Lentiviral 벡터 플랫폼은 가장 인기있는 벡터 플랫폼에 비해 주요 이점이 있으며, 특히 더 큰 유전 삽입을 수용 할 수있는 렌티 바이러스 벡터의 능력 때문입니다. 따라서, 렌티바이러스 벡터는 CRISPR/Cas 도구의 납품을 포함하는 응용 프로그램에서 선택의 플랫폼이 될 것으로 보인다. 이 기술은 손상될 때 질병과 연관되는 알파-시뉴클레인 발현의 자연적인 조절 메커니즘을 모방합니다.
그것은 유전자 발현에 있는 강력한 변화 대 발현 수준의 미세 조정을 허용합니다. 나는 강력하게 스크리닝을 위해 여러 가이드 RNA를 사용하여이 또는 유사한 접근 방식을 검증하는 것이 좋습니다. 가이드 RNA 효능에는 큰 변동성이 있습니다.
그것을 결정하는 유일한 방법은 강력하고 포괄적 인 검사 및 검증이 있습니다. 개발된 시스템은 설치류 및 비인간 영장류를 포함한 동물 모델과 같은 다른 모델 시스템에 쉽게 적응할 수 있습니다. 이러한 후속 실험은 미래의 임상 연구를 위한 개념의 증거로 작용할 수 있었습니다.
절차를 시연하는 것은 이 프로젝트와 관련된 렌티바이러스 벡터 플라스미드를 만들기 위한 분자 복제 절차의 실행에 초점을 맞추고, 내 실험실의 선임 직원 인 Ekaterina Ilich 박사가 될 것입니다. 그녀는 또한 렌티바이러스 벡터 생산과 관련된 주요 단계를 시연할 것입니다. 또한 절차를 시연하는 것은 병리학적 관련 세포로 인간 iPS 세포의 분화에 초점을 맞춘 내 실험실에서 포스트 닥인 Lidia Tagliafierro 박사가 될 것입니다.
그녀는 synuclein intron1의 메틸화 프로파일을 평가하기 위해 에세이 의 설립에 중요한 단계를 시연 할 것입니다. Ahila Sriskanda, 인간 iPS 세포 유래 신경 전구 세포의 문화에 초점을 맞춘 내 실험실에 있는 직원. 먼저 벡터의 DNMT3A 부분을 증폭하여 D-Cas9-DNMT3A-GFP로부터 DNMT3A 촉매 도메인을 개발한다.
BamH1 제한 효소를 사용하여 DNMT3A 단편을 소화한 후. D-Cas9를 운반하는 수정된 PBK-301 벡터의 BamH1 부위로 클로트하고 직접 Sanger 시퀀싱에 의해 검증되며, 순수한 마이센 기자 유전자와 그 결과 플라스미드를 GFP 다이제스트 d-Cas9-DNMT3A-P2A 순수 마이센및 플라스미드FSC 1로 대체한다. 겔 정화 방법을 사용하여 벡터 조각을 정화합니다.
FSC-1로 PBK-201을 소화하여 인서트를 준비합니다. FSC 1 조각을 벡터로 복제하여 d-Cas9-DNMT3A-P2A-GFP를 만듭니다. 15센티미터 플레이트에 0.2%의 젤라틴을 코팅하고 10분 동안 기다립니다.
그런 다음 젤라틴을 흡인하고 고포도당 배지의 22.5 밀리리터와 이전에 배양된 HEK-293T 세포 현탁액의 2.5 밀리리터를 추가한다. 70~80%에 도달할 때까지 5%의 CO2로 37°C에서 플레이트를 배양합니다. 115센티미터 플레이트에 충분한 플라스미드 믹스를 준비하려면 원고에 기재된 4개의 플라스미드를 사용한다.
플라스미드와 동일한 15 밀리리터 튜브에 1개의 어금니 칼슘 염화물 312.5 마이크로 리터를 추가하고 멸균 이중 증류수를 사용하여 최종 부피를 1.25 밀리리터에 넣습니다. 부드럽게 두 개의 X BBM 솔루션의 1.25 밀리리터를 튜브에 현명하게 떨어뜨리면서 튜브에 떨어뜨립니다. 실온에서 30분 동안 배양하세요.
