجة لاستيعاب نمو الكائن الحي ، على مدى فترة زمنية تتراوح من شهور إلى سنوات. على العكس من ذلك ، فإن انحلال التنظيم الهيكلي للغضروف الذي يحدث أيضا على مدى فترات زمنية طويلة هو السمة المميزة لتنكس الأنسجة. تم تعزيز قدرتنا على دراسة هذه العمليات البيولوجية بالتفصيل من خلال النتائج التي تفيد بأن عوامل النمو يمكن أن تحفز النضج المبكر في المختبر للغضروف المفصلي غير الناضج. تشمل التغيرات التنموية والمتعلقة بالأمراض التي تحدث في المفصل العظام والغضاريف والقدرة على تصوير هذه الأنسجة بشكل كبير من شأنها أن تزيد بشكل كبير من فهمنا لأدوارها المتشابكة.

يعد التصور المتزامن لتغيرات الأنسجة الرخوة والغضاريف والعظام في الوقت الحاضر تحديا للتغلب عليه لطرق التصوير قبل السريري التقليدية المستخدمة لمتابعة أمراض المفاصل. تخضع طرق التصوير ثلاثي الأبعاد للأشعة السينية للتباين الطوري (PCI) لتطورات دائمة لمدة 20 عاما بسبب الأداء العالي لتصوير الأجسام منخفضة الكثافة وقدرتها على توفير معلومات إضافية مقارنة بالتصوير بالأشعة السينية التقليدية.

في هذا البروتوكول ، نقوم بتفصيل الإجراء المستخدم في تجاربنا من خزعة الغضروف ، وتوليد الغضروف الناضج في المختبر إلى تحليل بيانات الصورة التي تم جمعها باستخدام تصوير تباين طور الأشعة السينية.

Introduction

الغضروف المفصلي غير الناضج هو دعم كاف لبدء التغييرات المورفولوجية والهيكلية والجزيئية^{الحيوية 1} من أجل الحصول على وظيفة خاصة بمفصل البالغين. التغيير الرئيسي هو إعادة تنظيم ألياف الكولاجين من واحدة تظهر اتجاها موازيا فيما يتعلق بالسطح في الغضروف غير الناضج إلى التغيير الذي تكون فيه الألياف العميقة في الأنسجة متعامدة في الغضروف الناضج. يتضح التقسيم الطبقي الزائف للغضاريف البالغة من خلال إعادة تنظيم الخلايا الغضروفية المقيمة على طول اتجاه الكولاجين الليفي مع الخلايا الموجودة على السطح ، تشبه القرص ، وبالتوازي مع السطح ، وفي المناطق العميقة ، تصبح الخلايا أكبر تدريجيا ومنظمة في أعمدة. من المعروف أن نضج ما بعد الولادة يحدث على مدى عدة أشهر ويكتمل بشكل أساسي في نهاية سن البلوغ ، وكان يعتقد أن الجدول الزمني الطويل يجعل دراسة هذا التحول التنموي المهم في أحسن الأحوال صعبة أو مستحيلة تقنيا للدراسة بالتفصيل². تم إحراز بعض التطورات في حل هذه المشكلة من خلال اكتشاف أن عامل نمو الخلايا الليفية -2 وتحويل عامل النمو β1 معا قادرون على إحداث تغييرات فسيولوجية ومورفولوجية مهمة تكرر نضج الغضروف المفصلي²^،³ (الشكل 1). يحدث النضج الناجم عن عامل النمو في المختبر في غضون ثلاثة أسابيع ولا يتطلب أي مدخلات ميكانيكية حيوية. بعد الاستزراع ، يتم تقليل تعبير الكولاجين من النوع الثاني بشكل كبير وتزداد نسبة الروابط المتقاطعة للكولاجين ثلاثي التكافؤ الناضج إلى غير الناضج كما هو موضح في الغضروف الناضج. أيضا ، فإن تنظيم المصفوفة خارج الخلية وألياف الكولاجين أقرب إلى ذلك الذي يظهر في الغضروف الناضج على الرغم من أن هذا الجانب من الانتقال ليس كاملا. من الناحية الكيميائية الحيوية ، يحاكي تكوين الغضروف المعالج بعامل النمو الغضروف المفصلي^{البالغ 3}.

