이 프로토콜은 CRISPR-Cas9를 사용하여 녹아웃 또는 녹아웃 라인을 만듭니다. 이 기술의 주요 장점은 초보 연구원을 위해 특히 따르는 것이 간단하고 효율적이라는 것입니다. 세포 통과의 경우, 2 분 동안 섭씨 37도에서 플레이트 당 0.25 %의 트립신 EDTA의 2 밀리리터로 하룻밤 배양 세포를 치료하십시오.
세포가 플레이트 바닥에서 들어 올릴 때, 세포 배양 배지의 2밀리리터로 효소 반응을 중화시키고, 세포 현탁액을 원내 튜브로 옮기다. 원심분리에 의해 세포를 수집하고 계산을 위한 신선한 세포 배양 배지의 5밀리리터에서 펠릿을 재중단합니다. 그런 다음 1.8배 10번을 5세포에 1.8배, 즉 24웰의 조직 배양판으로 1.8배, 이산화탄소는 5%로 하룻밤 문화를 갖는다.
세포의 배설을 위해, 실험 설계 및 제조업체의 지시에 따라, 검사 시약의 적절한 부피에 CRISPR 플라스미드의 적절한 농도를 포함하는 경질 혼합의 적절한 볼륨을 추가합니다. 권장 시간 동안 실온에서 형질 혼합을 배양 한 후 낙하 방식으로 세포에 용액을 추가하십시오. 그런 다음 접시를 부드럽게 소용돌이어 접시를 혼합하고 5 %의 이산화탄소와 가습 섭씨 37도 인큐베이터에 놓습니다.
형질 전환의 끝에서, 단지 입증 된 대로 세포를 해리하고 원심 분리에 의해 분리 된 세포를 수집하기 위해 트립신-EDTA의 150 마이크로 리터를 추가합니다. PBS에서 2% 태아 소 혈청에서 펠릿을 다시 중단하고 30 마이크로미터 메쉬 스트레이너를 통해 세포를 5밀리리터 형광 활성화 세포 선별 또는 FACS 튜브로 필터링합니다. 그런 다음 비-전염된 세포를 사용하여 유동 세포계상에 음수 조절 게이트를 설정하고 100 마이크로리터를 함유하는 튜브내형에 사용되는 CRISPR 플라스미드상형마커에 따라 전관된 세포를 분류한다.
모든 전감염된 세포가 수집되었을 때, 세포배양 배지의 300마이크로리터에서 원심분리에 의해 세포를 원심분리하여 펠릿을 재연한다. 24웰 조직 배양 판의 한 우물에 세포의 200 마이크로 리터를 종자 하 고 세포37 섭씨 인큐베이터에서 며칠 동안 복구 할 수 있도록. 펠릿 5 분 동안 최대 속도로 선별 된 세포의 나머지 100 마이크로 리터를 펠릿 과 표준 DNA 추출 프로토콜에 따라 결과 펠릿에서 게놈 DNA를 추출.
다음으로, 폴리머라제 연쇄 반응 완충제 10마이크로리터, 탈옥뉴클레오티드 믹스 1마이크로리터, 사용자 정의 역프라이머 2.5 마이크로리터, DNA 폴리머라제 0.5 마이크로리터, 추출된 게놈 DNA 템플릿의 2~5마이크로리터, 50마이크로리터의 최종 부피에 대한 반응을 가져올 수 있는 충분한 이중 증류수를 추가한다. 열 사이클러에 혼합물을 실행하고 표준 프로토콜에 따라 1X TAE 버퍼를 사용하여 2% 아가로즈 젤에 대한 반응을 해결한다. 깨끗하고 날카로운 메스를 사용하여 폴리머라제 체인 반응 생성물을 소비하고 제조업체의 지침에 따라 젤 추출 키트를 사용하여 DNA를 정화합니다.
260 나노미터 흡광도에서 분광계를 사용하여 제품의 농도를 측정합니다. 격리된 DNA의 200 나노그램, T7 의 마이크로리터 I 반응 버퍼, 19 마이크로리터에 혼합물의 최종 부피를 가져오기에 충분한 이중 증류수를 포함하는 분석 믹스를 준비한다. 폴리머라제 연쇄 반응 생성물을 표시된 파라미터에서 열 사이클러로 회수하고 T7 엔도니클로스 I의 5단위를 섭씨 37도에서 50분 동안 배양한 제품으로 혼합한다.
인큐베이션의 끝에서, 1X TAE 버퍼를 사용하여 2.5%의 아가로즈 젤로에서 소화된 DNA를 해결하고, 적절한 겔 이미징 시스템에서 겔을 이미지화한다. ImageJ에서 젤 이미지를 열고 밴드 주위에 사각형 상자를 가능한 한 경계에 가깝게 그립니다. 분석 및 측정 설정을 클릭하여 영역, 평균 회색 값 및 통합 밀도 옵션을 확인합니다.
확인을 클릭하고 분석 및 측정을 선택합니다. 평균 또는 원시 강도 밀도 값은 대역 강도를 나타냅니다. 배양-전염된 세포가 컨부유해지기 시작하면, 입증된 바와 같이 트립신-EDTA로 세포를 분리하고, 세포 배양배기로 세포를 되돌리기 전에 개별 식민지가 성장할 수 있도록 100mm 조직 배양 접시에서 세포를 희소하게 파종한다.
식민지가 형성되기 시작하면 4 X 배율의 현미경을 사용하여 4 개의 X 배율로 현미경을 사용하여 500 마이크로 리터의 세포 배양 배지를 포함하는 24 웰 플레이트의 개별 우물로 옮길 개별 식민지를 선택하십시오. 팁이 개별 우물 내에서 식민지의 혼합을 방지하기 위해 주변 식민지를 만지지 않도록주의하거나 희소 식민지 성장의 영역에서 선택. 모든 클론을 골랐을 때, 배양이 수렴될 때까지 세포 배양 인큐베이터에 접시를 놓습니다.
소화되지 않은 플라스미드는 매우 코일러이기 때문에 선형화된 플라스미드보다 빠르게 달리는 경향이 있습니다. 올리고뉴클레오티드가 CRISPR 플라스미드 백본으로 성공적으로 복제되었는지 확인하기 위해, 콜로니 PCR이 수행되고 플라스미드가 추출되기 전에 양성 클론이 접종되어 Sanger 시퀀싱을 위해 전송된다. 형광 신호는 플라스미드의 성공적인 납품시 현미경으로 쉽게 시각화될 수 있으며, 전감염된 세포는 유동 세포측정에 의해 정렬될 수 있게 한다.
A T7 엔도나크리스 I 분석은 아가로즈 겔상에서 관찰된 밴드의 강도로부터 계산된 바와 같이 게놈 DNA의 절단 효율을 확인하기 위해 수행된다. 또한, 상동성 지향 수리 기반 실험이 표적 궤적에 제한 부위를 통합하도록 설계된 경우, 제한 단편 길이 다형성 분석은 해당 제한 효소로 수행될 수 있다. 단백질 코딩 유전자가 성공적으로 비활성화되었음을 더욱 검증하기 위해, 표적 단백질이 존재하지 않도록 서양 얼룩을 수행할 수 있습니다.
이식 후 세포를 분류하면 통합 된 플라스미드없이 세포를 제거하여 나중에 선별 된 세포의 비율을 녹아웃 또는 녹아웃 유전자로 증가시합니다. 이 기술의 발달로, 우리는 지금 그들의 기계장치를 이해하기 위하여 특정 질병을 모델링하기 위하여 유전자 기능 및 노크에 세포주를 공부하기 위하여 녹아웃 세포주를 생성할 수 있습니다.