세포에서 배지를 흡인하고 혈청없이 갓 준비 된 높은 포도당 DMEM의 22.5 밀리리터를 추가합니다. 각 플레이트에 현명하게 떨어지는 형질 전환 혼합물의 2.5 밀리리터를 추가합니다. 플레이트를 소용돌이치고 37도에서 5%CO2로 5%의 CO2를 배양하여 배양 후 2~3시간 동안 플레이트당 2.5밀리리터의 세럼을 첨가하여 10%의 희석을 달성하고 5%CO2의 섭씨 37도에서 하룻밤 동안 배양합니다.
바이러스를 수확하기 위하여는 모든 전과 된 세포에서 상체를 수집하고 50 밀리리터 원추형 관에서 그(것)들을 당깁니다. 원심분리기는 400 내지 450g에서 실온에서 10분 동안 10분 간 원심분리기를 한 다음 0.45 마이크로미터 진공 필터 장치를 통해 상전자를 필터링합니다. 다음으로 원추형 극심분리관을 준비하여 자당그라데이션을 만듭니다.
각 튜브의 적어도 3/4를 채우는 각 초원심분리관 중 바이러스 성 상체를 동등하게 분배하여 필터링된 상체를 그라데이션에 신중하게 추가합니다. 17°C에서 2시간 동안 70000g의 샘플을 원심분리합니다. 30%에서 60%의 자당 분획을 깨끗한 튜브에 부드럽게 수집하여 감기 1X PBS를 최대 100밀리리터까지 추가하고 파이펫을 여러 번 섞습니다.
각 튜브에 1X PBS에 20%의 자당 4밀리리터를 조심스럽게 추가하여 각 튜브당 바이러스 용액의 약 20~25밀리리터를 파이프팅하여 바이러스 제제를 계속 계층화합니다. 튜브와 원심분리기의 균형을 70000g에서 섭씨 17도에서 2시간 동안 조심스럽게 균형을 잡을 수 있습니다. 나머지 액체를 조심스럽게 흡인하여 작은 반투명 반점으로 거의 보이지 않는 펠릿을 함유한 바이러스를 완전히 제거합니다.
상체를 비우고 남은 액체가 배수되도록 종이 타월에 튜브를 반전시면 됩니다. 첫 번째 튜브에 1X PBS 70 마이크로 리터를 추가하고 철저하게 파이펫을 추가하여 펠릿을 다시 중단합니다. 서스펜션을 다음 튜브로 옮기고 모든 펠릿이 다시 중단될 때까지 파이펫팅 및 이송으로 반복합니다.
첫 번째 튜브에 1X PBS의 50 마이크로 리터를 추가하고 혼합하여 세척합니다. 그런 다음 서스펜션을 제2 튜브로 이송하여 세척하고 이전과 같이 계속하여 약간 유백색 최종 서스펜션의 약 120 마이크로 리터를 산출합니다. 10000g에서 60초 동안 10000g의 원심분리기는 새로운 튜브로 상류제를 투명하게 전송하여 5마이크로 리터 알리쿼트로 만들고 마이너스 80도에 저장하여 MD NPC를 37도의 섭씨 열 블록으로 2분 동안 냉동 된 세포를 15 밀리리터 원전 튜브로 전송합니다.
원심 분리기 300g에서 5분간. 슈퍼네티드를 흡인시키고 전동 된 완전한 N2B2 배지의 두 밀리리터에서 세포를 다시 중단합니다. N2B27의 밀리리터 2개를 세포 현탁액에 넣고 이전에 준비된 BMM 코딩 된 6 개의 웰 플레이트의 각 웰에 2 밀리리터의 셀을 플레이트.