يعتمد النموذج المستخدم في المقالة على in vitro استزراع الخروج بقطر 4 أو 6 مم التي تم استئصالها في ظل ظروف معقمة من الجانب الجانبي لللقمة الإنسية المفصلية من الذكور غير الناضجين (7 أيام). تم الاحتفاظ بطبقة رقيقة من الغضروف المتكلس والعظام تحت الغضروفي على الجانب القاعدي لكل نبت. تم زراعة الغضروف المفصلي في وسط كلاسيكي خال من المصل وسط النسور المعدل من Dulbecco (ارتفاع الجلوكوز 4.5 جم / لتر) حيث تمت إضافة الأنسولين - ترانسفيرين - السيلينيوم (ITS) ، و 10 ملي مولار HEPES ، ودرجة الحموضة 7.4 ، وحمض الأسكوربيك و 50 ميكروغرام / مل جنتاميسين. يتم استكمال وسط الاستزراع هذا بعامل نمو الخلايا الليفية 100 نانوغرام / مل 2 (FGF-2) و 10 نانوغرام / مل عامل نمو محول β1 (TGF-β1) يتم تجديده كل يوم ثالث بتغييرات الوسائط². يتم تحفيز نضوج الغضروف المتسارع للغاية عن طريق الجمع بين عوامل النمو. تحدث هذه التغييرات في غضون 21 يوما. بالإضافة إلى ذلك ، يؤدي تحفيز عامل النمو إلى موت الخلايا المبرمج والارتشاف من الجانب القاعدي والتكاثر الخلوي في الخلايا الغضروفية السطحية³. يتم وصف تكوين وسط الثقافة في الجدول 1. باتباع النموذج الذي طوره Khan et al. 2011²، يتم استزراع مستخلصات الغضروف المفصلية باستخدام TGF-β1 بتركيز 10 نانوغرام / ميكرولتر و FGF2 بتركيز 100 نانوغرام / ميكرولتر (تركيزات المخزون 10 ميكروغرام / مل و 100 ميكروغرام / مل مذابة في محلول ملحي مخزن بالفوسفات / 0.1٪ BSA). يتم استخدام 1 ميكرولتر من كل عامل نمو لكل 1 مل من الوسط. DMEM-F12 مع L- الجلوتامين والجلوكوز العالي هو وسيط اصطناعي يوفر بمجرد استكماله بالأنسولين والترانسفيرين والسيلينيوم (ITS) وحمض الأسكوربيك والجنتاميسين و HEPES مكملات متوسطة كاملة مع جميع متطلبات النمو الفسيولوجية الخاصة بخطوط الخلايا المختلفة ومزارع المستخلصين. يتكون DMEM-F12 من عدة أملاح غير عضوية متنوعة (مثل كلوريد الصوديوم ، KCl ، CaCl₂، MgCl₂، NaH₂بو₄)، والجلوكوز، والأحماض الأمينية (مصادر النيتروجين)، والفيتامينات، والعوامل المساعدة والماء. توفر هذه الأملاح مدخلات نشطة كافية للحفاظ على بقاء الخلية والنمو الطبيعي في الثقافة. تساهم الأيونات المعدنية في الحفاظ على الأسمولية بالقرب من البيئة الفسيولوجية الطبيعية. يستخدم التركيز الأعلى للجلوكوز (4.5 جم / لتر) حيث تتنفس الخلايا الغضروفية بشكل أساسي من خلال تحلل السكر. يتم استخدام مكملات F12 المتوسطة لأنها توفر عددا من مصادر الكبريتات ، CuSO₄، FeSO₄، ZnSO₄ و MgSO₄ مطلوب لتخليق الجليكوزامينوجليكان المكبريت. كما تم التحقق منها بواسطة المؤشرات الملونة (هنا الفينول الأحمر) وثاني أكسيد الكربون₂/HCO^-₃ المخزن المؤقت مع الفوسفات ، يظل الرقم الهيدروجيني ثابتا عند قيمة قريبة من 7.4. المسار التنفسي الرئيسي الذي تستخدمه الخلايا الغضروفية هو تحلل السكر حيث يكون حمض اللاكتيك هو المنتج النهائي الذي يسبب زيادة في درجة الحموضة ، لذلك ، في حالة عدم وجود قوى ميكانيكية حيوية من شأنها أن تساعد في إزالة حمض اللاكتيك المنتج محليا ، يعمل HEPES على الحفاظ على بيئة مخزنة للعمليات الفسيولوجية. الجنتاميسين هو مضاد حيوي أمينوغليكوزيد يتحكم في التلوث البكتيري الخارجي من خلال تثبيط النمو. يستخدم حمض الأسكوربيك كمكمل متوسط لعمله المضاد للأكسدة⁴. حمض الأسكوربيك هو عامل مساعد للإنزيمات ، هيدروكسيلاز البروليل ، التي تعمل على هيدروكسيل بقايا البرولين في الكولاجين لتثبيت هيكله الحلزوني الثلاثي. عادة ما يعمل الترانسفيرين كمضاد للأكسدة خارج الخلية (السمية وتقليل ROS)⁵^,⁶. كما يتم إضافته إلى وسط الاستزراع لقدرته على توفير وتسهيل تخزين الحديد خارج الخلية ونقله في زراعة الخلايا. يربط ترانسفيرين الحديد بإحكام شديد في ظل الظروف الفسيولوجية بحيث لا يوجد حديد حر تقريبا لتحفيز إنتاج الجذور الحرة⁷. يزيد هرمون الأنسولين الذي يرسل إشارات من مستقبله المرتبط من امتصاص العديد من العناصر مثل الجلوكوز والأحماض الأمينية. كما أنها تشارك في العديد من العمليات مثل النقل داخل الخلايا, تكوين الدهون, البروتين, وتوليفات الحمض النووي. الأنسولين له تأثير معزز للنمو. السيلينيوم موجود بالإضافة إلى ذلك في المحلول المركب "الأنسولين-ترانسفيرين-السيلينيوم", كما سيلينيت الصوديوم. يستخدم بشكل أساسي كعامل مساعد للبروتينات (seleno-) مثل gluthatione peroxidase (GPX) ، كعامل مضاد للأكسدة تكميلي في الثقافة. في in vitro الخلايا الغضروفية المفصلية ، يبدو أن ITS يعزز التكاثر الخلوي والحفاظ على النمط الظاهري عن طريق تثبيط التعبير الجيني المتعلق بفك التمايز الخلوي والتمايز الضخامي⁸. تتم إضافة عوامل النمو مثل عامل نمو الخلايا الليفية -2 وعامل النمو المحول -β1 إلى وسط الاستزراع. يتم استخدامها للحث على تمايز الخلايا ونموها وشفائها وتطورها وتنظيمها²^,³. يعزز FGF-2 و TGF-β1 معا أيضا التكاثر الخلوي بقوة في الخلايا والأنسجة المستنبتة⁹.

