이 연구는 인간 세포에 후성유전체 편집기를 설계하고 전달하는 것을 목표로 합니다. 당사는 독성 DNA 절단을 도입하지 않고 표적 유전자 조절을 위해 염색질 효과기를 dCas9에 융합하여 이를 수행합니다. 문제는 후성유전체 편집기를 세포에 효율적으로 전달하고 정확한 표적 특이성을 보장하는 것입니다.
또한 안정적이거나 일시적인 유전자 억제를 달성하는 것은 여전히 어렵습니다. 이 프로토콜은 절단 메커니즘을 피하여 독성과 게놈 불안정성을 줄입니다. 이는 영구적인 DNA 염기서열 변형 없이 제어된 유전자 발현 조절을 위한 두 가지 전달 방법을 설명합니다.
이러한 방법은 dCas9에 대한 다양한 융합을 테스트하고 기본 염색질 생물학을 연구하는 데 적용할 수 있습니다. 현재의 후성유전체 편집기는 게놈 전체 스크리닝에 사용할 수 있으며 치료 응용 분야에 대한 잠재력을 가지고 있습니다. 먼저 10% FBS와 페니실린 스트렙토마이신 글루타민이 보충된 RPMI 배지가 있는 플라스크에 K-562 세포를 유지합니다.
핵 절제 당일, 멸균 RNAse가 없는 마이크로 원심분리기 튜브에서 CRISPRoff mRNA를 해동하고 튜브를 부드럽게 와류로 회전시킵니다. 얼음 위에 놓인 PCR 스트립 튜브의 각 웰에 있는 5개의 세포의 거듭제곱에 2.0 곱하기 10당 2마이크로그램의 mRNA를 사용합니다. 제조업체의 지침에 따라 핵 펙션 용액을 준비하고 핵 펙션 전에 15분 동안 실온으로 데우십시오.
트리판 블루 생염색(trypan blue live/dead staining)이 있는 자동 세포 계수기를 사용하여 K-562 세포를 수확하고 계수합니다. 스트립 큐벳에서 핵 절제의 경우, 샘플당 5개 세포의 거듭제곱의 약 2배를 10의 곱한 부분 표본을 멸균 마이크로 원심분리 튜브에 넣습니다. 실온에서 500G으로 5분 동안 세포를 원심분리합니다.
상등액을 버리십시오. 실온 PBS를 세포 펠릿에 넣고 500G에서 5분 동안 다시 원심분리합니다. 상등액을 버리십시오.
적절한 양의 핵 펙터 용액에 세포를 재현탁시킵니다. 계산된 부피의 세포 용액을 2마이크로그램의 CRISPRoff 용액에 추가합니다. 세포와 mRNA 용액을 큐벳으로 옮기고, 뉴클레오펙션 효율을 손상시킬 수 있으므로 기포가 형성되지 않도록 합니다.
뉴클레오큐벳을 부드럽게 두드려 세포를 바닥에 가라앉힙니다. 다음으로, 적절한 펄스 코드를 가진 4D-Nucleofector 시스템을 사용하여 세포를 핵 절단합니다. 펄스 코드는 다양한 세포 유형에 맞게 최적화해야 할 수 있습니다.
추가 최적화가 필요한 경우 제조업체에 문의하십시오. 핵 절제 후, 80 μl의 RPMI 배지를 Nucleocuvette의 사용된 각 웰에 첨가합니다. 세포 현탁액을 400마이크로리터의 예열된 RPMI 배지가 들어 있는 24웰 플레이트의 웰로 옮깁니다.
모든 유세포 분석 표준 또는 FSC 파일을 새 워크시트로 끌어다 놓아 FlowJo에 로드합니다. 모든 샘플을 클릭하여 게이트 만들기를 시작합니다. 해당 파일을 두 번 클릭하여 컨트롤 샘플을 엽니다.
polygon 툴을 사용하여 FSC-A 대 SSC-A 플롯에서 살아있는 세포에 대한 게이트를 만듭니다. 이제 모든 샘플 목록의 샘플 이름 아래에 라이브 셀 탭이 나타나야 합니다. 이 게이트를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 Copy Analysis to Group을 선택하여 이 게이트를 모든 샘플에 적용합니다.
살아있는 세포 게이트를 두 번 클릭하여 살아있는 세포만 선택합니다. 축을 FSC-H 대 FSC-A로 변경합니다. 단일 셀에 대해서만 게이트를 표시하는 다각형을 그립니다.
가이드 발현 세포를 게이트하려면 단일 셀 게이트를 두 번 클릭하여 단일 셀만 선택합니다. 축을 FSC-A와 PE-CF594-A로 변경합니다. polygon 도구를 사용하여 셀을 표현하는 안내선에 대한 게이트를 그립니다.
마지막 설정 게이트(단일 셀 또는 가이드 발현 셀)를 두 번 클릭합니다. 후성유전체 편집기가 청색 형광 단백질 또는 BFP 융합을 인코딩하는 플라스미드 transfection을 수행하는 경우, 2일차 샘플에 대한 BFP 양성 세포에 대한 게이트를 생성합니다. FSC-A에 대해 BB515-A를 플로팅하여 리포터 발현을 위한 게이트를 생성하여 GFP 음성 세포를 식별하고 게이트합니다.
그런 다음 이 게이트를 모든 샘플에 적용합니다. 게이트 설정을 완료한 후 상단 패널에서 테이블 편집기를 클릭합니다. BFP 양성 세포 및 GFP 음성 세포와 같은 분석을 위해 모집단을 드래그합니다.
테이블 편집기 패널에서 테이블 만들기를 클릭하고 정규화 계산을 위해 스프레드시트에 붙여넣기 전에 데이터를 복사합니다. 이제 다른 모든 샘플에서 대조군 샘플의 GFP negative와 같은 reporter negative cells의 수를 뺍니다. 이렇게 하면 기자의 배경 침묵이 수정됩니다.
transfection을 수행하는 경우, 각 값을 2일차에 측정된 BFP 양성 세포의 백분율로 나누어 모든 값을 BFP 양성 세포의 백분율로 정규화한 다음 100을 곱합니다. 이는 편집된 세포의 transfection efficiency normalized 값을 산출합니다. 데이터를 플로팅하여 후성유전체 편집 시간 경과에 따른 변화를 나타내는 선 그래프를 만듭니다.
모든 후성유전체 편집 실험의 경우, 표적 유전자좌의 변화가 후성유전체 편집기의 과발현 또는 비특이적 결합이 아닌 후성유전체 편집으로 인한 것인지 확인하기 위해 비표적 가이드 대조군이 권장됩니다. epigenome editor의 전달 방법을 고려하는 것이 중요합니다. 플라스미드 DNA 형질주입 또는 mRNA 핵 절제는 실험적 맥락을 고려하여 선호될 수 있습니다.
세포 유형, 실험 일정, 전달 판독 및 전달 효능에 대한 고려는 선호하는 전달 방법에 영향을 미칠 수 있습니다. transfection 후 2일 후에 높은 수준의 BFP를 발현하는 세포는 epigenome editor를 사용한 성공적인 transfection을 나타냅니다. CRISPRoff와 CRISPRi 모두 transfection 후 5일째에 유전자의 최대 침묵을 보여줍니다.
mRNA 핵 절제 실험에서 CRISPRoff를 사용한 핵 절제 후 3일째까지 강력한 유전자 침묵이 관찰됩니다.