하룻밤 사이에 5%의 CO2로 37°C에서 세포를 배양합니다. MD NPC가 70%의 합류에 있을 때, 렌티바이러스 가이드 RNA d-Cas9-DNMT3A 벡터의 2개의 마이크로 리터를 추가하여 그들을 변환하고 부드럽게 플레이트를 소용돌이시다. 16시간 동안 이전과 동일한 조건에서 세포를 배양한 후 N2B27 배지를 트랜스포팅 후 48시간 교체한다.
N2B27을 순수 마이센 밀리리터당 5마이크로그램으로 추가하여 안정적인 MD NPC 라인을 확보하고, N2B27과 순수 마이센에서 3주 동안 세포를 성장하여 SNCA 인트론 1의 메틸화 프로파일을 특성화한다. 먼저 DNA 추출 키트를 사용하여 각 안정적인 트랜스듀서 세포주에서 DNA를 추출한 다음 800나노그램의 DNA를 사용하여 시판되는 키트로 양성환변환을 수행한 다음, 이설화증이 마이크로 리터당 20나노그램으로 DNA를 변환한 후 양성화증을 변환합니다. 파이로 시퀀싱 분석을 위해 핵 자유 튜브에서 PCR 마스터 믹스를 준비하여 반응 플레이트를 열 사이클러로 옮기고 PCR을 시작합니다.
아가로즈 젤 전기포에 이어 30및 브로마이드 염색을 통해 PCR 제품의 2마이크로 리터를 사용하여 앰플리컨을 시각화합니다. 파이로 시퀀싱 분석법의 경우, 원고에 설명된 바와 같이 황화물 변환DN및 파이로 시퀀싱 시약에 의해 메틸화되지 않은 혼합물을 사용했다. 렌티바이러스 d-Cas9-DMMT3A-GFP 벡터및 이 프로토콜을 사용하여 생성된 순진한 GFP 벡터의 파이로 시퀀싱 소프트웨어 물리적 수율을 사용하여 각 CPG 사이트에 대한 메틸화 값을 계산하는 것은 비슷하다.
이는 최적화된 벡터 백본과 최적화된 생산 프로토콜의 유용성이 렌티바이러스 d-Cas9-DNMT3 GFP 벡터의 CRISPR-dCas9 벡터 의 고수율 더 타이트한 결과 CRISPR d-Cas9-RNA의 포장 효율이 감소했음을 시사하는 순진한 GFP 벡터보다 4배 낮았다는 것을 시사한다. 순진한 PURO 벡터의 트랜스유도율은 d-Cas9-DNMT3A 벡터에 비해 5배 높았다. 이러한 결과는 순진한 GFP 및 D-Cas9-DNMT3A-GFP를 사용하여 더 확인되었다.
여기에 설명된 EB 기반 프로토콜은 MD NPC의 분화를 허용합니다. 7개의 파이로 시퀀싱 분석서는 SNCA 인트론 1에서 메틸화 상태의 정량화를 위해 설계 및 검증되었다.
모든 7개의 분석이 검증되고 선형 상관관계를 보였으며, 검증된 분석서를 사용하여 SNCA intron 1에서 23개의 CPG에서 메틸화 수준을 결정할 수 있었으며, 이 절차에 참석하는 것보다 기억해야 할 가장 중요한 것은 실험 전반에 걸쳐 일관성을 보장하기 위해 적절한 성장과 건강을 보여주는 세포와 함께 작업하는 것입니다. 이 프레젠테이션에서 강조 표시된 렌즈콩 벡터의 생산은 더 많은 양 또는 더 많은 농축 벡터를 생성하기 위해 쉽게 확장 될 수 있습니다 통합 부족 안티 바이러스의 생산에 채택 될 수있다. 이 기술은 나이 관련 또는 알츠하이머 병 및 관련 치매를 포함하여 생성 무질서에 유전자 de-regulation의 병원성 충격을 탐구하는 쪽을 포장할 수 있습니다.
여기에서 개발되는 렌즈콩 벡터의 장점은 감염성 렌즈콩 벡터가 유전자 치료 응용 프로그램을 위한 안전하고 신뢰할 수 있는 전달 플랫폼인 세포 주기에 최소한의 영향을 미치지 않는다는 것입니다.