يعد نموذج النضج في المختبر للغضروف المفصلي مفيدا لثلاثة أسباب رئيسية. أولا ، يسمح لنا انتقال المرحلة التنموية المتسارع في هذا النموذج بدراسة التغييرات غير المحسوسة التي تحدث على مدى عدة أشهر في نماذج في الجسم الحي مثل التعبير المرتفع عن lysl oxidase-L1 أثناء النضج¹⁰. ثانيا ، تعاني هندسة أنسجة الغضروف المفصلي من حقيقة أن الغضروف ذو التشكل والهيكل المتناحي يتم إنتاجه وهو ناقص وظيفيا عند زرعه في المفاصل لإصلاح العيوب البؤرية. سيؤدي فهم كيفية إحداث تغييرات نضجية إلى تسريع تطوير الأجهزة القابلة للزرع التي تعمل بكامل طاقتها. ثالثا وذات الصلة بهذه الدراسة ، هناك حالات تنكسية في المفاصل مثل مرض كاشين بيك تحدث أثناء الطفولة تؤدي إلى تشوهات شديدة في المفاصل في مرحلة البلوغ. يرتبط هذا المرض بالذات ارتباطا وثيقا بالمناطق الجغرافية (الصين) مع نقص متوطن في السيلينيوم واليود يحتمل أن يؤثر على عشرات الملايين من السكان¹¹^،¹²^،¹³. يظهر فحص عيوب الهيكل العظمي في مرض Kashin-Beck أنه يحدث في فترة ما قبل البلوغ ، مما يعني اضطرابا في عمليات نضج الهيكل العظمي. لذلك ، لفهم دور السيلينيوم في الغضروف المفصلي (AC) ، يلزم وجود نموذج قوي لنمو الغضروف وتطوره. يوفر نموذج النضج الناجم عن عامل النمو في المختبر نقطة انطلاق مفيدة للدراسات حول نمو واستقلاب الغضروف المفصلي أثناء النضج في وجود أو عدم وجود أيونات السيلينيوم¹⁴^،¹⁵^،¹⁶. لا تزال معرفتنا بآثار نقص السيلينيوم (Se) على العمليات البيولوجية المعقدة والمترابطة ضعيفة للغاية. تكمن المشكلة الرئيسية في حقيقة أن السيلينيوم لا يزال عنصرا للدراسة بسبب نطاق عمله المقيد (التركيز المطلوب بين 40 و 400 ميكروغرام / كجم¹⁷) والتركيز المنخفض جدا المعني. يوفر نموذج النضج المتسارع باستخدام الغضروف البقري غير الناضج قدرة غير مسبوقة على النظر في التغيرات البيولوجية التي تحدث خلال مرحلة مهمة من التطور. يتم التحكم بإحكام في تركيز Se في الكائنات الحية ، وهذا النموذج هو نقطة انطلاق لتطوير تقنيات التصوير التي تسمح بتتبعها بدقة أثناء النضج. يمكن أن تكون هذه التقنيات بعد ذلك أداة قوية لدراسة استراتيجيات منع تدهور التيار المتردد وربما تطوير أساس العلاجات الجديدة القائمة على الطب التجديدي.

يعد التصور المتزامن للأنسجة الرخوة والغضاريف وتغيرات العظام تحديا كبيرا في طرق التصوير قبل السريرية التقليدية. سيكون هذا بالفعل مساعدة مهمة لمتابعة أمراض المفاصل¹⁸^،¹⁹ . على سبيل المثال ، يقدم التصوير المقطعي الصغير بالأشعة السينية التقليدي (μCT) أداء ضعيفا للأنسجة الرخوة التي تحد من استخدامها لتصوير عيوب العظام والنباتات العظمية والتصور غير المباشر للغضاريف. من ناحية أخرى ، يتم استخدام التصوير بالرنين المغناطيسي (MRI) بشكل تقليدي لتصوير الأنسجة الرخوة على الرغم من قدرته الضعيفة على إجراء تغييرات دقيقة في العظام (على سبيل المثال ، التكلسات الدقيقة) خلال المراحل الأولى من الأمراض. القدرة على أن تكون حساسا للعظام والغضاريف ، والتمييز بين الخلايا المكونة للغضاريف ، الخلايا الغضروفية لها أهمية كبيرة. يعتمد تصوير تباين الطور (PCI) على خاصية أن مؤشر انكسار الأشعة السينية للمواد يمكن أن يكون أكبر بألف مرة من مؤشر امتصاص العناصر الخفيفة. هذا يولد تباينا أعلى للأنسجة الرخوة مقارنة بالطرق التقليدية القائمة على امتصاص النعل. لذلك ، فإن PCI قادر على تصوير جميع الأنسجة التي تشكل المفصل التي لها تمثيل متزامن لكل من الأنسجة عالية الامتصاص (مثل العظام) والأنسجة الأقل امتصاصا (على سبيل المثال ، الغضروف الليفي والأربطة والأوتار والغضروف المفصلي والأنسجة الرخوة المرتبطة بها (الأغشية الزليلية والعضلات))¹⁸^،¹⁹^،²⁰^،²¹.

كما هو موضح في المرجع ²⁰ ، يتفوق PCI بالأشعة السينية على طرق التصوير قبل السريري الأخرى للغضاريف. الغرض من هذا البروتوكول هو تفصيل الإجراء وإظهار بعض النتائج التمثيلية. يظهر مخطط تأثير عوامل النمو على نثرة الغضروف غير الناضج في الشكل 1.

Protocol

تمت الموافقة على جميع الطرق الموضحة هنا من قبل لجنة البحوث الأخلاقية بجامعة سوانسي وتم الحصول على مواد الخزعة بموجب ترخيص من وزارة البيئة والأغذية والشؤون الريفية (DEFRA) ، المملكة المتحدة. يتبع هذا البروتوكول إرشادات رعاية لمؤسساتنا.

1. ثقافات الزرع

تحضير النباتات من فروة رأس أرجل البقر
1. قم بإعداد واقي ماص ومشرط جراحي قياسي بشفرة مشرط # 10.
2. رش جميع المواد بمحلول الإيثانول بنسبة 70٪.
3. انقع ساق الأبقار (ذكور الأبقار البالغ من العمر 7 أيام تم الحصول عليها من المسلخ بموافقة بيطرية) بالماء لإزالة كل الدم والطين.
4. نظف الساق بالصابون وافركه بفرشاة.
5. عندما تكون نظيفة بشكل كاف ، رش الساق بنسبة 70٪ من الإيثانول.
6. ضعه على ورق ماص.
7. قطع حول القدمين بمشرط.
8. تتبع خطا دقيقا على طول الساق.
9. توخي الحذر الشديد في منطقة المفصل.
10. قم بإزالة جلد الساق بعناية على طول خط المشرط الطولي.
11. ضع النفايات (الجلد والمناديل المستعملة والورق والقفازات) في كيس نفايات سريري.
12. نظف / نظف الساق بالصابون وعقمها بالإيثانول مرة أخرى عند إزالة الجلد.
13. لا تتلف المنطقة القريبة من تجويف المفصل. إذا تم فتح التجويف أو تلفه بسبب تسرب الدم ، فلن يكون معقما بعد الآن ولا يمكن استخدام الساق.
14. ضع الساق في ورق القصدير الذي تم رشه بنسبة 70٪ من الإيثانول.
15. ضع قفازات اللاتكس ذات الحجم المناسب على أطراف الساق لمنع خروج الدم من الطرف القريب أو التلوث المحتمل من الحافر.
16. التخلص من النفايات بالطريقة المناسبة وفقا للقواعد المؤسسية.
استخراج النباتات واستزراعها
ملاحظة: يجب الحصول على المخططات من الجزء الداخلي للمفصل (الشكل 2، مرحلتان أوليتان). لكي تكون ذات ظروف قابلة للمقارنة ، يجب تثقيب أربعة (أو ستة) ممارسات من نفس المنطقة من أجل تطبيق المعالجات الأربعة (أو الستة) المختلفة على عينات تمتلك نفس الشكل والخصائص تقريبا.
1. افتح شفاط التدفق الرقائقي قبل 25 دقيقة من الاستخدام ، ونظفه بالكحول بنسبة 70٪.
2. ضع وسط الثقافة للتدفئة في حمام مائي.
3. قم بإعداد طبق 24 بئرا مع 1.5 مل من الوسط الأساسي ، DMEM-F12 فقط (وسط الغسيل) في كل بئر.
4. قم بإعداد طبق بئر آخر بسعة 1.5 مل من وسط الثقافة الكامل. يحفظ في حاضنة الاستزراع على حرارة 37 درجة مئوية حتى الاستخدام
5. قم بإعداد المادة على الرف: أنبوب عالمي واحد يحتوي على 70٪ إيثانول وأنبوب عالمي آخر مع وسيط غسيل.
6. قم بإعداد مشرط وخزعة 4 أو 6 مم (توضع في أنبوب عالمي للكحول).
7. ضع الأنابيب والمواد تحت الغطاء.
8. ضع واقيا ماصا مرشوشة بنسبة 70٪ من الإيثانول تحت الغطاء.
9. تحضير بعض المناديل المرشوشة بالإيثانول بنسبة 70٪.
10. خذ طبق تشريح ، وقم بتغطيته بورق الألمنيوم.
11. أخرج نفس الأقدام المعدة مسبقا من الثلاجة (4 درجات مئوية) ورشها بنسبة 70٪ من الإيثانول.
12. تخلص من الأكياس الخطرة والسريرية بالقرب من غطاء المحرك لتعقيم النفايات لاحقا.
13. رش القدم بنسبة 70٪ من الإيثانول.
14. حرك المفصل للعثور على خط الوسط للمفصل حيث يجب إجراء الشق. افعل هذا تحت الغطاء.
15. خذ المشرط المعقم.
16. قطع بعناية على طول خط الوسط باتباع محيط حواف المفصل. لا تلمس غضروف اللقمة الإنسي للمفصل metacarpophalangeal.
17. قطع الرباط بعناية عند فتح المفصل.
18. تخلص من الجزء السفلي من القدمين في كيس الأوتوكلاف.
19. قم بإزالة جميع الأنسجة الأخرى لفضح كل غضروف المفصل (الشكل 2).
  ملاحظة: احرص على عدم لمس أي شيء بالقدمين.
20. ضع المشرط وخزعة الخزعة في الكحول ثم في وسط الغسيل.
21. اصنع بعض الدوائر بهذه اللكمة (4-5 لكل وجه) ببعض القوة على طول الوجوه الداخلية للعظام.
22. ضع الثقب الحيوي في الكحول عند الانتهاء لتنظيفه.
23. خذ مشرطا واقطع (تتبع خطا) بين كل دائرة وعلى طول الخط المركزي للعظم.
24. لإخراج نبتة الغضروف ، قم بقطع عموديا على أحد حدود خزعة الدائرة ، ثم قم بقصها أفقيا على العظم تحت الغضروف بعناية فائقة.
25. لإزالة نبتة الغضروف المقطوعة أفقيا أسفل خط الثقب على طول العظم تحت الغضروف والغضاريف المتكلسة ، ستخرج المخططات.
  ملاحظة: يجب أن يكون للنباتات سمك موحد ، إن أمكن.
26. ضع النبتة في طبق البئر المملوء ب 1.5 مل من وسط الغسيل.
  ملاحظة: قم دائما بإجراء التحكم التجريبي والمعالجة للنباتات الخارجية القادمة من نفس الموقع في المفصل.
27. تأكد من أن المصنع موجه بشكل صحيح. يجب أن يكون سطح المصنع متجها لأعلى ويجب أن يواجه الجزء العظمي تحت الغضروف من الخارج الجزء السفلي من لوحة البئر.
28. احتفظ بلوحة البئر مغلقة بين كل خزعة.
29. قم بإزالة وسط الغسيل.
30. يغسل مرة أخرى بوسط الغسيل. اتركيه في وسط غسيل لمدة 2-3 ساعات. بقايا العظام ، سيكون للدم وقت للتدفق في الوسط.
31. انقل النباتات الخارجية في صفيحة بئر جديدة تحتوي على وسط الاستزراع الكامل. كن حذرا: لا تلمس أي شيء بالماصة.
32. تأكد من أن النباتات المسببة لا تزال في الموضع الصحيح (العظم يواجه الجزء السفلي من لوحة البئر).
33. نظف كل شيء وتخلص من النفايات السريرية في مكان مناسب.
34. بمجرد وضع المكثفات في مزرعة في حاضنة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2} ، قم بتغيير وسط زراعة الزرع كل يومين بوسط دافئ طازج للحفاظ على الاحتياجات المتنوعة للخلايا / الأنسجة. تأكد من أن النباتات المسببة لا تزال في الموضع الصحيح (العظم يواجه الجزء السفلي من لوحة البئر).
تثبيت العينة (اختياري)
ملاحظة: قم بتنفيذ هذه الخطوة بعد نهاية زراعة الخلية فقط مما يعني بعد 3 أسابيع من الزراعة. ثم وصلت المخططات إلى مرحلة النضج.
1. اغسل النباتات الخارجية باستخدام DMEM-F12 بماصة أسفل غطاء زراعة الأنسجة.
2. اغسل النباتات الخارجية مرتين باستخدام PBS باستخدام ماصة أسفل غطاء زراعة الأنسجة.
3. قم بإصلاحها طوال الليل عند 4 درجات مئوية عن طريق النقع في 10٪ NBFS (محلول ملحي حايد للفورمالين).
4. ضع المزاعم الثابتة في PBS في أنبوب الطرد المركزي الدقيق
5. قم بتخزين النباتات المكثفة عند 4 درجات مئوية. يمكن أن تبقى المنشأات الثابتة في هذه الظروف لمدة تصل إلى 6 أشهر.

2. تحضير العينة لجلسة التصوير

استخدم أطراف بلاستيكية مخروطية بحجم مناسب (عادة 1 مل) فيما يتعلق بالعينة ومجال رؤية الكاميرا.
أغلق الطرف المخروطي (عن طريق تسخينه باللهب) من أجل الحصول على حاوية عينة مقاومة للماء.
املأ الطرف ببرنامج تلفزيوني. امسك العينة بالملاقط وأدخلها في الأنبوب. قم بإزالة فقاعة الهواء عن طريق الاهتزاز البطيء.
قم بتركيب الأنبوب على مرحلة التصوير المقطعي وقم بمحاذاة ذلك عن طريق أخذ صور شعاعية بسيطة.

3. جلسة تصوير تباين مرحلة الأشعة السينية

ضع الكاشف على بعد 2.5 متر من العينة
اضبط طاقة فوتون الأشعة السينية على 17 كيلو فولت باستخدام نظام بلوري سيليكون مزدوج داخل هندسة براغ براج.
يتكون كاشف Mount Imaging من كاميرا CMOS علمية²² على بصرية بحجم فوكسل متناحي الناتج يبلغ 3.5 ميكرومتر في الصورة ثلاثية الأبعاد.
استخدم شاشة وميض أوكسي كبريتيد الجادولينيوم بسمك 60 ميكرومتر لتحويل الأشعة السينية إلى ضوء مرئي
جمع البيانات: الحصول على 2000 إسقاطات أثناء مسح العينة بزاوية 360 درجة مع وقت تعرض يبلغ 2 ثانية لكل إسقاط.
استخدم خوارزمية استرجاع الطور لاستخراج إشارة الطور كما هو موضح في المرجع ²³. تستخدم الخوارزمية معرفة مسبقة بتوزيع معامل الانكسار المعقد داخل العينة. الفرضية الرئيسية ، التي لم يتم التحقق منها هنا ، هي أن هناك مادة واحدة لإعادة بنائها. في هذه الحالة بالذات ، تم تعيين النسبة بين الانكسار ومؤشر الامتصاص إلى 1,200 والتي لوحظت تجريبيا كأفضل حل وسط لتصور العظام والغضاريف.
استخدم خوارزمية إعادة بناء التصوير المقطعي المحوسب القياسية للإسقاط الخلفي المصفى باستخدام تطبيق مفتوح المصدر قائم على وحدة معالجة الرسومات (GPU) لكود PyHST2²⁴.

النتائج

تم استخدام إعداد تصوير بسيط قائم على الانتشار²⁵ كما هو موضح في الشكل 3. في التصوير القائم على انتشار السنكروترون ، يضيء شعاع الأشعة السينية المتماسك الجسم ، مما يؤدي إلى تحولات طور متغيرة^{مكانيا 19}. عندما ينتشر شعاع الأشعة السينية ?...

Discussion

قدمنا دراسة كاملة من إعداد العينة إلى تصور الصورة ، بما في ذلك بروتوكولات الحصول على البيانات ، لدراسة الغضروف المفصلي سريع النضج في المختبر . أظهرت نتائج جلسة تصوير السنكروترون جودة النموذج.

في النموذج المقدم هنا ، يجب ذكر بعض الملاحظات والحدود. يحد?...

Disclosures

اي.

Acknowledgements

يشكر المؤلفون ESRF على توفير وقت البث في المنزل. يود المؤلفون أن يشكروا إريك زيجلر على المناقشات العلمية. أجريت تجربة PCI الموصوفة في خط الشعاع BM05 التابع لمرفق إشعاع السنكروترون الأوروبي (ESRF) ، غرونوبل ، فرنسا. تشكر CB Explora'doc Auvergne Rhone Alpes والمنح الدراسية من جامعة سوانسي وجامعة غرونوبل ألب لتمويل جزء من هذه الدراسة.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Material : Biological products
DMEM/F-12 (1:1) (1X) + GlutaMAX Dulbecco's Modified Eagle Medium F-12 Nutriment Mixture (Ham) 500mL	Gibco by life technologies	31331-028
Gentamicin Reagent Solution, 50 mg/mL	Gibco by life technologies	15750-060
HEPES, special preparation, 1M, pH 7.5 filtered	Sigma	H-3375
ITS, Insulin-Transferrin-Selenium	Gibco by life technologies	51500-057
L-Ascorbic Acid-2-Phosphate, sesquimagnesium salf hydrate, 95%	Sigma	A8960-5G
Neutral Buffer Formalin (NBF)	Sigma Aldrich	HT501128
phosphate buffered saline (PBS) pH 7.4	Gibco by life technologies	10010023

Culture equipments:
Absordent Protector,Benchkote	WhatmanTM	Cat No. 2300731,	Polysterene Backed, 460cm*50m
Accurpette VWR
Autoclavable Disposal Bag			For disposal of contamined plastic laboratory ware neck should be left open to allow penetration of steam, Hazardous Waste, STERILIN (white bag)
biopsy punches	MILTEX by KAI	ref 33-36	4 & 6 mm diameter
Clinical waste for alternative treatment Medium Duty			(UN-approved weight 5kg, Un-closure methods, UN- SH4/Y5/S/II/GB/4/06 (orange bag)
Eppendorf tubes			0.5mL and 1.5 mL
Falcon tubes			15mL and 50 mL
free of detectable RNase, DNase, DNA&Pyrogens 1000ul Bevelled Graduated, filter tip	Starlab, TipOne (sterile)	S1122-1830
free of detectable RNase, DNase, DNA&Pyrogens 20µl Bevelled Graduated, filter tip	Starlab, TipOne (sterile)	S1120-1810
free of detectable RNase, DNase, DNA&Pyrogens 200ul Bevelled Graduated, filter tip	Starlab, TipOne (sterile)	S1110-1810
Incubator			Incubator at 37°C, humidified atmosphere with 5% CO2
Optical microscope
Pipette-boy			25mL-, 10mL-, and 5mL sterile plastic-pipettes
Pipettes (25-10-5 ml)	CellStar, Greiner Bio-one
Plastic tweezers	Oxford Instrument	AGT 5230
Scalpel
Tips			P1000, P200 and P10 with P1000, P200 and P10 tips (sterile)
Tissue culture hood
Vacuum pump
Water bath 37°C
well plates			12 & 24 well plates
Protection equipment:
face shield
gloves
lab coat
safety goggles

Data acquisition equipment:
Fiji software			open source Software
PyHST reconstruction toolkit			open source Software

References

Little, C. B., Ghosh, P. Variation in proteoglycan metabolism by articular chondrocytes in different joint regions is determined by post-natal mechanical loading. Osteoarthritis and Cartilage. 5 (1), 49-62 (1997).
Khan, I. M., et al. Fibroblast growth factor 2 and transforming growth factor β1 induce precocious maturation of articular cartilage. Arthritis and Rheumatology. 63 (11), 3417-3427 (2011).
Khan, I. M., et al. In vitro growth factor-induced bio engineering of mature articular cartilage. Biomaterials. 34 (5), 1478-1487 (2013).
McNulty, A. L., Vail, T. P., Kraus, V. B. Chondrocyte transport and concentration of ascorbic acid is mediated by SVCT2. Biochimica et Biophysica Acta - Biomembrane. 1712 (2), 212-221 (2005).
Clark, A. G., Rohrbaugh, A. L., Otterness, I., Kraus, V. B. The effects of ascorbic acid on cartilage metabolism in guinea pig articular cartilage explants. Matrix Biology. 21 (2), 175-184 (2002).
Liu, X., et al. Role of insulin-transferrin-selenium in auricular chondrocyte proliferation and engineered cartilage formation in Vitro. International Journal of Molecular Sciences. 15 (1), 1525-1537 (2014).
French, M. M., Athanasiou, K. A., Ashammakhi, N., Ferretti, P. Differentiation Factors and Articular Cartilage Regeneration. Topics in Tissue Engineering. , (2003).
Zhang, Y., et al. Platelet-rich plasma induces post-natal maturation of immature articular cartilage and correlates with LOXL1 activation. Science Reports. 7 (1), 3699 (2017).
Schepman, K., Engelbert, R. H. H., Visser, M. M., Yu, C., De Vos, R. Kashin Beck Disease: More than just osteoarthrosis - A cross-sectional study regarding the influence of body function-structures and activities on level of participation. International Orthopedics. 35 (5), 767-776 (2011).
Sudre, P., Mathieu, F. Kashin-Beck disease: From etiology to prevention or from prevention to etiology. International Orthopedics. 25 (3), 175-179 (2001).
Allander, E. Kashin-Beck Disease. An analysis of Research and public health activities based on a bibliography 1849-1992. Scandinavian Journal of Rheumatology. 23 (99), 1-36 (1994).
Bissardon, C., et al. Sub-ppm level high energy resolution fluorescence detected X-ray absorption spectroscopy of selenium in articular cartilage. Analyst. 144 (11), (2019).
. Role of Selenium in Articular Cartilage Metabolism, Growth and Maturation Available from: https://tel.archives-ouvertes.fr/tel-01942169 (2020)
Bissardon, C., Charlet, L., Bohic, S., Khan, I. Role of the selenium in articular cartilage metabolism, growth, and maturation. Global Advances in Selenium Research from Theory to Application - Proceedings of the 4th International Conference on Selenium in the Environment and Human Health, 2015. , (2016).
Winkel, L. H. E., et al. Environmental selenium research: From microscopic processes to global understanding. Environment Science Technology. 46 (2), 571-579 (2012).
Bravin, A., Coan, P., Suortti, P. X-ray phase-contrast imaging: From pre-clinical applications towards clinics. Physics in Medicine and Biology. 87 (1034), 20130606 (2014).
Horng, A., et al. Cartilage and soft tissue imaging using X-rays: Propagation-based phase-contrast computed tomography of the Human Knee in comparison with clinical imaging techniques and histology. Investigative Radiology. 49 (9), 627-634 (2014).
Labriet, H., et al. High-Resolution X-Ray Phase Contrast Imaging of Maturating Cartilage. Microscopy and Microanalysis. 24, 382-383 (2018).
Rougé-Labriet, H., et al. X-ray Phase Contrast osteo-articular imaging: a pilot study on cadaveric human hands. Science Reports. 10 (1911), 41598 (2020).
Mittone, A., et al. Characterization of a sCMOS-based high-resolution imaging system. Journal of Synchrotron Radiation. 24 (6), 1226-1236 (2017).
Paganin, D., Mayo, S. C., Gureyev, T. E., Miller, P. R., Wilkins, S. W. Simultaneous phase and amplitude extraction from a single defocused image of a homogeneous object. Journal of Microscopy. 206 (1), 33-40 (2002).
Mirone, A., Brun, E., Gouillart, E., Tafforeau, P., Kieffer, J. The PyHST2 hybrid distributed code for high speed tomographic reconstruction with iterative reconstruction and a priori knowledge capabilities. Nuclear Instruments and Methods in Physics Research Section B: Beam Interactions with Materials and Atoms. 324, 41-48 (2014).
Bravin, A., Coan, P., Suortti, P. X-ray phase-contrast imaging: from pre-clinical applications towards clinics. Physics in Medicine and Biology. 58 (1), 1-35 (2013).
Vo, N. T., Atwood, R. C., Drakopoulos, M. Superior techniques for eliminating ring artifacts in X-ray micro-tomography. Optic Express. 26 (22), 28396 (2018).
Moo, E. K., Osman, N. A. A., Pingguan-Murphy, B. The metabolic dynamics of cartilage explants over a long-term culture period. Clinics. 66 (8), 1431-1436 (2011).
Stender, M. E., et al. Integrating qPLM and biomechanical test data with an anisotropic fiber distribution model and predictions of TGF-β1 and IGF-1 regulation of articular cartilage fiber modulus. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 12 (6), 1073-1088 (2013).
Labriet, H., Bosmans, H., Chen, G. H., Gilat Schmidt, T., et al. 3D histopathology speckle phase contrast imaging: from synchrotron to conventional sources. Medical Imaging 2019: Physics of Medical Imaging. , (2019).
Zdora, M. C., et al. X-ray Phase-Contrast Imaging and Metrology through Unified Modulated Pattern Analysis. Physics Review Letters. 118 (20), 203903 (2017).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

PCI

This article has been published

Video Coming Soon

Keep me updated: